特異性促炎癥消退介質在眼表疾病中的研究進展

賀李嫻，譚 鋼

0引言

多不飽和脂肪酸是哺乳動物細胞膜的主要成分，包括花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)與二十二碳五烯酸(docopentaenoic acid，DPA)。這些多不飽和脂肪酸可被環氧合酶(cyclooxygenase，COX)、脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)和單加氧酶(CYP450)代謝分解為一系列具有高度生物活性的含氧脂質介質，在炎癥過程中發揮限制炎癥強度、促進炎癥消退的作用。這類能夠調控炎癥消退反應介質被統稱為內源性特異性脂質(specialized pro-resolving mediators，SPM)。至今已發現的SPM主要包括脂氧素(lipoxin，LX)、消退素(resolvin，RvE)、保護素(protectin)及Maresins(MaR)四大家族。多不飽和脂肪酸衍生的SPM通過與特定的G蛋白偶聯受體結合，調控細胞因子和趨化因子的釋放，限制免疫細胞浸潤與激活，從而促進炎癥的消退，使機體恢復穩態，共同構成內源性SPM網絡[1-2]。研究表明，SPM在維持眼表健康與免疫穩態方面起著關鍵的作用[3-5]。此外，SPM及其類似物還參與角膜傷口愈合、角膜移植排斥反應、過敏性結膜炎、感染性角膜炎及干眼(dry eye disease, DED)等一系列眼表疾病的發病過程，成為調節眼表免疫反應、消除急性炎癥、促進角膜傷口愈合與神經再生的關鍵信號分子與藥物治療靶點[6-11]。本文將集中闡述SPM對于維持眼表穩態的重要性及SPM在多種眼表疾病中的治療潛力。

1內源性SPM網絡在眼表組織和細胞的表達

1984年，Serhan等[12]首次報道了SPM家族中的第1個成員脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)，之后Gronert等[13]于2005年在角膜表面鑒定出脂氧素A4(LXA4)與神經保護素D1(neuroprotectin D1, NPD1)，并證實角膜上皮細胞是健康角膜內源性SPM的主要來源，而角膜上皮缺損則出現LXA4和NPD1在角膜組織的表達缺失，表明LXA4和NPD1等內源性SPM在維持眼表健康與角膜的完整性方面起重要作用。

已經證實，產生SPM的酶在角膜上皮細胞和免疫細胞中高度表達。SPM的產生大多依賴于LOX酶，有三種主要的LOX酶(5-LOX、15-LOX和12-LOX)。其中，5-LOX和15-LOX催化多不飽和脂肪酸底物的氧化反應從而生成一系列SPM。體內大多數部位的中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞都高度表達5-LOX。眼部的幾種細胞(如視網膜星形膠質細胞、間充質基質細胞與角膜上皮細胞等)均存在5-LOX的表達[14-15]。其中，角膜上皮細胞和視網膜星形膠質細胞同時表達5-LOX和15-LOX酶[13]。

同時，SPM的特異性受體(如LXA4、RvD1和RvE1的受體)表達于眼表微環境中常駐或浸潤的細胞表面，包括上皮細胞、杯狀細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和效應性T細胞[16-18]。LXA4(AA衍生而來)和RvD1(DHA衍生而來)兩者擁有相同的受體FPR2/ALX，在健康的角膜、結膜和視網膜以及淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞中都有表達[16-17]。RvE1(EPA衍生而來)尚未在動物或人的眼表或淚液中發現，但發現其受體ChemR23在角膜上皮細胞、角膜基質細胞和浸潤的白細胞中有表達[18]。保護素、Maresins(DHA和DPA衍生而來)對應的G-蛋白偶聯受體在小鼠和人類的其他部位有表達，有學者推測這些受體可能由眼表局部或浸潤的淋巴細胞和中心粒細胞所表達。

