miR-21、Caveolin-1、Gal-9在病毒性腦炎患者的表達及相關(guān)性研究

王 莎，賀 龍，程利萍，霍瑞民，廖子蔚，牛東生

(1.河北省邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，河北 邯鄲 056002；2.河北省邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)外三科，河北 邯鄲 056001；3.河北省邯鄲市第一醫(yī)院醫(yī)務科，河北 邯鄲 056002)

病毒性腦炎(viral meningitis，VM)是病毒感染引起的急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，病情輕重不一，輕者可自行緩解，重者往往遺留后遺癥[1-2]。VM復發(fā)是影響患者預后的主要因素，即便接受充分的抗病毒藥物治療，部分患者仍不可避免復發(fā)[3]。病毒感染繼發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫性炎性反應是VM復發(fā)的主要因素，微小核糖核酸21(micro ribonucleic acid-21，miR-21)在炎癥反應中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子產(chǎn)生促使或抑制炎癥反應，還可調(diào)節(jié)白細胞介素表達調(diào)控輔助性T細胞2分化，調(diào)節(jié)先天免疫細胞功能[4]。陷窩蛋白1(caveolin-1)是陷窩的標志性蛋白，通過調(diào)控多種細胞信號通路參與腦缺血后炎癥反應，與腦血管疾病密切相關(guān)[5]。半乳糖凝集素9(galectin-9，Gal-9)是免疫反應的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，通過誘導T細胞亞群細胞增殖或凋亡誘導自身免疫和炎癥反應[6]。miR-21、Caveolin-1、Gal-9在VM中表達水平的報道并不多見，本研究旨在探討miR-21、Caveolin-1、Gal-9與VM病情以及復發(fā)的關(guān)系，為臨床病情評估提供參考。報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選擇2019年1月—2021年2月河北省邯鄲市第一醫(yī)院收治的VM患者(VM組)132例。納入標準：①出現(xiàn)典型發(fā)熱、頭痛、腦膜刺激征等神經(jīng)精神癥狀，經(jīng)腦脊液病原菌培養(yǎng)鑒定為病毒感染，初次經(jīng)臨床診斷為VM，符合《VM患者的管理》中診斷標準[7]；②入組前未接受任何形式治療；③均接受抗病毒治療，臨床資料完整。排除標準：①其他病原菌引起的顱內(nèi)感染，比如細菌、寄生蟲、支原體等；②合并其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，比如：顱腦外傷、腦梗死、腦出血、既往癲癇等；③血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病；④隨訪失聯(lián)者。其中男性79例，女性53例，年齡31～57歲，平均(42.14±7.98)歲，體重指數(shù)21～24，平均23.24±0.64。感染病毒種類：皰疹病毒51例，腸道病毒39例，乙型腦炎病毒27例，腮腺炎病毒15例。根據(jù)病情將患者分為重癥組(58例)和輕癥組(74例)，重癥定義為急性起病、體溫高于40 ℃、昏迷或意識障礙、抽搐或驚厥、呼吸衰竭[8]。未達重癥標準為輕癥組。另外選擇同期我院收治的經(jīng)檢查證實無神經(jīng)系統(tǒng)損傷的患者136例作為對照組，均排除VM或細菌性腦炎、上呼吸道感染、肺炎、胃腸炎等感染性疾病，血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病以及術(shù)后、創(chuàng)傷、燒傷等。其中男性82例，女性54例，年齡33～59歲，平均(42.25±7.79)歲，體重指數(shù)21～25，平均23.85±0.77。2組患者性別、年齡、體重指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準通過，所有患者家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2實驗室檢測 所有患者分別于入院后24 h內(nèi)(治療前)、治療1個月(治療后)進行腰椎穿刺，采集腦脊液5 mL，置于離心管離心5 min(室溫，2 500 r/min，離心半徑10 cm)-20 ℃冷凍保存。TRIzol法(美國Invitrogen公司)提取總RNA，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Epicentre公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。CFX96實時熒光PCR儀(美國Bio-Rad)檢測miR-21表達，qRT-PCR流程：將2 μL cDNA樣品加入qRT-PCR反應體系，反應條件：50 ℃預變性2 min，97 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s;70 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)。引物由金唯智生物科技有限公司設(shè)計和合成，序列如下：miR-21上游：5′-AGCTGATGCGGCTAGCTAG-3′，下游：5′-CTGAGCGTTAAGCAAGCT-3′。GADPH上游引物:5′-TGACGTGCCGCCTGGAGAAAC-3′，下游引物:5′-CCGGGCATCGAAGGTGGAAGAG-3′。以GADPH為內(nèi)參，2-△△Ct計算miR-21相對表達量。山東霍爾德電子科技有限公司HED-SY96S酶標儀采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測Caveolin-1、Gal-9、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)水平，試劑盒購自美國R&D公司。

