細胞自噬與血腦屏障的關系研究進展

王俁棋，徐鵬，范紅結，王小敏

遵義醫科大學基礎醫學院，貴州遵義 563000

自噬是一種高度保守的生物學現象，在大多數細胞中，基礎水平的自噬不斷發生。自噬能夠清除錯誤折疊的蛋白質和受損的細胞器，這對于細胞在各類應激狀態下的存活及保持自身完整性至關重要[1-2]。研究表明，自噬參與調節先天性免疫和獲得性免疫，與機體健康密切相關，自噬流受阻可能導致癌癥、亨廷頓病、帕金森病等疾病[3-4]。血腦屏障(blood brain barrier，BBB)在大腦與外周循環之間起保護作用，主要由腦微血管內皮細胞(cerebral microvascular endothelial cells，BMECs)、周細胞、星形膠質細胞和神經元組成，其中BMECs通過緊密連接(tight junction，TJ)蛋白連接[5-6]。TJ蛋白是BBB控制腦血管通透性的主要功能成分，BBB功能障礙通常與內皮細胞緊密連接的破壞或過度通透有關，可導致各種中樞神經系統疾病。因此，維持BBB結構的完整性和正常功能對中樞神經系統的穩態和生理功能至關重要。最近研究表明，細胞自噬過程受一系列生物因子和化合物的調節，且可能對BBB的功能與結構完整性產生重大影響。本文綜述目前關于細胞自噬在BBB完整性、防止病原體等有害物質穿越BBB、加速藥物穿越BBB進而發揮藥效等方面的研究進展，旨在為進一步探討自噬與中樞神經系統疾病的關系奠定理論依據。

1 自噬與BBB相互影響

自噬對BBB有著雙重作用，在某些情況下，自噬對BBB的完整性起到保護作用，主要表現在缺血缺氧等應激狀態下有助于維持BBB的完整性以及腦損傷后對BBB的修復作用。然而，有研究表明，自噬對BBB的完整性亦可起到損傷或破壞作用[7]。

1.1 細胞自噬對BBB的保護作用 大多數情況下，自噬具有保護細胞的作用，自噬對BBB的有益作用與自噬如何被誘導以及自噬發生在何種細胞內相關。當細胞營養被剝奪或處于缺氧狀態下，自噬被激活并對緊密連接蛋白-5(claudin-5)進行再分配，claudin-5是BBB形成緊密連接的關鍵分子，可以封閉細胞間隙并維持細胞旁屏障[8]，從而維持BBB正常的生理功能[9-10]。Engelhardt等[11]探究BBB相關細胞在缺血缺氧條件下的反應差異時發現，周細胞和星形膠質細胞可通過激活自噬途徑來調控其自身的存活，由此推測，自噬可能是周細胞和星形膠質細胞對缺血缺氧損傷的一種適應性手段，其機制是通過分解現有的細胞質前體促進受損線粒體的清除和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的再生，但仍需深入研究其潛在機制。

一些化合物誘導的自噬對BBB具有保護和修復作用。例如，葡萄糖代謝過程中產生的反應性代謝產物甲基乙二醛引起的自噬可保護BMECs免受損傷，有助于維持BBB的完整性[12]；黃芩苷是一種神經保護劑，可減輕腦水腫，從而減輕BBB的破壞，其神經保護機制亦是通過激活自噬因子實現的[13]；富含橄欖油的特級初榨橄欖油(extra-virgin olive oil，EVOO)改善BBB的緊密性也是通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)途徑誘導自噬實現的[14]。

自噬可減輕腦損傷引起的BBB破壞。木犀草素是類黃酮家族的一員，被證實在創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)后可激活自噬，減少促炎因子IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表達量，減輕神經元變性，進而減輕TBI引發的腦水腫和對BBB的破壞[15]。相反，一些對BBB有害的物質通過抑制自噬而發揮損傷BBB的作用。研究發現，腫瘤壞死因子受體相關因子6通過抑制自噬和促進氧化應激而加重蛛網膜下腔出血，加重早期腦損傷程度，而早期腦損傷主要包括BBB損傷、神經元死亡和腦水腫[16]。

