HSF1、sMR、miR-758-3p在肝癌患者中的表達及與臨床病理特征的關系

趙國杰，楊宏偉，趙鵬飛

(1.河北省邯鄲市中心醫院普外二科，河北 邯鄲 056000；2.河北省邯鄲市中心醫院腫瘤一科，河北 邯鄲 056000；3.河北省邯鄲市第七醫院外四科，河北 邯鄲 056000)

肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是指發生于肝臟的惡性腫瘤，是臨床上常見的惡性腫瘤[1-2]，其發病率和病死率較高且呈逐漸上升趨勢[3]。HCC患者早期沒有明顯的臨床癥狀[4]，后期伴隨病情進展會出現腹痛、腹瀉、腹脹、嘔吐、消瘦等臨床癥狀[5-6]。HCC不僅會導致患者劇烈的疼痛，還可能會因其導致的食管靜脈曲張的破裂大出血而直接導致死亡，對人體危害大。因此，提高對HCC的診斷水平有助于疾病的預防和治療。近年來甲胎蛋白被廣泛應用于HCC的臨床檢測，但肝炎、肝硬化等疾病患者的甲胎蛋白也會出現異常表達，從而影響其用于HCC檢測的可信度[7]。熱休克轉錄因子1(heat shock transcription factor 1，HSF1)通過編碼蛋白質調控細胞內參基因的穩態促進蛋白質合成、細胞增殖和糖代謝，參與HCC發生發展[8]。可溶性甘露糖受體(soluble mannose receptor，sMR)是一種新型血清巨噬細胞激活的標志物，由甘露糖受體在細胞膜上裂解基質金屬蛋白酶形成，可以參與維持內穩態、識別病原、誘導細胞因子、抗原遞呈等過程[9]。研究表明，慢性病毒性肝炎患者血清sMR水平呈高表達并且與病情密切相關[10]。研究表明，miR-758-3p對癌細胞的增殖、遷移、侵襲具有抑制作用[11]。上述三種指標與HCC有著密切的聯系，而在國內暫未見三種指標聯合用于HCC診斷的報道，所以本研究旨在探討HCC患者HSF1、sMR、miR-758-3p水平變化并分析其與臨床病理特征的關系，為肝癌患者的臨床診斷與治療提供新思路。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2020年9月—2021年6月來我院進行手術治療的68例肝癌患者為試驗組，另取同時間段來我院就診的42例慢性肝炎患者為對照組。納入標準：① 68例肝癌患者均符合《原發性肝癌診療規范(2019 版)》標準[12]；②臨床基本資料完備。排除標準：①患有其他惡性腫瘤；②患有自身免疫系統疾病；③妊娠期及哺乳期患者；④患有血液系統疾病。2組性別、年齡、體重指數(body mass index,BMI)等臨床資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

本研究經醫院倫理委員會審批，患者知情同意并簽署知情同意書。

表1 兩組一般臨床資料比較Table 1 Comparison of general clinical data between two groups

1.2方法

1.2.1免疫組織化學檢測HSF1水平 手術中取肝癌患者癌組織制作切片，慢性肝炎患者取活檢組織只做切片，切片脫蠟，高壓熱修復抗原，去除內源性過氧化物酶，加一抗HSF1(1∶450)(生產廠家：賽默飛世爾科技公司，規格：100 μg)，4 ℃過夜，PBS(生產廠家：賽默飛世爾科技公司，規格：250 g)水洗，加二抗(生產廠家：賽默飛世爾科技公司，規格：250 μL)，37 ℃孵育30 min，顯色，蘇木精(生產廠家：賽默飛世爾科技公司，規格：500 mL)復染，1%鹽酸乙醇分化，脫水透明，中樹膠封固。陽性表達呈棕黃色或棕褐色顆粒。每例選6個視野計算(400倍)。根據細胞染色計分[13]：無色：0分；淡黃：1分；棕黃：2分；棕褐：3分。根據陽性細胞百分數：<5%：0分；5%～10%：1分；11%～50%：2分；51%～75%：3分；>75%：4分。二者相乘，<3為陰性，≥3為陽性。

1.2.2酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA )檢測血清sMR水平 抽取患者空腹靜脈血5 mL，以3 500 r/min的速度離心10 min，取上清存于-80 ℃冰箱。根據ELISA試劑盒說明書步驟操作。于450 nm處用酶標儀測量其吸光度值，制作標準曲線。

1.2.3RT-qPCR法檢測miR-758-3p表達水平 提取RNA，逆轉錄為cDNA，逆轉錄條件：65 ℃、10 min,37 ℃、60 min,85 ℃、5 min，所得c DNA保存于-20 ℃冰箱備用。cDNA擴增反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct相對定量法計算miR-758-3p相對U6的表達量，引物序列見表2。

表2 RT-qPCR引物序列Table 2 Primer sequences of RT-qPCR

1.3統計學方法 應用SPSS 23.0統計軟件分析數據。 數據滿足正態性分布，計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組研究對象HSF1表達情況比較 試驗組HSF1陽性率、血清sMR表達水平高于對照組，miR-758-3p表達水平低于對照組(P<0.05)；免疫組織化學結果顯示試驗組HSF1陽性表達率高于對照組(P<0.05)，見表3，圖1。

表3 兩組研究對象HSF1表達情況比較Table 3 Comparison of HSF1 expression between two groups

圖1 兩組研究對象HSF1陽性表達(免疫組織化學染色 ×400)

2.2HSF1、sMR、miR-758-3p表達水平在不同臨床病理特征組之間的比較 HSF1、sMR、miR-758-3p表達水平在有無淋巴結轉移組、有無微血管侵犯組、不同病理分期組、不同AFP水平組之間差異有統計學意義(P<0.05)；在不同性別、年齡、BMI組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

