細胞焦亡及其在阿爾茨海默病中的研究進展

杜 姍 米 顏 張 肖 張 潔 牛曉晨 張 萌 程 葉 謝 瑱 張格娟 史文珍 田 曄

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一種復雜的多因素疾病，主要發生于老年群體，通常起病相對隱襲，進展緩慢。程序性細胞死亡是細胞接受內外源刺激后，為了維持內環境穩定而發生的一種主動性消亡過程[1]。程序性細胞壞死的表現形式包括凋亡、細胞焦亡、自噬、壞死性凋亡、鐵死亡。其中，細胞焦亡是一種高度促炎性細胞程序性死亡，常伴隨著細胞膜的破裂及炎癥因子的釋放，它是機體感知內外源危險信號后啟動的一種非特異免疫反應，在機體防衛過程中起重要保護作用。然而，細胞焦亡的過度激活同樣可損害正常組織和細胞。近年來，有研究[2]報道，細胞焦亡在AD發病過程中發揮重要作用，尤其是其介導的神經炎癥反應在AD的發生發展中扮演著關鍵角色。因此,靶向調節細胞焦亡可能影響AD的進程，深入了解細胞焦亡對研發AD的治療藥物具有重要意義。

1 細胞焦亡

1.1 細胞焦亡的發現與定義 1992年，Zychlinsky等[3]首次在感染福氏志賀菌的巨噬細胞中觀察到一種既具有凋亡特征又具有壞死特征的依賴半胱氨酸天冬酶(Caspase)的細胞死亡形式。2001年，Cookson等[4]繼而發現這種Caspase-1依賴性細胞死亡與凋亡和壞死有著明顯的區別，并將這種促炎性、裂解性程序性細胞死亡方式命名為細胞焦亡。進一步研究發現Caspsae-4/5/11的N-末端結構域同樣可以直接識別和結合細菌脂多糖，引起蛋白酶體寡聚并引發細胞焦亡[5]。2015年，邵峰課題組鑒定到細胞焦亡膜孔形成關鍵分子消皮素D蛋白(gasdermin D，GSDMD)，并解析了gasdermin蛋白家族分子功能，隨后該研究組報道Caspase-3可以水解Gasdermin E(GSDME)完成非感染性的細胞焦亡，將細胞焦亡的定義改寫[6]。因此，到2018年，細胞死亡命名委員會將焦亡定義為依賴于gasdermin蛋白家族成員形成質膜孔的調節性細胞死亡方式，通常但不總是由炎性半胱氨酸天冬酶激活所致[1]。

1.2 細胞焦亡的分子機制 細胞焦亡的發生依賴于炎性Caspase和gasdermin蛋白家族，gasdermin蛋白家族被激活的Caspase切割并釋放出其N端結構域，該結構域結合膜脂并在細胞膜上打孔，導致細胞滲透壓的變化，進而使細胞發生腫脹直至細胞膜破裂[7]。

1.2.1 經典的依賴Caspase-1細胞焦亡通路 細胞內傳感器通過檢測病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)、損傷相關分子模式(damage associated molecular pattern，DAMPs)、膜擾動、滲透失衡和離子外泄等刺激來激活細胞焦亡。當焦亡被激活時，炎癥小體傳感器寡聚并招募具有熱蛋白結構域(pyrin domain，PYD)和半胱氨酸天冬酶激活募集結構域(caspase activation and recruitment domain，CARD)的凋亡相關斑點蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)。ASC一方面通過PYD-PYD結構方式與模式識別受體(pattern recognition receptor,PRRs)結合，另一方面通過CARD-CARD結構方式進一步招募pro-Caspase-1，從而完成炎癥小體的組裝。此外，ASC在炎癥復合物中的募集可形成1～2 μM大小的ASC斑點，ASC斑點釋放到細胞外空間進一步增強炎癥反應[8]。炎癥小體復合物作為Caspase-1激活的平臺可繼續招募和激活pro-Caspase-1，活化的Caspase-1一方面切割非活性的 pro-IL-1β和pro-IL-18產生成熟的IL-1β和IL-18，另一方面作用于GSDMD，裂解其產生一個具有內在成孔活性的GSDMD-N端，GSDMD-N端功能區域在激活后富集到細胞膜并進一步形成內徑10～20 nm的孔洞，使成熟的IL-1β和IL-18分泌到細胞外環境中，從而募集更多的炎癥細胞，進一步放大炎癥反應，引起細胞焦亡[9]。

