血清miR-210與新生兒呼吸窘迫綜合征嚴重程度和預后的關系

杜志云，史亦男，許海娟，李書秀*

(1.河北省秦皇島市第一醫院新生兒科，河北 秦皇島 066000；2.河北省秦皇島市第一醫院兒科ICU，河北 秦皇島 066000)

新生兒呼吸窘迫綜合征(neonatal respiratory distress syndrome，NRDS)是臨床常見的一種兒科疾病，主要由于缺乏肺泡表面活性物質所引起，致使肺泡進行性萎陷[1]，患兒出生46 h內出現進行性呼吸困難、發紺、吸氣等癥狀[2]，嚴重時會導致呼吸衰竭。研究指出，NRDS病因主要與肺表面活性物質合成分泌不足有直接關系，病情進展較快、病死率較高，胎齡越小、發病率越高，是威脅新生兒生命的危重癥之一[3]。NRDS的臨床診斷主要依靠一般病史、臨床表現以及影像學檢查結果，但由于新生兒的特殊性，實驗室檢查以及影像學檢查較為復雜，因此尋找一種準確、便捷的診斷方式對NRDS患兒具有重要意義。微小核糖核酸(mircoRNA，miRNA)是一種新型的基因調控因子，在急性NRDS發病過程中發揮重要作用[4]。近年來研究發現，miR-210在多種炎癥性肺疾病發生中表達水平出現變化，參與了多個信號通路以及免疫炎癥反應過程[5]。目前關于miR-210與NRDS相關性的研究較少。本研究通過檢測NRDS新生兒血清中miR-210血清水平，分析該血清表達與病情嚴重程度的相關性以及對預后的影響，為臨床提供參考依據。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 收集2017年1月—2020年12月我院收治的NRDS新生兒104例，男性57例，女性47例；胎齡27～41周，平均(32.24±1.05)周；出生體重(1 688.47±50.54)g；足月兒48例、早產兒96例。納入標準：①所有患兒均符合《新生兒急性呼吸窘迫綜合征蒙特勒(2017年版)》[6]中的相關診斷標準；②經影像學檢查與臨床體征檢查確診，X線片顯示雙肺彌漫性陰影伴肺水腫改變，超聲心動圖檢查無左心房高壓表現；③胎齡>27周；發病急，機械通氣3 d以上；④無肺外嚴重感染；⑤患兒家屬知情同意且簽署知情同意書。排除標準：①合并肺先天性心臟病、代謝紊亂等疾病；②合并肺部及胸壁畸形或其他嚴重先天畸形；③合并肺部表面活性物先天缺乏；④拒絕或不配合研究者。

本研究符合赫爾辛基宣言中關于醫學倫理的相關建議，經醫院醫學倫理委員會批準通過。

1.2方法

1.2.1分組 方法以新生兒診斷為NRDS為研究起點，痊愈出院或治療無效死亡為研究終點，根據患兒的預后將其分為生存組與死亡組。所有新生兒入院24 h后根據首次胸部X線片結果與病情嚴重程度將其分為輕度組(Ⅰ級、Ⅱ級)與重度組(Ⅲ級、Ⅳ級)。

1.2.2NRDS病情嚴重程度 ①X線表現等級：胸部X線片顯示兩肺野透亮度明顯降低，且有細小顆粒和網狀陰影為Ⅰ級；除Ⅰ級變化加重外，可見支氣管充氣征，延伸至肺野中外帶則為Ⅱ級；病變明顯嚴重，且肺野透亮度降低明顯，并且心緣、膈面呈模糊樣則為Ⅲ級；整個肺野呈白肺，支氣管充氣征更加明顯，似禿葉樹枝則為Ⅳ級。②新生兒急性生理學評分圍生期補充Ⅱ[7](perinatal supplement of acute physiological score for neonates Ⅱ，SNAPPE-Ⅱ)：所有患兒確診后12 h內使用該量表進行評分，總分值0～162分，得分越高，病情越嚴重。