1.3資料收集和隨訪 收集患者熱程、最高體溫、治療、住院時間，所有患者出院后定期復查和隨訪3個月，以出現(xiàn)新的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征或現(xiàn)有癥狀惡化，腦脊液病原菌檢測提示病毒性感染復發(fā)。根據(jù)是否復發(fā)將VM患者分為復發(fā)組(26例)和無復發(fā)組(106例)。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用獨立樣本t檢驗和配對t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson法；影響VM復發(fā)的危險因素確定采用多因素Logistic回歸分析；繪制受試者工作特征(receiver-operating characteristic curve，ROC)分析miR-21、Caveolin-1、Gal-9預測VM復發(fā)的價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1治療前VM組和對照組腦脊液miR-21、Caveolin-1、Gal-9和炎性因子水平比較 治療前，VM組患者腦脊液miR-21表達、Caveolin-1、Gal-9、TNF-α、IL-6水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 治療前腦炎組和對照組腦脊液miR-21表達、Caveolin-1、Gal-9和炎性因子水平比較Table 1 Comparison of miR-21 expression, Caveolin-1, Gal-9 and inflammatory factor levels in cerebrospinal fluid between the encephalitis group and the control group before treatment

2.2治療前不同病情VM患者腦脊液miR-21、 Caveolin-1、Gal-9和炎性因子比較 治療前，重癥組患者腦脊液miR-21表達、Caveolin-1、Gal-9、TNF-α、IL-6水平均高于輕癥組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 治療前不同病情VM患者腦脊液miR-21、Caveolin-1、Gal-9和炎性因子水平比較Table 2 Comparison of miR-21, Caveolin-1, Gal-9 and inflammatory factor levels in cerebrospinal fluid of patients with different severities of VM before treatment

2.3miR-21、 Caveolin-1、Gal-9與炎性因子相關(guān)性分析 miR-21、 Caveolin-1、Gal-9水平均與TNF-α、IL-6呈正相關(guān)(P<0.05)，見表3。

2.4治療前后不同預后VM患者腦脊液miR-21、Caveolin-1、Gal-9和炎性因子比較 治療前和治療前后，復發(fā)組腦脊液miR-21表達、Caveolin-1、Gal-9、TNF-α、IL-6水平均高于無復發(fā)組，復發(fā)組和無復發(fā)組患者治療后腦脊液miR-21表達、Caveolin-1、Gal-9、TNF-α、IL-6水平低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表3 miR-21、 Caveolin-1、Gal-9與炎性因子相關(guān)性Table 3 Correlation between miR-21, Caveolin-1, Gal-9 and inflammatory factors

表4 治療前后不同預后VM患者腦脊液miR-21、Caveolin-1、Gal-9以和炎性因子比較Table 4 Comparison of miR-21, Caveolin-1, Gal-9 and inflammatory factors in cerebrospinal fluid of VM patients with different prognosis before and after treatment