1.2 細胞自噬對BBB的損傷作用 自噬也可損傷BBB相關細胞，在這種情況下，抑制自噬反而可保護BBB的完整性。最近研究證實，人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)編碼的反式轉錄激活因子(transactivator of transcription，TAT)蛋白破壞BBB的緊密連接是通過誘導自噬實現的[17]。此外，血管基底膜外周細胞的存在對于維持BBB的完整性至關重要，而自噬是周細胞凋亡的上游過程。因此，通過sigma-1受體激動劑抑制自噬可明顯提高周細胞存活率，維持BBB的完整性[18-22]。氧糖剝奪(oxygen–glucose deprivation，OGD)誘導的自噬可導致腦內皮細胞功能障礙、BBB通透性增加[23]。Wu等[24]探討了線粒體分裂抑制劑1(Mdivi-1)在TBI后的自噬和線粒體自噬中的潛在作用機制，發現Mdivi-1可減緩TBI介導的BBB破壞和細胞死亡，且部分是通過抑制異常自噬和激活線粒體自噬實現的。

一氧化氮(NO)、小凹蛋白1(caveolin-1)與自噬體相互作用，在長時間缺血條件下可誘導claudin-5降解，破壞BBB的完整性，其部分機制是NO作為一個觸發器，可促進caveolin-1將claudin-5傳遞給自噬體，隨后被溶酶體降解[25]。研究發現，硫化氫供體(NaHS)可抑制自噬，保護神經元免受凋亡，促進髓鞘化和軸突修復，維持BBB的完整性[26]。同樣，dl-3-正丁基苯酞(dl-3n-butylphthalide，Dl-NBP)也可通過抑制自噬而阻斷TJ蛋白丟失和神經元凋亡，發揮保護BBB的作用[27]。在體內試驗中，OGD誘導90 min后，再灌注16 mmol/L葡萄糖30 min，結果顯示高糖可顯著誘導自噬，加重BBB損傷；同樣，采用自噬激活劑雷帕霉素增強自噬可進一步導致緊密連接蛋白1(zonula oc-cludens-1，ZO-1)表達降低或再分配，從而增加BBB的通透性[28]。3 xTg-A D 小鼠腦血管、胰島素受體-β(i n s u l i n receptor-beta，IR-β)和低密度脂蛋白受體相關蛋白-1(lipoprotein receptor-related protein-1，LRP-1)水平降低與自噬標記微管相關蛋白1輕鏈3(light chain 3，LC3)水平升高相關，但IR-β和LRP-1也在形成BBB的腦毛細血管內皮細胞(brain capillary endothelial cells，BCEC)中表達，提示自噬可能參與破壞BBB[29]。

1.3 BBB誘導細胞自噬 一些病原菌或有害物質損傷BBB時，BBB本身可能會通過某些途徑誘導自噬。B群鏈球菌(group BStreptococcus，GBS)感染期間，BBB內皮細胞激活的自噬有助于限制內皮細胞內微生物的生長和繁殖[30]。砷對于發育中的大腦具有神經毒性，砷暴露可引起BBB通透性增加，Manthari等[31]在不同周齡小鼠的飲用水中加入不同劑量的三氧化二砷，發現TJ蛋白(Occludin、Claudin、ZO-1和ZO-2)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)及p62的mRNA表達水平明顯降低，Occludin蛋白表達水平明顯降低，Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5和Atg12的mRNA和蛋白表達水平升高；透射電鏡超微結構分析顯示，在產后21 d和42 d，高劑量砷暴露小鼠的大腦皮質和海馬出現自噬小體和空泡化軸突。以上結果表明，大腦皮質和海馬中不完整的BBB可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路且以周齡依賴的方式促進砷的轉移并誘導自噬。但BBB誘導的自噬是否有助于增強宿主細胞的防御作用尚待進一步研究證實。