2 SPM在維持眼表健康與免疫穩態中的作用

眼表微環境中適度的炎癥反應與免疫穩態對于維持視功能和保護視力具有重要作用。眼表微環境中不同的組織細胞成分(角膜、結膜和淚腺等組織細胞)在維持眼表健康方面發揮著各自獨特的作用，而一旦細胞功能異常或失調則會導致持續的眼表炎癥，對眼表組織造成炎性損傷，最終導致視力喪失。SPM作為眼表炎癥反應控制與消退的關鍵信號分子，參與了角膜上皮再生、角膜損傷后血管生成、淚液產生等關鍵病理生理過程。

2.1角膜上皮再生角膜上皮再生是維持眼表穩態的重要機制。角膜緣干細胞通過向心遷移至角膜中心來代替脫落的角膜上皮細胞。當角膜上皮受損時，位于角膜之外的中性粒細胞會在幾小時內滲透到角膜基質中，參與角膜傷口的正常修復過程。而在角膜上皮擦傷的動物模型中，預先清除中性粒細胞則顯著延遲了角膜上皮的再上皮化和傷口愈合[13,19]。研究發現，雌性小鼠和雌二醇處理的雄性小鼠的角膜傷口愈合延遲，可能與雌激素抑制LXA4的生成而下調角膜中性粒細胞反應和再上皮化有關[20]。局部使用LXA4可促進女性患者角膜的傷口愈合，同時接受雌二醇治療亦有利于男性患者角膜傷口的恢復與愈合[20]。這些研究表明，急性角膜創傷愈合反應的性別差異可能與角膜SPM的作用有關。

2.2角膜損傷后新生血管生成角膜內源性LXA4在調節角膜損傷后新生血管生成中具有重要作用。內源性5-LOX和15-LOX是LXA4合成的關鍵酶。在慢性眼部炎癥模型中，5-LOX或15-LOX的基因缺失可促進角膜新生血管化，表明角膜內源性LXA4參與調節炎癥新生血管生成，局部使用LXA4治療LOX基因敲除小鼠可減輕小鼠角膜的新生血管生成[21]。此外，在縫線法誘導的角膜新生血管小鼠模型中，LXA4類似物ATLa與消退素(RvD1與RvE1)也可抑制角膜的新生血管生成[16,21]。

2.3淚液產生淚液分泌是維持眼表健康的關鍵環節。健康志愿者的淚液中有大量的SPM及其前體被檢出[22]。研究者利用脂質代謝組學，在12名健康志愿者的淚液中檢測到了較高濃度的AA衍生脂質(LXA4、15-epi LXA4、前列腺素PG)以及DHA衍生脂質(RvD1、RvD2和RvD5)[22]。在小鼠模型中，淚腺可以產生大量的LXA4[23]，但目前尚不能明確淚液中SPM的組織和細胞來源(包括角膜上皮細胞、淚腺、瞼板腺或結膜等)。

3 SPM在眼表疾病的治療作用

3.1角膜傷口愈合角膜組織持續暴露于外界環境中，易受到各種理化因素的刺激與傷害。在眼外傷、某些合并疾病(糖尿病等)及接受眼部手術(LASIK屈光手術和角膜移植等)的人群，角膜擦傷的發生率更高，角膜傷口的愈合與治療一直是困擾臨床眼科醫生的難題。多項體外模型研究表明，SPM治療對角膜上皮細胞產生直接的保護作用，能促進角膜上皮細胞的傷口愈合。在人角膜上皮細胞體外劃痕實驗中，Zhang等[6]發現消退素RvE1可以促進角膜上皮層的傷口愈合，其保護效應可能與表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)密切相關；Wang等[20]研究亦表明脂氧素LXA4可促進了角膜上皮細胞的遷移，并逆轉雌二醇導致的角膜炎癥與再上皮化延遲。同樣在兔角膜上皮細胞，研究證實表皮生長因子可誘導脂氧素LXA4產生，進而促進兔角膜上皮細胞的增殖、遷移與愈合。

