PNEC-ILC2神經免疫通路在支氣管哮喘中的研究進展

黃帥陽 崔紅生 候丹 呂明圣 黃貴銳

1北京中醫藥大學第三附屬醫院（北京100029）；2北京中醫藥大學（北京100029）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是由下呼吸道慢性炎癥和氣道高反應引起的一種常見肺系疾病，臨床上哮喘患者常反復發作，全世界人口大約有三分之一的哮喘患者，每年有近250 萬患者死于嚴重惡化，帶來了嚴重的健康和社會經濟負擔［1］，充分認識哮喘的病理生理學和哮喘發生的病理機制是非常必要的。呼吸道經常暴露在抗原和各種病原體中，呼吸道中的免疫細胞是抵抗這些病原體的第一道防御系統，既往認為免疫炎癥機制貫穿于哮喘疾病發生發展的全過程，包括固有免疫和適應性免疫，涉及的免疫細胞包括［2］：T 輔助2 型細胞（helper type 2 cells，Th2s）、2 型固有淋巴細胞（type 2 innate lymphoid cells，ILC2）、分泌IgE 的B細胞和嗜酸性粒細胞。ILC2s 上游的激活通路尚未完全清楚，研究發現肺神經內分泌細胞（pulmonary neuroendocrine cells，PNECs）可以與ILC2 形成神經免疫模塊，PNECs 作為一種罕見氣道上皮細胞，具有神經內分泌功能，目前作為肺內傳感器而備受關注，過敏原等有害刺激物可以通過激活呼吸道的感覺傳入神經亞群，觸發防御性反應，如呼吸暫停、咳嗽和支氣管痙攣［3］。PNEC-ILC2 神經免疫通路激發產生肺部Th2 免疫炎癥，共同參與急慢性哮喘過程的調控，調節肺內“神經-內分泌-免疫（neuroendocine-immune，NEI）”網絡可能成為未來哮喘防治的另一研究熱點。本文結合近年相關文獻，對PNEC-ILC2 神經免疫通路在哮喘中的調控機制作一綜述。

1 PNEC 與哮喘

1.1 PENC 受神經支配PNEC 于1954年首次被發現，它是肺內一種罕見的、由神經支配的氣道上皮細胞類型，PNEC 可簇聚形成菱形或卵圓形小體，即高特異性的神經上皮小體（neuroepithelial bodies，NEBs），常存在于支氣管分支點連接處富集，是一種具有神經內分泌功能的特殊上皮細胞［4］。形態學觀察發現，NEBs 與味蕾、頸動脈體的化學受體在結構上有相似之處，PNEC 這種特殊分布和形態結構特征可能是感知呼吸道缺氧條件和過敏原的最佳方式［5］。

目前研究報道NEBs 具有雙重感覺神經纖維支配：一是迷走神經結狀神經節的鈣結合蛋白D28K 和P2X3 受體免疫神經纖維；另一是背根神經節的P 物質（substance P，SP）和降鈣素基因相關肽（calcitoningene-related peptide，CGRP）免疫反應性神經纖維［6-7］。研究人員切斷大鼠左側迷走神經發現NEBs 神經末梢退化或消失，神經節后副交感神經應激性增高，PNEC 數量、大支氣管內血清素（serotonin，5-HT）和CGRP 的免疫染色陽性細胞也明顯增加，表明迷走神經具有支配、調節PNEC分化及分泌神經活性物質的功能［8］。