1.2.2 非經典的Caspase-11/-4/-5依賴的細胞焦亡通路 Pro-Caspase-11(小鼠)、Pro-Caspase-4/Pro-Caspase-5(人體)通過其CARD結構域與革蘭陰性菌細胞壁中的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)直接相互作用組裝成非典型炎癥小體，并激活前者的蛋白酶活性，活化的Caspase-4/5/11進一步水解 GSDMD 蛋白并誘導細胞焦亡的發生[10]。同時，Caspase-11也通過激活NLRP3-ASC-Caspase-1途徑促進IL-1β/18的成熟和釋放。研究[11]表明，活化的Caspase- 4/ 5/ 11可激活細胞膜通道蛋白Pannexin-1，將ATP釋放到細胞外，釋放的ATP可激活細胞膜上對ATP敏感的P2X7通道，P2X7通道打開，進一步破壞細胞膜的完整性，也可誘導細胞焦亡。

1.2.3 依賴Caspase-3和Caspase-8的細胞焦亡通路 Hu等[12]發現化療藥物可以通過BAK/BAX-caspase-3-GSDME信號通路裂解GSDME誘導細胞焦亡，并且通過Caspase-3切割的GSDME可將化療誘導的細胞凋亡轉變為細胞焦亡。研究[13]發現腸道上皮細胞的CASP8(C362A)通過活化ASC，活化蛋白酶caspase-1，從而誘導細胞焦亡。有研究[14]發現耶爾森菌感染巨噬細胞后，其毒力蛋白YopJ通過抑制轉化生長因子β活化激酶1(TGF β-activated kinase, TAK1)活性，觸發受體相互作用絲氨酸-蘇氨酸蛋白1(RIP1)-Caspase-8依賴的GSDMD活化，GSDMD活化增加膜通透性，使K+外流增多，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3)炎癥小體被激活，導致細胞因子的成熟和釋放，從而促進焦亡的發生。

1.2.4 不依賴于Caspase家族的細胞焦亡通路 2020年Zhou等[15]發現，細胞毒性淋巴細胞(如CTLs、NK細胞等)中的絲氨酸蛋白酶Granzyme A可以經穿孔素進入靶細胞，通過水解Gasdermin B分子Lys229/Lys244位點誘導靶細胞發生焦亡。亦有研究[16]表明，在中性粒細胞中，N-GSDMD被轉運到嗜藍顆粒導致中性粒細胞彈性酶滲漏到胞質中，引起GSDMD的二次裂解，介導中性粒細胞發生焦亡。

2 AD

2.1 AD概況 AD是一種起病隱匿的慢性進行性的神經退行性疾病，臨床特征包括認知和行為障礙、執行能力下降及精神行為異常等[17]。以β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)過度沉積所形成的神經炎性斑和過度磷酸化的tau蛋白所致的神經元纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)為主要病理改變，二者均與炎癥反應密切相關，且共同導致神經元變性和認知功能下降[18]。

2.2 AD的發病機制 隨著對AD神經生物學機制研究的不斷深入，各種可能的發病機制相繼被提出，包括中樞膽堿能損傷學說、Aβ學說、tau蛋白學說、炎癥損傷學說、興奮性神經損傷學說、基因相關性學說及“微生物-腦-腸軸”學說等[19]。除此之外，教育程度、膳食因素、代謝水平、神經血管因素在AD發病中同樣占有重要地位。