2.5VM復發(fā)的影響因素分析 復發(fā)組皰疹病毒感染比例、重癥比例、熱程、最高體溫均高于無復發(fā)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，2組性別、年齡、體重、住院時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。以VM復發(fā)(否=0，是=1)為因變量，以感染病毒種類(其他=0，皰疹病毒=1)、熱程(連續(xù)變量)、病情嚴重程度(輕癥=0，重癥=1)、最高體溫(連續(xù)變量)、治療前后TNF-α(連續(xù)變量)、IL-6(連續(xù)變量)、miR-21(連續(xù)變量)、 Caveolin-1(連續(xù)變量)、Gal-9(連續(xù)變量)為自變量，進行多因素Logistic回歸分析,逐步法排除無關(guān)變量，最終結(jié)果顯示，治療后高TNF-α、miR-21、 Caveolin-1、Gal-9是VM復發(fā)的危險因素(P<0.05)，見表6。

表5 影響VM復發(fā)的單因素分析結(jié)果Table 5 Univariate analysis results of facors affecting VM recurrence

表6 影響VM復發(fā)的Logistic回歸方程Table 6 Logistic regression equation of factors affecting VM recurrence

2.6治療后miR-21、Caveolin-1、Gal-9預測VM復發(fā)的價值 治療后miR-21、Caveolin-1、Gal-9預測VM復發(fā)的截斷值為2.95、19.61 μg/L、15.12 μg/L，AUC為0.671、0.708、0.717，聯(lián)合miR-21、Caveolin-1、Gal-9預測VM復發(fā)的AUC為0.858，大于單獨miR-21、Caveolin-1、Gal-9(Z=2.612、2.625、2.241，P=0.009、0.009、0.025)，見表7和圖1。

表7 治療后miR-21、 Caveolin-1、Gal-9預測VM復發(fā)的效能Table 7 Efficacy of miR-21, Caveolin-1, and Gal-9 after treatment in predicting VM recurrence

圖1 miR-21、 Caveolin-1、Gal-9預測VM復發(fā)的ROC曲線圖

3 討 論

VM指病毒直接侵犯腦實質(zhì)而引起的以精神和意識障礙為突出表現(xiàn)的顱內(nèi)感染性疾病，可發(fā)生于任何時間和年齡段人群，發(fā)病前多有呼吸系統(tǒng)或胃腸系統(tǒng)感染病史，該病臨床癥狀較為復雜，病情嚴重程度因感染病毒種類而異[9]，部分患者治療后病毒可再次激活，侵犯中樞神經(jīng)導致復發(fā)，并有可能繼發(fā)自身免疫性腦炎，加重神經(jīng)功能損傷。

miR-21是小非編碼RNA家族中表達最為廣泛的成員之一，在多種生物學功能和疾病中起著至關(guān)重要的作用，包括生殖發(fā)育、惡性腫瘤、心血管疾病和炎癥疾病等[10]。miR-21是免疫炎癥反應的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，miR-21可上調(diào)酸肌醇3-激酶表達，抑制核組蛋白脫乙酰酶表達，抑制哮喘患者氣道高反應性[11]。miR-21與細菌或病毒感染也存在密切關(guān)系，miR-21在丙型肝炎病毒感染期間表達上調(diào)，并通過髓細胞分化因子88、白細胞介素1受體相關(guān)激酶1負向調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素α信號傳導，逃避免疫監(jiān)視系統(tǒng)，促使丙型肝炎病毒在體內(nèi)不斷復制[12]，miR-21在狂犬病毒感染后12 h表達增高，通過靶向抑制干擾素γ誘導蛋白10表達，促使狂犬病毒復制[13]，miR-21還可下調(diào)Toll樣受體2/1誘導的25-羥基維生素d3-1α-羥化酶基因和IL-1β表達，或間接上調(diào)IL-10，抑制維生素D依賴性抗菌肽環(huán)化腺苷酸和DEFB4A基因表達，導致對麻風病毒的抗菌活性下降[14]。本研究結(jié)果顯示，miR-21在VM患者腦脊液中表達上調(diào)，重癥組血清miR-21表達高于輕癥組，復發(fā)組血清miR-21表達高于無復發(fā)組，回歸分析結(jié)果證實，miR-21是VM復發(fā)的危險因素之一。以上結(jié)果說明，miR-21表達與VM病情以及治療后復發(fā)均有關(guān)，miR-21可作為VM復發(fā)的評估指標。可能的原因為miR-21通過調(diào)控炎癥反應加重VM病情和復發(fā)，本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-21與TNF-α、IL-6呈正相關(guān)，也驗證了這一推測。