多項動物模型證實，SPM在角膜傷口愈合過程中起關鍵性作用。角膜損傷后，中性粒細胞是第一批滲入角膜基質的效應細胞。由于中性粒細胞高表達5-LOX，因此能夠擴增或啟動多個SPM的形成，在調節下游免疫反應與后續炎癥消退過程中發揮重要作用。研究表明，中性粒細胞對角膜傷口的正常愈合至關重要。在角膜熱灼傷和角膜上皮剝離等急性角膜擦傷小鼠模型，眼表局部應用脂氧素LXA4或神經保護素NPD1滴眼液可顯著增加中性粒細胞的浸潤，促進角膜傷口愈合[13]。Wang等[20]發現雌性小鼠角膜上皮傷口愈合延遲，與角膜上皮中脂氧素合成酶15-LOX的低表達及脂氧素LXA4形成減少有關，而LXA4滴眼則顯著改善雌二醇導致的角膜上皮傷口愈合延遲，表明角膜傷口愈合的性別差異與雌二醇對上皮內中性粒細胞15-LOX/LXA脂質回路的的選擇性調節有關。除中性粒細胞外，角膜上皮損傷期間大量的嗜酸性粒細胞亦被募集到角膜組織中。Ogawa等[24]研究發現，與野生型小鼠相比，嗜酸性粒細胞缺乏的小鼠與嗜酸性粒細胞12/15-LOX條件性敲除的小鼠均出現角膜傷口愈合延遲，表明嗜酸性粒細胞表達的12/15-LOX脂質回路與角膜損傷修復密切相關。此外，角膜上皮細胞表達LXA4、RvD1和RvE1等對應的G-蛋白偶聯受體(FPR2/ALX和ChemR23)[16]，然而還需要進一步的研究來確定調控角膜上皮細胞遷移、增殖的分子機制和信號轉導途徑。

3.2角膜神經再生角膜是人體內神經分布最多的組織，而角膜神經則是維持眼表健康與微環境穩態的關鍵成分之一。在某些病理情況下(衰老、糖尿病眼病、黃斑變性、DED及屈光手術等)，角膜神經病變往往導致角膜感覺受損、疼痛敏感度降低、角膜感染風險增加、傷口愈合延遲甚至角膜潰瘍穿孔。最近在視網膜神經節細胞和原代皮層神經元中發現了SPM受體(ALX/FPR2)，表明SPM可以與神經細胞直接作用[14]。多項動物實驗表明，神經保護素NPD1具有促進角膜神經再生的作用對大腦和視網膜具有神經保護作用[13]。NPD1局部滴眼還可促進小鼠屈光手術后及兔板層角膜切除術后角膜和基質神經損傷的神經再生[25]。色素上皮衍生因子(pigment epithelial-derived factor，PEDF)是一種作用廣泛的分泌蛋白，具有抗新生血管、神經營養及神經保護功能。近年來研究發現，PEDF可由受損的角膜上皮細胞通過自分泌途徑產生，PEDF能刺激DHA的生成，繼而通過15-LOX促進NPD1的生物合成。研究發現，在板層角膜切除術后，聯合應用PEDF和DHA滴眼可刺激NPD1的產生，增加神經密度并促進角膜上皮細胞的增殖。在糖尿病小鼠模型中，PEDF和DHA聯合治療可顯著增加角膜損傷后的角膜神經再生、敏感性和淚液分泌量，還并通過選擇性募集2型巨噬細胞至傷口周圍來加速角膜傷口愈合[26]。單獨應用消退素RvD1通過作用其受體FPR2/ALX途徑刺激糖尿病小鼠角膜神經生長[27]。Pham等[8]報道了衍生于DHA的新型RvD6立體異構體RvD6si滴眼液可通過調節三叉神經的基因表達(上調轉錄組Rictor、mTORC2等與軸突生長相關轉錄基因的表達，下調與神經病理性疼痛相關轉錄基因的表達)，從而促進損傷后的角膜神經再生與角膜傷口愈合和功能恢復，減輕眼神經病理性疼痛。因此，這些研究為DHA來源的SPM網絡作為治療角膜糖尿病神經病變和刺激神經再生的潛在局部療法提供了充足的證據。以上研究表明，NPD1、RvD1等SPM可以促進基質和角膜神經損傷后的神經再生，然而SPM如何促進神經再生和功能活性的分子機制有待進一步研究。