1.2.3血清指標檢測 所有患兒入院后采集空腹靜脈血約3 mL，以3 000 r/min，離心10 min，離心后取上層血清，采用Trizol法提取血清總RNA，使用RTaseM-LAV逆轉試劑盒逆轉為cDNA應用實時熒光定量PCR(real-time fluoresent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測血清miR-210水平。miR-210上游引物：5′-ATGGTTC-GTGGGAGCCCCTGCCCACCGCA-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCCGAGGT-3′。反應條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，59 ℃ 20 s，共40個循環。以U6為內參，上游引物：5′-CATCCGATAAAAT-TGGAACGA-3′，下游引物：5′-TTTGTGCGTG-TCATCCTTGCG-3′，采用2-△△Ct計算miR-210相對表達量。

1.3觀察指標 ①比較生存組與死亡組患兒性別、胎齡、出生體重、母親年齡、病因、剖宮產、雙胎、羊水異常、miR-210水平、SNAPPE-Ⅱ評分等基線資料。②比較輕度組與重度組患兒血清miR-210水平、SNAPPE-Ⅱ評分。③繪制ROC曲線，分析血清miR-210水平對NRDS患兒死亡的預測價值。

1.4統計學方法 應用SPSS 19.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用獨立樣本t檢驗和配對t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。采用Spearman相關性分析miR-210水平表達與NRDS病情程度的相關性，繪制ROC曲線分析血清miR-210表達水平以及SNAPPE-Ⅱ評分預測NRDS死亡的預測價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1死亡組與生存組一般資料比較 根據預后分組，104例患兒中預后較好81例(77.88%)，死亡23例(22.12%)。生存組miR-210水平、SNAPPE-Ⅱ評分低于死亡組，差異有統計學意義(P<0.05)；2組性別、胎齡、出生體重、母親年齡、病因、剖宮產、雙胎、羊水異常等方面差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 死亡組與生存組一般資料比較Table 1 Comparison of general data between death group and survival group

2.2不同病情程度患兒血清miR-210水平與SNAPPE-Ⅱ評分比較 根據首次胸部X線片結果分組，104例患兒中輕度患兒73例，重度患兒31例。重度組miR-210水平、SNAPPE-Ⅱ評分高于輕度組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。NRDS發生與血清miR-210水平呈正相關性(r=0.638，P<0.001)。

2.3血清miR-210水平與SNAPPE-Ⅱ評分相關性分析 Pearson相關性分析結果顯示，血清miR-210與SNAPPE-Ⅱ評分呈正相關(r=0.513，P<0.05)。

表2 不同病情程度患兒血清miR-210水平與SNAPPE-Ⅱ評分比較Table 2 Comparison of serum miR-210 levels and SNAPPE-Ⅱ in children with different severities of disease

2.4血清miR-210水平對預測NRDS死亡的價值 血清miR-210的最佳分界值為16.71 ng/L，ROC曲線下面積為0.763，OR=0.846，95%CI：0.892～1.064，敏感度為82.61%(19/23)，特異度為86.42%(70/81)，陽性預測值為82.61%(19/23)，陰性預測值為50.00%(4/8)。見圖1。

圖1 血清miR-210對NRDS患兒預后的預測價值

3 討 論

NRDS又稱為新生兒肺透明膜病，是新生兒出生后不久出現進行性呼吸困難、呼吸衰竭等癥狀的一種疾病[8]，主要由于肺泡表面活性物質缺乏，并且新生兒由于肺部發育不完全，其肺部更易受到損傷，因此新生兒呼吸窘迫癥的發生率較高，但隨著肺成熟度增加，其恢復率增大[9]。研究指出，NRDS多見于早產兒，早產兒胎齡越小，發病率越高，隨著產前糖皮質激素預防以及出生后肺表面活性物質、正壓呼吸機等綜合治療手段，促使早產兒患兒的發病率有所降低，且典型癥狀與病情嚴重程度呈降低趨勢[10-11]。病情嚴重的NRDS患兒3 d內病死率較高，尤其是出生后第2天病死率最高，因此尋找一種快速有效評估預后指標對于提高新生兒生存率具有現實意義[12]。血清miR-210水平在呼吸道疾病的發生及發展中發揮重要作用，在多種呼吸道疾病發生、進展中起著重要作用[13]。

miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA因子[14]，在細胞內具有多種重要的調節作用，通過介導靶細胞基因轉錄本的降解或抑制其翻譯，從而抑制相關基因的表達，進而影響生長、發育、分化、增殖等多種生理病理過程[15]。相關研究表明，miRNA參與了ARDS等疾病的發生與進展，在ARDS炎癥反應以及細胞凋亡中發揮著重要的調控作用，同時miRNA在ARDS患者血清中表達發生變化，參與了上皮細胞、內皮細胞、巨噬細胞的病理生理過程，決定了ARDS患者的病情程度與預后[16-17]，因此miRNA有希望成為ARDS等疾病新型的生物標志物與新的治療靶點。研究指出，miR-210是一種低氧激活因子，靶基因具有多樣性，主要調控血管生成、細胞遷移、細胞分化、抑癌基因活性等諸多方面[18]。因此，miR-210在參與神經膠質瘤、周圍神經鞘膜瘤等腫瘤的發生，也參與了腦血管疾病的修復過程，如誘導血管再生[19]、改善缺血區血供[19]、促進神經元再生[20]以及炎癥反應[21]等。血清miR-210檢測已被廣泛用于多種神經疾病、腦卒中、心力衰竭、惡性腫瘤等疾病的診斷中。Mohammadhossein等[22]研究中發現，miR-210可在受損的組織部位呈異常表達，還可進入血液中，其變化程度與損傷程度保持一致，因此miR-210是判斷病情程度與預后的重要標志物之一。本研究結果顯示，生存組miR-210水平、SNAPPE-Ⅱ評分低于死亡組，2組性別、胎齡、出生體重、母親年齡、病因、剖宮產、雙胎、羊水異常差異無統計學意義。提示，血清miR-210水平與SNAPPE-Ⅱ評分與NRDS患兒預后相關，血清miR-210表達水平升高，患兒預后較差。同時，血清miR-210表達與SNAPPE-Ⅱ評分呈正相關，血清miR-210表達水平升高時，SNAPPE-Ⅱ評分越高，患者預后越差，死亡風險越高。SNAPPE-Ⅱ評分是目前臨床較為常用的一種新生兒危重病例評分系統[23]，可較全面的評估新生兒的危重癥情況，具有良好的預測價值，可較為準確地預測新生兒危重疾病的預后情況。

本研究結果顯示，輕度組患兒血清miR-210水平、SNAPPE-Ⅱ評分低于重度組，差異有統計學意義，提示血清miR-210水平對判斷NRDS患兒病情嚴重程度具有指導意義，且其表達水平與病情嚴重程度呈正相關性。血清miR-210的最佳分界值為16.71 ng/L時，OR=0.846，95%CI：0.892～1.064，敏感度為82.61%，特異度為86.42%，對預測NRDS患兒預后具有較高價值。NRDS患兒易因氣流阻塞而造成迷走神經興奮性降低、交感神經張力的升高，并誘導造成心肌細胞缺氧[24]。而細胞或組織受到上述病理變化的刺激后會誘導miR-210表達的上調，通過miR-210表達的上調進行負反饋調節[24]，來減輕缺氧對細胞及組織造成的損傷。有研究表明，miR-210對缺氧后神經干細胞的存活和凋亡的調控過程中發揮重要作用[25]。此外，miR-210對血管生成與細胞遷移也有明顯調控作用，可通過對靶分子受體酪氨酸激酶配體表達的抑制作用來調控及參與肺組織及心肌細胞等的損傷修復過程，有利于NRDS患兒病情的緩解級改善預后，可作為NRDS的潛在治療靶點。國外研究證實，miRNA-210是HIF-1α依賴型miRNA，機體缺氧狀態可隨著HIF-1α的變化增強缺血缺氧細胞中miRNA-210的表達水平，并通過對缺氧內皮細胞遷移、分化的影響來減輕缺氧損傷，本研究結論與之一致[26]。也有研究發現，缺氧缺血大鼠模型的腦組織中miRNA-210表達出現下調[27-28]，本研究結果與之不同，考慮與該研究中miRNA-210表達的檢測時間較晚，是在大鼠缺氧缺血后72 h才進行檢測有關。

綜上所述，miR-210表達水平與NRDS患兒病情嚴重程度密切相關，其表達水平越高NRDS患兒病情越嚴重，預后越差。當清miR-210的最佳分界值為16.71 ng/L時，對預測NRDS患兒預后具有較高價值，miR-210檢測有望成為NRDS潛在的預后標志物與新的治療靶向。