1.2 PENC 的神經內分泌功能PNEC 在電鏡下可觀察到胞漿內有大量特征性的致密核心小泡（dense core vesicles，DCVs），直徑從60 ～200 nm 不等，形態各異；NEBs 受感覺神經纖維相支配的同時，攜帶對缺氧、高碳酸血癥和尼古丁等多種刺激敏感的膜受體，這些膜受體受到內、外界環境變化時會刺激DCVs 合成、儲存和釋放許多生物活性物質，比如5-HT、鈴蟾肽/蛙皮素（bombesin）、CGRP、血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）、降血鈣素、腦啡肽、生長抑素、膽囊收縮素和SP［9］。研究證明在人體休息時，每分鐘大約有5 ～8 升空氣進出肺部，空氣中O2和CO2的濃度不同，可能攜帶過敏原，這些信號可以被PNEC 感知、傳遞，并被加工成生理輸出，比如PNEC 可以感受外界低氧環境刺激，引起一系列的神經沖動來調節呼吸節律和肺的生理功能［10］。PNEC 在調節胎兒和新生兒肺的發育也發揮了關鍵作用，經過實驗證明，Bombesin/胃泌素釋放多肽（gastrin-releasing polypeptide，GRP）可以促進子宮內胎肺的氣道上皮分化和肺的成熟［11］。此外，PNEC 還具有干細胞特性，研究發現PNEC 可以平衡和修復嚴重的氣道損傷，發生再生反應［12］。

1.3 PNEC在哮喘發生機制中可能的作用靶點病理狀態下，NEBs 的形態和功能與幾種疑難的人類肺部疾病息息相關。在很多肺部疾病的病理形態下均可觀察到PNEC 數量增加，PNEC 的增生可引起化學高反應性和神經多肽分泌過度，從而導致多種肺系疾病，包括哮喘、支氣管肺發育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）、囊性纖維化、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、先天性肺疾病、肺動脈高壓、嬰兒猝死癥、肺神經內分泌腫瘤等等［13］。Gu X 團隊研究發現［14］原代培養的人氣道上皮細胞暴露于揮發性化學物質可降低PNEC 中5-HT 水平，并導致CGRP 釋放到基礎培養基中。VIP 作為細胞因子/趨化因子可發揮廣泛的免疫功能［15］，VIP 可以與嗜酸性粒細胞、肥大細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等免疫細胞的特異性受體結合，在過敏性疾病的發生過程中發揮重要作用。PNEC 還可以分泌γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）促進杯狀細胞的分化而產生過多黏液，研究人員利用黏液預誘導正常人支氣管上皮細胞，發現藥物阻斷GABAα 和GABAβ 受體信號逆轉了IL-13 對肺組織黏蛋白5ac（MUC5ac）基因表達和杯狀細胞增殖的影響［16］。因此，PNEC 上的化學受體及其下游信號可能成為未來治療肺系疾病以及氣道超敏相關的作用靶點。

2 ILC2 與哮喘

2.1 ILCs 細胞特性與激活途徑ILCs 在調節組織穩態和炎癥發病機制中具有重要的調節作用，ILCs 分為 三 個 主 要 的 亞 型：ILC1s（type 1 ILCs，ILC1s）、ILC2s 和ILC3s（type 3 ILCs，ILC3s），ILCs 被認為是T 淋巴細胞的天然配對物，ILC1s、ILC2s 和ILC3s 分別與CD4+T 輔助1 型細胞（T helper type 1，Th1）、T 輔助2 型細胞（T helper type 2，Th2）和Th17細胞配對［17］。其中ILC2s 在過敏性鼻炎、慢性鼻竇炎伴鼻息肉和哮喘等Th2 型炎癥疾病中表達很高，ILC2s 通過激活嗜酸性粒細胞、B 細胞、肥大細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和上皮細胞介導產生2 型細胞因子，包括IL-5 和IL-13，促進平滑肌收縮、嗜酸性粒細胞浸潤和杯狀細胞增生，從而啟動和放大氣道炎癥反應［18］。