3 細胞焦亡與AD

AD是最常見的神經退行性疾病之一，該類疾病共同病理特征之一是中樞神經系統中異常蛋白的聚集，可引起線粒體損傷、ROS產生、溶酶體破裂和組織蛋白酶釋放，最終可導致小膠質細胞內細胞焦亡的過度激活。細胞焦亡產生的促炎細胞因子過表達又可加重中樞神經系統的慢性炎癥反應，進一步導致神經變性[20]。相反，細胞焦亡通路關鍵成分的缺乏可抑制小膠質細胞內細胞焦亡的過度激活及神經變性[21]。隨著對AD及細胞焦亡機制研究的不斷深入，大量證據表明，AD與細胞焦亡存在密切關系[20-21]，以下主要闡述細胞焦亡在AD中的可能機制，以期為AD的診斷和治療提供新的思路。

3.1 細胞焦亡與Aβ學說 Aβ異常聚集沉積所形成的神經炎性斑被認為是引起AD的主要病理特征，生理狀態下，腦內Aβ的產生和清除處于動態平衡，然而，在AD病理狀態下，過多的Aβ不能被及時清除從而使這種平衡傾向于Aβ的沉積。Aβ的存在形式包括可溶性Aβ單體、低分子量Aβ寡聚體、Aβ原纖維和不可溶性Aβ纖維，其中可溶性Aβ寡聚體是發揮神經毒性的關鍵分子，其通過與神經細胞表面受體結合造成包括細胞內Ca2+穩態的破壞、軸突運輸功能障礙和線粒體功能受損、炎癥因子釋放、tau蛋白過度磷酸化在內的神經細胞功能損害，參與AD的發生[22]。

隨著研究的不斷深入，越來越多的研究發現Aβ與細胞焦亡存在著密切關系。Liang等[23]研究揭示，在體外實驗中，Aβ纖維通過激活小膠質細胞中的NLRP3炎癥小體進而促進其釋放成熟的IL-1β，誘導細胞焦亡并進一步放大炎癥反應；在體內實驗中，該團隊研究者還發現AD模型小鼠的大腦中高表達細胞焦亡相關分子NLRP3炎癥小體和Caspase-1，而NLRP3或Caspase-1基因缺失可大大改善小鼠的空間記憶能力并增強Aβ的清除率。另外，研究[24]發現NLRP3炎癥小體不僅可以被Aβ纖維激活，而且還可以被低分子量Aβ寡聚體、Aβ原纖維激活，表明Aβ激活的小膠質細胞可能在Aβ沉積開始之前啟動中樞神經系統的先天免疫反應。此外，Tejera等[25]研究表明，在轉基因小鼠AD模型(APP/PS1)中，LPS誘導的慢性炎癥通過減少小膠質細胞攝取和清除Aβ而加劇了大腦中Aβ的沉積，敲除NLRP3炎性小體阻斷了這一作用，提示炎性小體介導了Aβ級聯反應。Aminzadeh等[26]進一步研究發現，Aβ可通過上調ROS的表達，從而通過瞬時感受器電位陽離子通道2介導的鈣離子內流而激活炎癥小體，釋放炎癥因子，從而參與AD的發生。此外，Venegas等[27]發現，在海馬內注射ASC斑點可導致APP/PS1小鼠腦內Aβ錯誤折疊、聚集和炎性斑塊形成，并且ASC斑點以朊病毒樣的方式與Aβ結合作為炎癥驅動的交互因子促進Aβ病變在腦區內或腦區之間的擴散，而ASC基因敲除或聯合應用抗ASC抗體可阻斷APP/PS1小鼠腦中Aβ病變的發生和擴散。由此可見，無論體內還是體外研究都表明細胞焦亡和ASC斑點參與了Aβ沉積和疾病進展的早期階段。細胞焦亡可能具有作為治療靶點的潛力，可以減少Aβ沉積和疾病病理的擴散。

