HLA-G 3′UTR基因多態性與精神分裂癥發生風險的相關性研究

喬瑞娟 張守亮 張晨光

精神分裂癥是嚴重的慢性精神性疾病，其主要癥狀為幻覺、妄想、人格障礙和認知功能障礙[1]，給患者、親屬及整個社會帶來很大的痛苦和負擔。目前，精神分裂癥的病因仍不明確，遺傳、心理和環境因素均參與精神分裂癥的發病，其中遺傳因素解釋70%～90%的表型變異[2]，通過全基因組關聯分析，目前已經發現許多與精神分裂癥相關的易感基因，主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)已經成為一個重要的研究對象，它是患精神分裂癥最強的風險基因之一[3-4]。人類白細胞抗原G(human leucocyte antigen protein G，HLA-G)位于6p21.31上，是一種非經典的MHC I類分子，其在胚胎發育過程中發揮重要作用，既往研究[5-6]表明HLA-G的多態性與病毒感染、子癇前期、炎癥、腫瘤的發展、移植及自身免疫性疾病相關，HLA-G的異常表達會導致妊娠并發癥，從而增加后代患精神分裂癥的風險。Rajasekaran等[7]研究表明，攜帶HLA-G 14 bp ins/ins基因型患精神分裂癥風險顯著增加，由此推斷HLA-G基因多態性很有可能與精神分裂癥發生風險相關。人類白細胞抗原G 3′非翻譯區(human leucocyte antigen protein G 3′untranslated region，HLA-G 3′UTR)通過影響mRNA的加工和穩定性在HLA-G的表達調控中發揮重要作用，目前國內相關研究較少，本研究通過檢測健康人群和精神分裂癥患者HLA-G 3′UTR基因多態性，探討HLA-G基因多態性與精神分裂癥發病的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2017年10月被新鄉醫學院第二附屬醫院確診為精神分裂癥的302例患者作為病例組。精神分裂癥的診斷均符合《國際疾病和分類》 簡稱ICD-10(第10版)精神分裂癥[8]的診斷標準，排除標準：①有嚴重的軀體疾病者；②妊娠期或哺乳期的女性；③合并其他神經系統疾病者。對照組由該院同時期327例健康體檢者組成，排除標準：①有精神性疾病家族史者；②有不良孕產史女性者；③有神經系統疾病病史者。兩組對象均為漢族，年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。本研究經新鄉醫學院第二附屬醫院倫理委員會批準(批準文號：XYLL-20195025)，事先獲得參與本研究的每位患者及其監護人和健康者的知情同意，自愿參與本項研究。

表1 兩組對象一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 外周血基因組DNA提取 使用北京康為世紀生物科技有限公司生產的外周血基因組提取試劑盒分離出全血DNA，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增 采用PCR擴增HLA-G3′UTR，引物序列如下：F：5′-GTTGAGGGGAACAGGGGACAT-3′；R：5′-AAAGTTCTCATGTCTTCCATTT-3′，擴增產物為489 bp。PCR擴增體系共25 μL，包括2×PFUMasterMix 12.5 μL、去離子水10.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA 1 μL。擴增條件為95 ℃ 5 min變性，94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共循環33次，最后在72 ℃延伸10 min。將擴增產物樣本送北京金維智公司進行Sanger測序。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析，偏態分布計量資料用M(P25，P75)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料用頻數或率表示，組間比較采用χ2檢驗。通過DNAstar V7.0 軟件分析各個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位點，使用SHEsis軟件進行哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg，H-W平衡)、等位基因和基因型頻率、連鎖不平衡及單倍型檢測。采用logistic回歸分析對4種遺傳模型(共顯性、顯性、隱性和超顯性)進行分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組間HLA-G 3′UTR基因多態性位點等位基因及基因型分布情況 在HLA-G 3′UTR區域共檢測出10個多態性位點，分別為14 bp ins/del、+3003 C/T、+3010 G/C、+3027 C/A、+3035 C/T、+3058 G/A、+3072 C/A、+3142 C/G、+3187 A/G、+3196 C/G，僅有14 bp ins/del、+3035 C/T、+3058 G/A這3個位點符合H-W平衡(P>0.05)。

兩組間等位基因分布相比，+3035 C/T位點等位基因分布差異有統計學意義(OR=1.522，95%CI：1.146～2.022，P=0.004)，但兩組間14 bp ins/del和+3058 G/A位點等位基因頻率差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。對照組和病例組患者中，14 bp ins/del、+3035 C/T、+3058 G/A位點的基因型分布最高頻率分別為純合del/del、CC和GG，+3035 C/T基因型分布在病例組和對照組間差異有統計學意義(P=0.019)，而14 bp ins/del、+3058 G/A位點基因型分布在兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 兩組HLA-G 3’UTR基因多態性位點等位基因分布情況[例(%)]

表3 兩組HLA-G 3’UTR基因多態性位點基因型分布情況[例(%)]

2.2 +3035 C/T位點不同遺傳模型與精神分裂癥易感性的關聯 +3035 C/T位點的共顯性模型中，與CC基因型相比，CT基因型(OR=1.450，95%CI：1.019～2.062，P=0.039)和TT基因型(OR=2.275，95%CI：1.064～4.867，P=0.030)與精神分裂癥的易感性相關。+3035 C/T位點的顯性模型[(CT+TT) 比 CC，OR=1.547，95%CI：1.108～2.161，P=0.010)]與精神分裂癥的易感性相關。而在+3035 C/T位點的隱性模型中[(CT+CC)比 TT]和超顯性模型中[CT 比 (CC+TT)]，兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 +3035 C/T位點不同遺傳模型與精神分裂癥易感性的關聯情況[例(%)]