ILC2s 通常通過以下的主要信號激活并產生2型細胞因子［19］：（1）白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）介導的家族細胞因子（IL-1b、IL-18、IL-33）、IL-25 和腫瘤壞死因子超家族，可以通過絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）和腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）激活核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號傳導和轉錄激活因子-1（AP-1）通路，刺激IL-5 和IL-13 的產生。（2）ILC2s 還表達IL-2 和IL-7 家族細胞因子受體，IL-2、IL-7、IL-9 和胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）可激活STAT5（signal transducer and activator of transcription 5）通路，成為ILC2s 介導的Th2 型炎癥的共刺激和增強因子［20］。（3）白三烯（leukotrienes，LTs）和前列腺素（prostaglandins，PGs）在內的脂質介質在體內平衡和炎癥中發揮重要作用，脂質介質（LTC4、LTD4、PGD2）可通過活化T 細胞核因子（nuclear factor of activated T-cells，NFAT）途徑誘導ILC2 遷移和產生Th2 型細胞因子，包括IL-4、IL-5和IL-13［21］。（4）神經肽包括神經髓質U（neuromedin U，NMU）、VIP 和CGRP 也被發現可直接或間接刺激ILC2s，產生Th2 型炎癥反應［22］。

2.2 ILC2s 在哮喘中介導的氣道炎癥ILC2s 介導的炎癥主要通過IL-4、IL-5、IL-9 和IL-13 等2 型細胞因子的產生，其中IL-4 和IL-13 是控制B 細胞IgE 反應、上皮細胞重塑和黏液產生、誘導嗜酸性粒細胞趨化和M2 巨噬細胞極化的關鍵因子［23］。IL-9 可以促進肥大細胞生長和杯狀細胞分化［24］。許多臨床研究都揭示了ILC2s 在氣道2 型炎癥性疾病中的重要性。變應性鼻炎患者經變應原刺激后發現外周血和刮除鼻腔標本中的ILC2s 均增加，且這些刮除鼻腔標本中的ILC2 數量與嗜酸性粒細胞數量和IL-5 濃度呈正相關［25］。SMITH 等［26］研究人員還發現，哮喘患者痰中IL-5、IL-13、ILC2s 的數量表達均升高。

3 PNEC-ILC2 神經免疫通路

3.1 PNEC-ILC2神經免疫通路在哮喘中的作用PNEC 的效應主要通過分泌神經肽、神經遞質等實現。體內實驗證明PNEC 作為精確的氣道傳感器，通過神經肽引發免疫反應，SUI 等［27］研究員在Science 發文表示，PNECs 位于靠近氣道分支點的ILC2s 附近，在無PNECs 表達的A-scl1（PNEC 形成過程中的關鍵轉錄因子）基因突變合并過敏性哮喘的模型小鼠中存在嚴重的Th2 型炎癥反應遲鈍。PNECs 一方面可能通過CGRP 刺激ILC2s，誘導初始CD4+T 細胞向Th2 細胞分化，刺激釋放IL-5，IL-5反過來可以招募嗜酸性粒細胞，引發一系列炎癥級聯免疫反應；另一方面可釋放GABA 誘導杯狀細胞的增生［27-28］。這些研究發現均表明PNECILC2 在氣道分支點起作用，可以增強過敏性哮喘反應，PNECs 可直接向ILC2s 發出信號刺激，共同形成神經免疫通路，感知并響應進入氣道的環境刺激。

近年來，隨著生物-心理-社會醫學模式的發展，精神、心理等因素對哮喘的發作和加重的影響受到醫學科研人員的廣泛討論，有學者提出了“心理應激哮喘”的概念［29］。有研究發現應激狀態下其可通過釋放乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）等神經遞質激活肺部下游的PNEC，刺激PNEC-ILC2 神經免疫通路，繼而產生Th2 免疫炎癥發生或加重，這說明心理應激誘發哮喘的病理機制與副交感神經系統異常激活密切相關［30］。

