液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中美羅培南的濃度及其在ICU膿毒癥患者治療藥物監(jiān)測中的應用

張偉東，張偉威，閻 彥，周靜芳，程業(yè)童，王 娜

(河北省秦皇島市第一醫(yī)院藥學部，河北 秦皇島 066000)

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應綜合征，嚴重威脅患者生命的安全，易導致重癥加強護理病房(intensive care unit,ICU)患者死亡。因此，有效控制感染是降低ICU膿毒癥患者病死率的關(guān)鍵。美羅培南具有抗菌譜廣、殺菌作用強、對絕大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定等特點，是治療重癥感染的一線藥物。早期的美羅培南經(jīng)驗性治療對改善膿毒癥患者的臨床癥狀、降低病死率具有重要意義。隨著美羅培南在臨床上的廣泛應用，導致耐藥菌株不斷增多[1-2]。2014—2019年，全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)監(jiān)測結(jié)果顯示：鮑不動桿菌和肺炎克雷伯菌對美羅培南的耐藥率逐年上升[3-4]。ICU膿毒癥患者多存在基礎疾病，易出現(xiàn)多重細菌感染，導致其生理、病理狀態(tài)迅速改變，使得美羅培南在其體內(nèi)的表觀分布容積、藥物清除率等藥代動力學參數(shù)與健康受試者存在較大差異。因此，開展美羅培南治療藥物臨床監(jiān)測對促進合理用藥、減少耐藥菌的產(chǎn)生具有重大意義。目前，人血漿中美羅培南濃度的檢測方法有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[5-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[10-11]和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)等[12]。但HPLC法分析時間較長，劉炎等[8]采用HPLC法結(jié)合截尾技術(shù)測定美羅培南血藥濃度，樣品分析時間為7 min；陳玲等[9]采用HPLC法檢測人血漿中美羅培南濃度，樣品分析時間約為5.6 min；劉洪川等[11]采用雙內(nèi)標LC-MS/MS法測定人血漿中美羅培南濃度，樣品分析時間為4 min；王曉雪等[12]采用UPLC-MS/MS法進行美羅培南和亞胺培南治療藥物監(jiān)測，單次樣品分析時間大于4 min。本文將建立一種快速、準確、簡便的LC-MS/MS法，并將該方法用于ICU膿毒癥患者美羅培南治療藥物的臨床監(jiān)測，為科學合理的個體化給藥方案的制定提供技術(shù)支持。

1 材 料 與 方 法

1.1藥品 美羅培南(批號：130506-201403；純度：87%)，內(nèi)標：卡馬西平(批號：100142-201706；純度：100%)，均購自于中國食品藥品檢定研究院。健康人空白血漿購自于秦皇島市第一醫(yī)院血液中心。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，購自于德國默克公司；水為超純水(18 Ω/cm2)。

1.2儀器 LC-30AD高效液相色譜儀(日本島津公司)，由中央控制器、自動進樣器(帶制冷功能)、在線脫氣機、二元高壓輸液泵、柱溫箱組等成； ATRAP 6500質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)，配電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI)；XS105DU十萬分之一天平(德國METTLER TOLED公司)；超純水Milli-Q系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.3色譜條件 色譜柱：Kinetex-C18 100A(2.6 μm,50 mm× 4 mm)；流動相：甲醇-1‰甲酸水溶液(60∶40,v/v)；流速：0.4 mL/min，等度洗脫；柱溫：40 ℃；進樣量：3 μL。

1.4質(zhì)譜條件 ESI，正離子模式檢測、多離子反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring, MRM)模式定量。ESI源噴霧電壓為4 500 V；離子源溫度為500 ℃；碰撞能量(collision energy, CE)分別為19,22 eV；用于定量分析的離子對分別為m/z 384→141(美羅培南)、m/z 237→194(內(nèi)標：卡馬西平)。

1.5溶液制備 美羅培南對照品溶液：取美羅培南對照品約10 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加水溶解、定容，得到0.87 g/L美羅培南儲備液，置于4 ℃冰箱中避光保存。分別精密量取一定量的儲備液適量，置于10 mL量瓶中，加水定容至刻度，得0.02、1、2、5、10、15、20、30 mg/L美羅培南標準曲線工作液。美羅培南低、中、高3個質(zhì)控工作液濃度分別為0.2、7、20 mg/L。內(nèi)標工作溶液制備：取卡馬西平對照品約10 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解、定容，配置成1.00 g/L內(nèi)標儲備液，于4 ℃冰箱中避光保存、備用。精密量取卡馬西平儲備液6 μL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋、定容，配制成0.6 mg/L的內(nèi)標工作液，于4 ℃冰箱中避光保存、備用。