2 缺血性腦損傷中自噬對BBB的作用

在缺血性腦損傷時發生的自噬對BBB發揮著雙重作用，包括保護作用和損傷作用，具體發揮哪種作用取決于自噬的發生情況、研究對象的患病情況以及對研究對象進行的基因編輯。

2.1 腦缺血再灌注損傷時誘導的BMECs自噬對BBB的保護作用 腦缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)引起的BMECs損傷是BBB破壞的初始階段，可導致缺血性腦卒中患者預后不良。研究證實，缺血性腦卒中時的自噬BMECs具有保護作用[32]。例如，長鏈非編碼RNA MALAT1可通過增強BMECs的自噬發揮保護BBB的作用，其機制是MALAT1直接與miR-26b結合，下調miR-26b的表達，進而逆轉miR-26b對BMECs自噬和存活的抑制作用，參與促進miR-26b靶蛋白ULK2的表達[33]。Shi等[34]發現，沉默組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 9，HDAC9)基因可減輕腦卒中時的腦損傷，進一步分析顯示，HDAC9可加重腦缺血再灌注損傷時的BMECs損傷。此外，研究人員進一步發現，HDAC9能夠抑制自噬，且與內皮細胞功能障礙有關。上述結果表明，腦缺血再灌注損傷時沉默HDAC9基因可促進自噬，這對BBB通透性具有保護作用。

2.2 缺血性腦損傷時自噬對BBB的損傷作用 自噬因氧和葡萄糖被剝奪而增強，BBB成分claudin-5被腦血管內皮細胞的自噬溶酶體降解，表明自噬能夠加重BBB損傷[15]。Wei等[35]基于自噬抑制功能恢復的觀察結果證實，糖尿病小鼠腦缺血期間自噬增強是導致BBB過度破壞的原因。在NF-JB p50基因敲除小鼠中觀察到自噬和BBB損傷增加，抑制自噬可逆轉這些現象，且自噬可調節核因子κB導致的缺血性神經元和血管損傷[36]。

3 自噬在細菌感染BBB中的作用

3.1 自噬調節BBB細胞防御機制阻止GBS入侵和產毒 Cutting等[30]發現，GBS感染導致GFP-LC3點狀分布增加，內源性LC3-Ⅱ和p62周轉水平增高，這是主動自噬通量的兩個標志性指標，證實GBS感染可誘導自噬。感染GBS突變株實驗發現，GBS侵襲和GBS打孔β-溶血素/細胞溶素(β-hemolysin/cytolysin，β-h/c)能夠激活自噬，GBS腦膜炎小鼠模型進一步證實了該結果，野生型GBS感染在腦組織中誘導的自噬水平高于β-h/c缺失突變體，使用ATG5敲除的成纖維細胞抑制自噬或siRNA介導的人腦微血管內皮細胞(human brain microvascular endothelial cells，hBMECs)自噬障礙都會促進細胞內GBS數量的恢復，然而，電鏡觀察結果顯示，盡管可見到GBS-LC3共定位，但在雙膜自噬結構中僅能觀察到少量的GBS，表明雖然自噬可以調節BBB細胞防御阻止GBS入侵和產毒，但GBS能夠積極地阻止自噬途徑以促進自身繁殖。

3.2 自噬在炭疽桿菌感染hBMECs中的作用 炭疽腦膜炎的發生是由于炭疽桿菌能夠穿越BBB，其感染主要取決于兩種炭疽毒素的表達，即致死毒素和水腫毒素。有研究發現，炭疽毒素的表達能夠誘導宿主hBMECs產生自噬，抑制炭疽桿菌在細胞內的存活。因此，當機體感染炭疽桿菌時，自噬在某種程度上起到免疫保護作用[37]。

3.3 自噬在大腸埃希菌K1感染hBMECs中的作用在大腸埃希菌K1侵襲hBMECs的過程中，hBMECs自噬水平增高可以降低細胞內細菌的存活率。研究發現，煙草煙霧中的核心成分尼古丁可通過激活NF-κB和PI3K/Akt/mTOR信號通路來抑制大腸埃希菌K1感染誘導的hBMECs自噬，導致BBB受損，增高新生兒腦膜炎的發病率[38]。