3.2 中醫藥對PNEC-ILC2 通路的研究進展糖皮質激素是目前控制哮喘發作最有效的藥物，但其長期應用存在著下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic pituitary adrenal，HPA）軸功能抑制、激素依賴或抵抗等副作用。中醫藥治療哮喘療效獨特，毒副作用小，具有廣泛的群眾基礎［31］。PNEC 分泌的肺內神經肽在哮喘發病機制的重要作用，讓許多研究學者將研究方向轉移到了中醫藥對哮喘肺內神經肽的作用。在基礎實驗中發現黃龍止咳口服液可能通過降低介質白三烯E4（LTE4）、神經生長因子（NGF）、CGRP 含量來調節免疫學炎癥介質［32］；麻杏石甘湯干預哮喘大鼠模型后發現，大鼠肺組織內CGRP、SP 含量和氣管中TRPV1 蛋白表達明顯降低［33］。此外研究還發現白芥子散能增強VIP 并減弱SP、CGRP 在肺組織中的表達，從而有效改善大鼠過敏性哮喘反應［34］。這些中醫藥的實驗研究進一步證實了PNEC-ILC2 通路在哮喘的Th2 免疫炎癥的調節中發揮著關鍵作用。

課題組既往網絡藥理學研究［35］得到中藥復方哮喘寧顆粒和心理應激哮喘的交集靶點，通過GO和KEGG 富集分析得知這些靶點之間的基因互作模塊，發現哮喘寧顆粒可能通過神經活性配體受體相互作用來調節肺內NEI 網絡。近年來中醫大家多從肝肺相關理論，提出了治療中醫“哮病”的新思路，肝失疏泄的病理變化與大腦皮層功能及自主神經功能關系密切，情志變化可引起NEI 網絡失調［36］。從病機上分析，肝肺兩臟生理相關、病理相因，若情志不遂，肝氣亢害，則肝氣反侮肺金，肺失肅降，氣逆于上而發咳喘。這與外界環境刺激PNEC-ILC2 神經免疫通路異常激活介導肺部Th2 免疫炎癥的病理過程不謀而合。因此PNECILC2 神經免疫通路可能在哮喘發生發展和誘發加重的過程中發揮了重要作用，但仍需更多的實驗證據加以驗證。本課題組基礎實驗發現哮喘寧顆粒具有調節心理應激性哮喘大鼠心理應激狀態作用，并緩解氣道炎癥反應［37］。研究人員用中藥復方平喘方干預哮喘小鼠模型，發現可有效降低杯狀細胞和PNEC 增殖、肺組織內炎癥和氣道粘液分泌過多，且平喘方可能通過PNEC-GABA-IL13-Muc5ac 軸來減少氣道炎癥和粘液高分泌來控制哮喘發作［38］。

4 展望

越來越多的證據表明，PNEC-ILC2 模塊作為神經內分泌-免疫網絡的重要信號通路，在哮喘等變應性疾病的發生發展過程中發揮了重要作用。PNEC 和ILC2s 在哮喘中明顯增多，其中ILC2s 的激活和抑制機制在過去的十年中已經越來越清晰，但PNCE 的神經免疫功能對ILC2s 的激活機制尚未完全清楚。研究者在通過調控PNEC 的神經支配、抑制PNEC 所分泌的神經肽、阻斷ILC2 激活通路來治療哮喘取得了一定的成果，但其在臨床上的運用價值還有待進一步驗證。目前除了糖皮質激素治療外，幾乎沒有針對ILC2 的治療方法，未來在這一領域的研究可能給Th2 型氣道疾病（尤其是哮喘）新療法帶來新的視角，例如抑制PNEC 所分泌的神經肽、阻斷ILC2 上游激活物、激活ILC2抑制通路或抑制ILC2 介導的通路，但仍待進一步的研究。此外，中醫藥具有廣闊的應用前景，“肝肺相關理論”在調節人體心理因素對哮喘的影響方面具有顯著優勢，在調節肺內NEI 網絡具有重要價值。研究中醫藥在PNEC-ILC2 神經免疫通路的作用機制，可為開發哮喘的中藥防治提供檢測指標和理論依據，具有重要的臨床價值。