3.3角膜移植排斥反應角膜移植術是治療終末期角膜疾病的常用方式，雖然角膜移植的成功率較其它器官移植高，但是術后排斥仍然是手術失敗的主要原因。即使積極使用抗排斥藥物干預，臨床上仍可見大量移植后排斥病例。移植受體角膜植床的微環境改變，如角膜炎癥刺激及新生血管化等，都成為角膜移植排斥的危險因素，術后排斥幾率達到50%。有證據表明，SPM預處理可以提高供體角膜保存期間移植物活性，從而減少移植物排斥反應的發生率。He等[7]改良了人角膜供體移植物的保存方法，發現移植物在脂氧素衍生物15-epi LXA4的DMEM/F-12培養液預先保存過夜(然后再轉移至Optisol-GS角膜保存液)，與安慰劑對照組相比，移植物存活率提高了36%～56%，同時移植物角膜上皮細胞的增殖活性增加了近3倍。在小鼠角膜移植模型，Hua等[17]發現在移植后即刻和移植后7d靜脈注射消退素RvD1a(1μg/mL)，可顯著降低受體T細胞的同種異體致敏反應，抑制移植物T細胞浸潤及炎性血管生成，從而提高了移植物的存活率。盡管體內體外實驗均證實SPM具有抑制同種異體免疫反應、提高移植物存活率的潛力，但尚需更多的臨床與基礎研究進一步證實其保護作用。

3.4結膜炎結膜炎是一種常見的眼表疾病，其病因包括病毒或細菌感染、過敏或自身免疫性因素。在過敏性結膜炎中，杯狀細胞功能異常和黏蛋白分泌失調與結膜炎眼部病理損傷密切相關；而結膜黏蛋白的分泌又與肥大細胞脫顆粒后組胺刺激杯狀細胞內的鈣離子釋放有關。研究表明，SPM具有維持正常黏蛋白分泌穩態的功能。體外研究表明，在大鼠和人結膜杯狀細胞中，多種SPM(包括LXA4、RvD1、RvD2和RvE1)，可以下調組胺觸發的鈣信號及其他信號通路，抑制黏蛋白分泌[28-29]。此外，結膜杯狀細胞表達LXA4/RvD1的受體(FPR2/ALX)和RvE1的受體(ChemR23)受體[30]。動物實驗亦表明，SPM局部滴眼可顯著改善卵清蛋白誘導的小鼠過敏性結膜炎癥狀，如減少杯狀細胞黏蛋白分泌、降低結膜免疫細胞(CD4+T細胞、CD11b+髓樣細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞與單核細胞等)的數量[9]。在病毒性結膜炎小鼠模型中，發現眼瞼結膜中存在脂氧合酶5-LOX的高表達，而5-LOX抑制劑抑制半胱氨酰白三烯的分泌并減輕結膜病理損傷[31]。

3.5感染性角膜炎SPM在治療眼表病原體感染性疾病方面具有積極的作用。相比傳統的抗生素或免疫抑制劑治療，SPM作為一種治療眼部感染的新途徑，可抑制白細胞的黏附、遷移與激活，增強巨噬細胞對細菌和凋亡的中性粒細胞的吞噬作用，促進眼表抗菌肽的形成，從而減輕破壞性感染性炎癥、防止角膜混濁和瘢痕形成、提高局部抗生素療效和增強眼表天然免疫防御能力。SPM已被證明能減少病毒感染后的眼表損傷。單純皰疹病毒1型(HSV-1)感染會導致角膜知覺受損，嚴重時會導致角膜潰瘍、融化和穿孔。局部應用RvE1類似物(RX-10005)可顯著減少角膜中T細胞和中性粒細胞的浸潤抑制，從而抑制HSV-1感染后角膜新生血管的形成、減輕基質角膜炎，改善病毒感染后的角膜病理損傷[10]。銅綠假單胞菌是一種臨床上常見的條件致病菌，也是配戴隱形眼鏡及眼科術后細菌性角膜炎的常見致病菌。眼部銅綠假單胞菌感染可誘導強烈的角膜上皮炎性反應和PGE2的釋放，從而導致眼表的永久性損傷。在細菌脂多糖或滅活的銅綠假單胞菌誘導的小鼠細菌性角膜炎模型，在造模前后局部應用RvE1可減輕角膜基質厚度，抑制局部中性粒細胞的浸潤以及細胞因子(CXCL1、腫瘤壞死因子α和白細胞介素-1β等)的生成[10]；局部應用LXA4可抑制角膜中性粒細胞浸潤與CXCL1水平從而緩解角膜炎癥，同時促進角膜上皮的傷口愈合，增加83%的再上皮化[32]。表明SPM作為輔助治療可以潛在地抑制眼部微生物感染的病原性炎癥，同時還可促進組織再生。