2.3 HLA-G 3’UTR基因多態性位點連鎖不平衡和單倍型分析 14 bp ins/del與+3035 C/T之間D′與R2分別為(0.24，0.20)；14 bp ins/del與+3058 G/A之間D′與R2分別為(0.79，0.20)，+3035 C/T與+3058 G/A之間D′與R2分別為(0.23，0.00)。見圖1。

圖1 HLA-G 3’UTR 3個SNP連鎖不平衡分析

通過對這3個位點進行單倍型分析，共得到9個單倍型，對于單倍型頻率小于3%的單倍型不予比較分析，剩余4個單倍型，分別為H1(DCG)、H2(DTG)、H3(ICG)、H4(ITG)，病例組和對照組主要的單倍型均為H1(DCG)，兩組間單倍型H1及H2頻率分布差異無統計學意義(P>0.05)，單倍型H3(ICG)和單倍型H4(ICG)在兩組中的分布差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 兩組HLA-G 3’UTR單倍型分布

3 討論

精神分裂癥是一種復雜的精神疾病，涉及多種遺傳和環境因素的相互作用，最近的全基因組關聯研究[9-10]數據表明，常見的多基因變異與患精神分裂癥風險顯著相關。Liu等[11]發現GABRB3 5′啟動子區rs4906902和rs8179184與精神分裂癥相關，C-A單倍型可能增加患精神分裂癥的風險;Azari等[12]發現GRM7基因rs779867位點的GG基因型與伊朗精神分裂癥的發病風險相關，該SNP在共顯性和顯性模型中與精神分裂癥發病相關。除遺傳變異外，由于暴露于環境逆境亦可導致精神分裂癥[13-14]，這些研究涉及免疫相關基因，這些基因在基因與環境的相互作用中起著至關重要的作用，MHC已被確定為精神分裂癥的相關的最強危險因素之一[3-4]。

位于6 p 21.31上的HLA-G是非經典的MHC-I類分子，HLA-G作為一種重要的免疫調節分子，通過其免疫調節功能，在各種癌癥、自身免疫性疾病、病毒、寄生蟲感染的發病機制中發揮作用。與此同時，HLA-G被證明與各種精神疾病有關，例如“低表達”(HLA-G 14bp Ins/Ins)基因型在冬季出生的雙相障礙患者中較少見，提示14 bp Ins/Ins可能作為雙相障礙的保護性基因型[15]。此外，14 bp Ins/Ins基因型和14 bp Ins等位基因頻率在自閉癥譜系兒童以及他們的母親中顯著增高[16]。Rajasekaran等[7]發現14 bp Ins/Ins基因型具有很高的患精神分裂癥風險。HLA-G基因在5′URR(上游調控區)和3′UTR(非翻譯區)有許多多態性位點。5′URR的多態性影響HLA-G基因的轉錄，而3′UTR的多態性影響mRNA的加工和穩定性。HLA-G的表達受3′UTR的多態性調控，目前研究較多的多態性位點為14 bp、+3187 A/G和+3142 C/G，在此區域還有其他多態性位點如+3010 G/C、+3072 C/A、+3035 C/T、+3058 G/A等，關于這些位點與精神分裂癥的研究相對較少，故本研究旨在研究HLA-G3′UTR基因多態性與精神分裂癥的關系，為精神分裂癥的發病風險提供理論依據。

本研究發現，在HLA-G 3′UTR這個區域共檢測出10個多態性位點，僅14 bp ins/del、+3035 C/T、+3058 G/A這3個位點符合H-W平衡。通過對兩組間等位基因和基因型分布進行分析發現，14 bp ins/del位點基因多態性與精神分裂癥的風險無關，與Rajasekaran 等[7]的研究不一致，出現這種現象的原因可能是由于研究的人群和種族不同，導致基因多態性位點分布不同。本研究發現，+3058 G/A位點基因多態性與精神分類癥的風險無關，而+3035 C/T位點基因多態性與精神分類癥的風險相關，攜帶T等位基因的個體發生精神分裂癥的風險約是攜帶C等位基因的1.522倍。通過+3035 C/T位點各個遺傳模型研究發現，+3035 C/T位點的共顯性模型中，攜帶CT基因型和TT基因型的個體發生精神分裂癥的風險約是攜帶CC基因型個體的1.450和2.275倍。+3035 C/T位點的顯性模型(OR=1.547，95%CI：1.108～2.161，P=0.010)與精神分裂癥的易感性相關。在人類基因組中常存在連鎖不平衡現象，可以用來定位參與疾病診療的相鄰變體，通過對HLA-G的3個多態性位點進行分析，未發現這3個位點具有連鎖現象(R2<0.8)。通過對HLA-G 3′UTR單倍型分析發現，單倍型H3對精神分裂癥的發病具有保護作用(OR=0.663，95%CI：0.508～0.866，P=0.002)，而單倍型H4(ICG)可以增加患精神分裂癥的風險(OR=1.622，95%CI：1.098～2.397，P=0.014)。

綜上所述，HLA-G +3035 C/T位點基因多態性與精神分裂癥的易感性相關，等位基因T可能是發生精神分裂癥的易感基因，從基因水平上研究了精神分裂癥可能的發病原因，可能為精神分裂癥的發病機制提供理論基礎。本研究也存在一定局限性：本研究為單中心研究，且本研究的樣本量有限，可能會存在樣本偏倚，因此需要在多個地區、不同民族及人群中進行驗證，以此來降低研究結果的偶然性。此外，本次研究缺乏患者的生存數據， HLA-G 3′UTR多態性是否與精神分裂癥患者的生存有關需要進一步研究。