2.3HSF1、sMR、miR-758-3p診斷肝癌的價值分析 HSF1、sMR、miR-758-3p診斷肝癌的截斷值為1.500%，82.230 ng/L，0.845，曲線下面積為0.947，0.983，0.787，聯合HSF1、sMR、miR-758-3p診斷肝癌的曲線下面積為1.000，高于單獨診斷，見表5，圖2。

表4 HSF1、sMR、miR-758-3p表達水平與臨床病理特征的關系Table 4 Relationship between expression levels of HSF1, sMR and miR-758-3p and clinicopathological characteristics

表4 (續)

表5 HSF1、sMR、miR-758-3p診斷肝癌的效能分析Table 5 Efficacy analysis of HSF1, sMR and miR-758-3p in the diagnosis of hepatocellular carcinoma

圖2 HSF1、sMR、miR-758-3p診斷肝癌的ROC圖

3 討 論

肝癌的發病率和病死率都較高，現階段，在全球范圍內，每年大約有60萬人死于肝癌。由于肝癌患者早期癥狀不明顯，其診斷、治療及預后面臨著巨大的挑戰，所以找尋肝癌預測、診斷、治療的相關指標成為臨床研究的熱點[14-15]。HSF1是關鍵的調節控制熱休克蛋白表達的轉錄因子，由529個氨基酸組成[16]。HSF1通常以無活性單體形式存在于細胞質中，當受到溫度驟增、短時間內缺血、炎癥反應、氧化應激等刺激時，HSF1會被激活，轉化為三聚體，經過核膜到達細胞核，啟動下游靶基因轉錄，產生熱休克蛋白，參與細胞增殖凋亡等生物學行為[17]。癌癥的發生發展與HSF1密切相關，其可能在細胞的病變過程中被激活。相關研究表明，子宮內膜癌、乳腺癌、胃癌組織中HSF1呈現顯著的高表達[18]。研究中指出，M2型巨噬細胞參與癌細胞的血管生成、免疫抑制等，并且與癌細胞的增殖凋亡等密切相關，而甘露糖受體就為其細胞表面高表達CD206分子[19]。甘露糖受體與病原體的識別、吞噬、清除相關，sMR則由內源性細胞金屬蛋白酶對膜結合形式的MR水解切割釋放[20]。研究表明，肝炎患者血清sMR水平異常表達[21]。研究表明，miR-758-3p可通過靶向抑制MDM2和mTOR的表達降低肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，是肝癌治療的潛在分子靶點[22]。所以本研究旨在探討肝癌患者HSF1、sMR、miR-758-3p水平變化并分析其與臨床病理特征的關系，為肝癌患者的臨床診斷與治療提供新思路。

本研究通過免疫組織化學法檢測兩組HSF1表達情況，結果顯示，肝癌患者HSF1陽性表達顯著高與對照組，這與肖億等[22]在關于HSF1與肝癌組織中表達的研究中的實驗結果相一致。這提示HSF1表達情況與肝癌的發生有著一定的聯系，這可能與HSF1與凋亡信號通路中的關鍵蛋白和激酶互相作用一致腫瘤細胞凋亡有關[23-24]。本研究采用ELISA對兩組血清sMR水平進行檢測，結合研究結果與統計學分析結果可證實，肝癌患者血清中sMR的水平較慢性肝炎患者明顯升高，提示在肝癌患者中sMR高表達，這可能是sMR在多種癌癥中高表達，與癌細胞的轉移有關[25]。本研究又采用RT-qPCR檢測法來檢測兩組患者的miR-758-3p水平，分析結果與統計學結果發現，試驗組研究對象體內miR-758-3p水平較對照組研究對象顯著下降。

在本研究的最后分析了肝癌患者HSF1、sMR、miR-758-3p三個指標與性別、年齡、BMI等臨床病理特征之間的聯系，結果表明，HSF1、sMR、miR-758-3p表達水平與淋巴結轉移、微血管侵犯、病理分期、AFP相關，其中伴有淋巴結轉移、微血管侵犯、病理分期屬于Ⅲ期、AFP≥400 μg/L的患者HSF1陽性例數比例相對較多、血清sMR表達水平相對較高、miR-758-3p水平相對較低。臨床病理特征中淋巴結轉移、微血管侵犯、病理分期、AFP等指標的情況可分析患者的病情進展，而通過結果可知，隨著肝癌患者的病情進展，肝癌患者HSF1陽性表達增加，血清sMR表達水平增加，miR-758-3p表達水平降低，這對于疾病的嚴重程度及預后具有一定的預測價值。

本研究ROC分析結果顯示，HSF1、sMR、miR-758-3p聯合診斷肝癌的效能為1.000，高于單獨HSF1、sMR、miR-758-3p診斷，說明聯合檢測肝癌患者HSF1、sMR、miR-758-3p水平能為肝癌的診斷提供更為可靠的依據，有助于疾病預防、診斷和治療。

綜上所述，將HSF1、sMR、miR-758-3p應用于肝癌的早期診斷與治療中可發揮顯著的優勢。同時本研究也有部分不足，一方面是納入研究的病例較少且來源局限，這就需要擴大病例來源，增加病例數量進行深入探索；另一方面，試驗中存在不可避免地不可控因素，可能對試驗結果的可信度存在影響，還需臨床納入更多病例進行試驗以提高可信度并且實驗可以納入肝硬化、病毒性肝炎、脂肪肝等良性肝臟疾病人群與肝癌患者進行分析研究，為其應用于臨床提供更加全面的理論與實驗支持。