Caveolin-1是一種相對分子質(zhì)量24 000的蛋白質(zhì)，是陷窩的主要成分，在陷窩形成過程中發(fā)揮重要作用，參與細胞內(nèi)吞、信號轉(zhuǎn)導、血管發(fā)生、膽固醇代謝等[15-16]。Caveolin-1異常可導致陷窩功能喪失，Caveolin-1表達異常與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、缺血缺氧性腦損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等疾病均有關(guān)[17]，Caveolin-1在病毒感染中也發(fā)揮重要作用，病毒通過小窩介導內(nèi)吞作用侵入宿主細胞，Caveolin-1功能異常可導致大量病毒侵入細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)大量復制和組裝，并釋放病毒顆粒，導致病毒感染性疾病發(fā)病，加重病毒感染[18-19]。本研究結(jié)果顯示，VM患者腦脊液中Caveolin-1水平明顯升高，重癥組Caveolin-1水平高于輕癥組，復發(fā)組腦脊液中Caveolin-1水平高于無復發(fā)組，提示Caveolin-1不僅與VM發(fā)病有關(guān)，與臨床治療后復發(fā)也存在密切關(guān)系。分析原因為Caveolin-1功能異常導致細胞內(nèi)吞機制障礙，促使病原菌入侵腦組織，導致病毒復制，加重病情。Caveolin-1參與調(diào)控氧化應激反應、神經(jīng)炎癥反應、髓鞘修復、神經(jīng)元突觸再生等病理生理過程，Caveolin-1可促使炎性細胞因子IL-1β和IL-6表達上調(diào)，加劇局部炎性反應[20]，促使神經(jīng)細胞凋亡，加重病情。

Gal-9是促炎介質(zhì)和細胞凋亡調(diào)節(jié)劑，廣泛分布于單核細胞、巨噬細胞、免疫細胞、成纖維細胞，參與細胞生長、凋亡、黏附、遷移以及免疫反應的各個階段[21]。Gal-9是含T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域的分子家族(Tims家族)成員黏蛋白結(jié)構(gòu)域的分子3(T cell immunoglobulin and mucin domain 3，TIM-3)的配體之一，Gal-9與TIM-3相互作用，通過Toll樣受體4信號通路參與神經(jīng)炎癥反應的潛在機制[22]。Gal-9與病毒感染亦存在密切關(guān)系，Gal-9與其受體TIM-3調(diào)節(jié)免疫反應信號轉(zhuǎn)導，已被證實在丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、單純皰疹病毒、流感病毒、登革熱病毒和人類免疫缺陷病毒等多種病毒靶細胞中表達增加，Gal-9表達增加促使病毒感染加重[23]。本研究結(jié)果顯示，VM患者腦脊液中Gal-9水平升高，Gal-9水平與VM病情嚴重程度以及復發(fā)均存在密切關(guān)系，分析可能與病毒介導的免疫反應過程密切相關(guān)，Gal-9表達上調(diào)可促使T細胞分化以及分泌大量促炎細胞因子，TIM-3與細胞黏附分子1結(jié)合誘導T細胞耐受和衰竭[24]，抑制免疫反應，加劇神經(jīng)炎癥反應，導致腦炎病毒復制和治療后復發(fā)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Gal-9表達上調(diào)與局部腦組織炎癥反應增加有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，治療后miR-21、Caveolin-1、Gal-9預測VM復發(fā)均具有一定價值，而聯(lián)合三項指標可提高預測效能，說明治療后聯(lián)合檢測miR-21、Caveolin-1、Gal-9更有助于預測患者復發(fā)，對臨床預后評估更具有指導意義。

綜上所述，VM患者腦脊液中miR-21表達、Caveolin-1、Gal-9水平明顯增加，miR-21、Caveolin-1、Gal-9可能通過誘導炎癥反應促使VM病情進展以及復發(fā)。聯(lián)合治療后miR-21、Caveolin-1、Gal-9可有效預測VM患者治療后復發(fā)。