4 自噬參與藥物、毒素穿越BBB而發揮作用

4.1 自噬參與藥物穿越BBB 細胞自噬是一種保守的依賴溶酶體的降解途徑，作為一種細胞保護機制，其在多種腫瘤細胞中可引起治療抗性[39-40]。研究發現，羥基氯喹可以抑制自噬過程中自噬體與溶酶體的結合，從而增強酪氨酸激酶抑制劑ZD6474的抗膠質瘤作用。然而，ZD6474在體內的非選擇性分布和羥基氯喹穿越BBB時的低穿透能力限制了其在膠質瘤治療中的臨床應用。研究人員將ZD6474和羥基氯喹共同包入R6dGR肽修飾的脂質體(R6dGR peptide-modified liposomes，R6dGR-Lip)中，明顯提高了羥基氯喹穿越BBB的能力。因此，R6dGR-Lip負載羥基氯喹能夠更有效地阻斷膠質瘤細胞的自噬通量，從而發揮ZD6474對膠質瘤的治療作用[41]。紫外線吸收劑二苯甲酮-3(benzophenone-3，BP-3)是各種個人護理用品中使用最廣泛的化學物質。研究表明，小鼠出生前暴露于BP-3(使用環境相關劑量)會損害自噬體和自噬相關因子，同時BP-3對BBB具有良好的滲透性，但是自噬在BP-3穿越BBB中的作用仍需要進一步探討[42]。

4.2 自噬參與毒素穿越BBB T-2毒素是由多種真菌產生的單端孢霉烯族毒素之一，是食品和動物飼料中常見的污染物，也存在于加工過的谷物產品中，具有神經毒性作用。T-2毒素可在體內通過BBB，引起腦損傷和垂體損傷。研究發現，在T-2毒素處理后，大鼠腦內存在明顯的自噬現象，且垂體細胞凋亡明顯，表明T-2毒素的神經毒性作用與其能夠穿越BBB以及自噬過程有關[43]。

5 自噬調節劑穿越BBB用于疾病的治療

5.1 自噬抑制劑穿越BBB用于疾病的治療 自噬是一種依賴于溶酶體降解和細胞存活的過程，由于其在DNA損傷中的作用而成為癌癥治療的新靶點[44]。研究表明，抑制自噬可以提高腫瘤細胞的放射敏感性[40,45-46]。目前，自噬抑制劑已被證實能夠提高放射性治療膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)的療效[47]。然而由于BBB的存在，大多數自噬抑制劑并不能有效地使GBM患者受益。有研究發現，三氟拉嗪(trifluoperazine，TFP)能夠干擾溶酶體的酸化，抑制自噬。此外，TFP可抑制P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的表達，這可能有助于藥物進入大腦和GBM中，從而發揮作用。此外，TFP治療削弱了放射治療后DNA損傷的修復，為TFP聯合放射治療GBM提供了理論依據[48-49]。

5.2 自噬誘導劑穿越BBB用于疾病的治療 研究人員設計并合成了Qu修飾的P-80穩定AuPd核殼結構(Qu@P-80@AuPd)，作為自噬誘導劑，其可加速清除細胞內的β淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)，保護細胞免受Aβ誘導的損傷，并有效地通過BBB。因此，Qu@P-80@AuPd可能成為治療阿爾茲海默病的潛在自噬誘導劑[50]。此外，最近研究表明，自噬促進劑雷帕霉素可作為治療阿爾茲海默病藥物的成分之一，能夠穿越BBB在病灶處發揮重要作用：可通過促進細胞自噬加速Aβ和磷酸化Tau蛋白的降解，還可通過抑制NO的合成減輕阿爾茲海默病病灶的炎癥，減輕氧化應激反應，在阿爾茲海默病的治療中發揮重要作用[51]。

6 總結與展望

自噬在BBB生理學和相關疾病中的重要作用逐漸受到關注，然而自噬在BBB中的確切生物學效應和潛在機制尚未闡明，針對自噬對BBB受損后的修復治療策略仍然處于假設階段。近年來，細胞的自噬效應引起了人們極大的興趣，越來越多的數據證實細胞自噬與BBB關系密切，兩者相互影響、相互作用。BBB可誘導細胞自噬，調節BBB相關細胞的損傷。腦缺血可導致細胞自噬的發生，細胞自噬適度激活有利于BBB相關細胞的修復，但是細胞自噬激活過度或不足亦可導致細胞凋亡，加重BBB損傷。同時，細胞自噬在防止病原體等有害物質穿越BBB、加速藥物穿越BBB發揮作用等方面也起著重要作用。因此，合理利用自噬這把“雙刃劍”將有助于治療和預防BBB損傷相關的多種神經系統疾病，并為腫瘤等疾病的治療提供新思路。