3.6DED DED是一種多因素疾病，目前全球約有2000萬人罹患DED，也是當前最常見的眼表疾病之一。DED的病因很廣，危害較大，可引起眼睛不適、疲勞和視力障礙，嚴重影響工作效率和生活質量，甚至可因發生角膜潰瘍或瘢痕致盲，給個人以及社會帶來巨大的負擔。大量的動物實驗表明，SPM或內源性SPM系統在免疫驅動的DED中具有保護作用，是治療DED的行之有效的方法[23,33-34]。在東莨膽堿聯合干燥通風誘導的經典小鼠DED模型，消退素RvE1的類似物(RX-10001)滴眼預處理可降低DED小鼠角膜通透性，維持杯狀細胞的密度[33]，還可增加了淚液分泌量，促進了角膜上皮屏障完整性，降低COX-2的表達，并抑制了CD4+T細胞和巨噬細胞的浸潤[34]。LXA4的下調與雌性小鼠DED的發生密切相關。最近的一項研究發現，DHA飲食不足3mo既可顯著加重雌鼠DED癥狀，而補充DHA可改善DHA缺乏飲食的雌性DED癥狀，其機制與DHA上調Treg細胞的數量，減少引流淋巴結中Th1和Th17效應細胞有關[23]。同時，DHA還可上調引流淋巴結和角膜緣中性粒細胞15-LOX的表達，導致局部LXA4水平升高；而位于引流淋巴結的中性粒細胞數量減少和LXA4形成障礙已被證實為一種性別特異性反應，參與T效應細胞功能反應并導致雌性小鼠DED[11]。由此可見，性別特異性的淋巴結LXA4回路的下調與雌性DED的擴增有關。在小鼠干燥綜合征相關的DED模型中，RvD1全身用藥可減輕局部炎癥細胞的滲出，改善小鼠的唾液分泌功能[35]。除了眼表疾病外，RvE1和RvE1類似物(RX-10001)在其他器官系統疾病中的保護作用也得到廣泛證實[36]。近年來，RX-10045作為眼科藥物的安全性和有效性，在DED、白內障手術后的眼表炎癥的局部治療亦得到證實[37]。

淚液中的SPM還有望成為DED的生物標志物。研究發現，人體淚液中亦存在SPM。English等[22]利用脂質組學在健康志愿者的淚液中檢測到了較高濃度的脂氧素(LXA4、15-epi LXA4)與消退素(RvD1、RvD2和RvD5)。同時在男性志愿者的淚液中消退素濃度更高，而脂氧素(LXA4和15-epi LXA4)在女性眼淚中表達更為豐富，表明SPM在淚液的表達存在一定的性別差異。然而，當前有關DED淚液中SPM檢測分析的報道尚不多，但SPM在DED疾病診斷生物標志物方面仍具有一定的潛力。

4前景與展望

SPM與眼表健康和免疫穩態息息相關，且在眼表疾病中的治療價值日益凸顯，SPM及其類似物在調節眼表免疫反應、促進眼表炎癥消退、促進角膜傷口愈合與神經再生等方面，展示出廣闊的應用前景。目前已開發了以SPM的結構類似物用于DED的臨床治療，但較真正投入臨床應用還要克服諸多挑戰，仍需要大規模多中心的臨床試驗來佐證。未來我們期待更多的SPM新成員或生物活性穩定的類似物，從內源性抗炎癥消退機制角度來來解釋眼表疾病的發病機制，應用于常見眼表疾病(尤其角膜創傷、眼表感染及DED等)的治療中。