3.2 細胞焦亡與tau蛋白學說 AD的病理特點還包括過度磷酸化的tau蛋白所致的NFTs，正常情況下，腦中tau蛋白可與微管結合，對于提高微管蛋白穩定性、維持軸突正常轉運等功能尤為重要。但過度磷酸化的tau蛋白喪失促微管組裝的生物學活性，使微管解聚、軸突轉運障礙，進而導致神經元變性，造成AD的發生[22]。

Stancu等[28]發現tau蛋白具有類似于Aβ激活NLRP3炎癥小體的機制，tau蛋白由小膠質細胞吞噬后破壞溶酶體的穩定性，釋放組織蛋白酶B，與炎癥小體結合參與其激活，并以ASC依賴的方式誘導IL-1β的分泌。該團隊進一步研究發現抑制NLRP3和敲除ASC可通過抑制tau病變在大腦的播散而延緩AD的進展。另外，研究[18]發現tau單體和低聚物都會顯著上調ASC和NLRP3介導下的IL-1β和Caspase-1的釋放水平，從而進一步放大炎癥反應，而NLRP3抑制劑CRID3可以延緩這種效應。在研究炎癥小體促進tau蛋白病變發生的具體機制時，他們發現ASC或NLRP3基因缺失可通過誘導tau激酶CaMKII-α和GSK-3β的下調和抑制tau磷酸酶蛋白磷酸酶2A的上調，從而減輕tau蛋白過度磷酸化和聚集。表明NLRP3炎癥小體通過調控tau蛋白相關激酶和磷酸酶來調控其活性和病變發生。之后，為了探究Aβ是否可通過活化NLRP3炎癥小體促進tau病變發生，該團隊分別在Tau22，Tau22/Asc-/- 和Tau22/Nlrp3-/-小鼠海馬中注射Aβ后發現Tau22小鼠tau蛋白的高度磷酸化，而Tau22/Asc-/-和Tau22/Nlrp3-/-小鼠tau蛋白磷酸化水平正常。表明Aβ誘導tau病變發生依賴于NLRP3炎癥小體。綜上所述，細胞焦亡的激活與AD中tau蛋白過度磷酸化高度相關，因此，靶向抑制細胞焦亡可能對于延緩AD的進展具有重要意義。

3.3 細胞焦亡與炎癥損傷學說 AD患者腦內除了檢測到Aβ沉積和NFTs外，還可以觀察到以Aβ神經炎性斑周圍聚集激活的小膠質細胞和星形膠質細胞為特征的慢性神經炎癥。小膠質細胞和星形膠質細胞是中樞神經系統中的主要先天免疫細胞，一般情況下，小膠質細胞可被PAMPs、DAMPs激活，進而遷移至損傷部位分泌促炎因子和其他免疫調節因子發揮免疫保護作用。然而，其長期過度激活會釋放過多的炎癥因子，導致神經炎癥的發生，從而造成進行性神經元喪失，這個過程可由炎癥小體啟動。研究[29]表明在AD模型小鼠及AD患者腦內發現大量活化的小膠質細胞，且細胞焦亡下游促炎分子IL-1β、IL-18顯著增多，表明AD患者腦內存在細胞焦亡相關的神經炎癥。除此之外，在AD相關輕度認知功能障礙患者和早發AD患者腦組織中也檢測到細胞焦亡水平Caspase的高表達，表明細胞焦亡激活參與AD疾病進展的早期階段[30]。進一步研究表明IL-18可以通過CDK5和GSK-3β通路促進tau蛋白過度磷酸化，還通過上調BACE-1和PS-1的表達促進了Aβ淀粉樣變過程，IL-1β同樣可通過不同途徑導致tau蛋白過度磷酸化，降低神經元突觸素水平[31]。綜上所述，IL-18和IL-1β作為焦亡通路的下游促炎分子，在AD的發病中發揮著關鍵作用。因此，抑制焦亡通路的關鍵分子可能為AD的治療提供新的思路。

綜上所述，細胞焦亡作為先天免疫的重要組成部分，在AD的3個關鍵發病過程，即Aβ的沉積和擴散、tau蛋白的磷酸化、聚集和擴散以及神經炎癥中發揮著重要作用，因而，藥物抑制細胞焦亡的激活或靶向基因敲除可成為改善AD相關癥狀和減緩AD進展的潛在策略。

4 細胞焦亡調控機制相關的AD治療藥物

AD的發生可能是由神經元細胞焦亡異常亢進引起的，針對細胞焦亡相關調控機制的藥物均有望成為治療AD的新藥，比如靶向炎癥小體激活的上游信號、調控NLRP3轉錄表達、阻斷炎癥小體的組裝、抑制Caspase的活化、阻止Gasdermin的水解以及抑制焦亡通路下游促炎分子的成熟和分泌等。二氫楊梅素可以通過上調腦啡肽酶水平或將小膠質細胞中促炎M1表型轉化為抗炎M2表型來減弱NLRP3炎癥小體的激活并增強Aβ的清除[32]。荔枝多酚可通過抑制Aβ1 - 42誘導的小膠質細胞NLRP3和ASC的表達、Caspase-1的裂解和IL-1β的釋放來抑制細胞焦亡進而改善APP/PS1小鼠的空間學習和記憶功能[33]。白藜蘆醇通過下調NF-κB、IL-1β和NLRP3的水平減輕細胞焦亡及神經炎癥，發揮抗癡呆功能[34]。β-拉帕醌可通過降低NLRP3炎癥小體的mRNA水平、ROS的產生以及Caspase-1和IL-1β的蛋白表達來減輕焦亡及神經炎癥，改善AD相關的認知功能障礙[35]。此外，諸多研究表明傳統的中醫藥能有效抑制細胞焦亡，阻止AD疾病進程。Jin等[36]研究發現黃芩的主要生物活性成分黃芩苷可通過抑制NLRP3炎性小體激活和TLR4/NF-κB通路來減輕AD病理過程中小膠質細胞誘導的神經炎癥，進而改善AD小鼠模型的空間記憶功能障礙。Wang等[37]報道丁苯酞可以抑制硫氧還蛋白結合蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)和NLRP3之間的相互作用，并通過上調Nrf2水平抑制NLRP3炎性小體的激活，發揮保護作用。另外，五味子素[38]、特級初榨橄欖油[39]、胡黃連[40]等均能有效抑制細胞焦亡，發揮抗炎作用。但上述藥物改善神經炎癥的詳細機制尚未明確，仍有待進一步探索。

5 展望

AD是全球主要的醫療問題和社會問題之一。目前尚無有效的治療方法來改善AD患者的臨床癥狀。在過去的幾年里，細胞焦亡領域取得了重大進展。越來越多的證據表明，細胞焦亡過度激活可能是AD的關鍵調節因素，通過不同水平靶向抑制細胞焦亡的激活可減輕神經炎癥、改善相關癥狀和延緩AD病情的進展，對AD的防治具有重要意義。然而，仍存在一些問題：①細胞焦亡的調控過程中，Caspase在響應上游信號后如何活化，活化的Caspase又是如何特異地識別和切割GSDMD的精確分子機制仍然不清楚；②目前細胞焦亡在AD的診斷、治療及轉歸中的研究仍處于基礎實驗階段，將這些實驗數據轉化為臨床應用還需要進一步的研究；③由于細胞焦亡在各類細胞中的廣泛存在，如何調控神經細胞的焦亡以達到預期治療效果，以及在AD治療過程中如何避免其他組織細胞的焦亡，仍有待探索。期待隨著該領域研究的不斷深入，細胞焦亡在AD中的作用機制被進一步闡明，并向臨床應用轉化，為AD的防治帶來新希望。