1.6含藥血漿制備 取不同濃度美羅培南對照品儲備液適量，用空白血漿稀釋得0.02、1、2、5、10、15、20、30 mg/L標準曲線測試液，渦旋30 s，-20 ℃冰箱備用。另取不同濃度美羅培南對照品儲備液適量，加空白血漿，配制濃度為0.2、7、20 mg/L的美羅培南低、中、高質(zhì)控樣品，-20 ℃冰箱備用。

1.7樣本處理 取血漿樣品100 μL，置于2 mL 離心管中，加內(nèi)標溶液100 μL，渦旋混勻30 s，再加水100 μL，渦旋混勻1 min后，加蛋白沉淀劑乙腈1 mL，渦旋混勻1 min?；靹蚝笾糜? ℃離心機中，1×104r/min離心10 min。取上清液100 μL加純水900 μL混勻，取100 μL置于進樣瓶中，進樣3 μL分析。

1.8方法學考察

1.8.1專屬性 按1.7樣本處理方法，分別取6個不同來源的空白血漿, 加甲醇(代替內(nèi)標工作液)，得空白血漿色譜圖；另取空白血漿，分別測定：空白血漿+卡馬西平、空白血漿+美羅培南+卡馬西平、患者血漿+卡馬西平。

1.8.2標準曲線及定量下限 取含藥標準曲線血漿樣品按 “1.7樣本處理”方法操作，以美羅培南濃度(x)為橫坐標，美羅培南與內(nèi)標卡馬西平的峰面積比(y)為縱坐標，采用加權(quán)最小二乘法(加權(quán)系數(shù)為1/x2)進行線性回歸。標準曲線最低濃度點為定量下限。

1.8.3精密度與回收率 分別取美羅培南血漿質(zhì)控樣品(0.2、7、20 mg/L)各6份，按“1.7樣本處理”方法處理后，進行檢測，連續(xù)測定3 d，得日內(nèi)和日間精密度；分別配制低、中、高3個濃度的美羅培南質(zhì)控樣品各12份，6份用于提取前加入工作液和內(nèi)標，6份用于提取后加入工作液和內(nèi)標，進樣分析，計算提取回收率。

1.8.4穩(wěn)定性 考察美羅培南儲備液在室溫(20 ℃)放置2、4 h，4 ℃冰箱中放置4、6 h，-20 ℃冷凍保存21 d條件下的穩(wěn)定性?？疾烀懒_培南的低、中、高濃度的血漿質(zhì)控樣品在室溫放置2、4 h，樣品處理后室溫放置(2、4 h)、4 ℃樣品托盤(4、6 h)、-20 ℃冷凍保存(12、24 h)，-20 ℃冰箱中循環(huán)凍融3次及-20 ℃長期冷凍保存21 d條件下的穩(wěn)定性。

1.8.5基質(zhì)效應 分別取6個不同來源的空白血漿100 μL，加乙腈1 000 μL渦旋混合后得空白基質(zhì)，分別加入低、中、高3個質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品100 μL和內(nèi)標100 μL，進樣分析，得分析物與內(nèi)標峰面積比值A1。以純水代替空白血漿，同法操作，得分析物與內(nèi)標峰面積比值 A2。內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子=A1/A2×100%。

2 結(jié) 果

2.1方法學評價

圖1 LC-MS/MS法測定人血漿中美羅培南典型色譜圖

2.1.1專屬性 方法專屬性結(jié)果見圖1。美羅培南和內(nèi)標的可完全分離，峰形對稱，保留時間分別為1.12 min和2.50 min?？瞻籽獫{中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾目標物的測定。

2.1.2標準曲線和定量下限 血漿中美羅培南濃度在0.02～30 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=4.934×10-5x+2.083×10-2(r=0.999 9)，定量下限為0.02 mg/L。

2.1.3精密度與回收率 美羅培南的日內(nèi)、日間RSD<3%，回收率在91.96%～100.97%之間，見表1。

表1 人血漿中美羅培南精密度和回收率Table 1 Precision and extraction recovery of meropenem in human plasma (n=6)

2.1.4穩(wěn)定性 美羅培南儲備液在室溫(20 ℃)放置4 h，4 ℃冰箱中放置6 h，-20 ℃冷凍保存21 d穩(wěn)定。美羅培南血漿質(zhì)控樣品在室溫放置4 h，樣品處理后室溫放置4 h、4 ℃樣品托盤放置6 h、-20 ℃冷凍保存24 h、-20 ℃冰箱中循環(huán)凍融3次及-20 ℃長期冷凍保存21 d穩(wěn)定。

2.1.5基質(zhì)效應 美羅培南低、中、高3個質(zhì)量濃度的絕對基質(zhì)效應在93.24%～98.56%，內(nèi)標卡馬西平的歸一化基質(zhì)效應因子為97.82%。結(jié)果表明：美羅培南和內(nèi)標測定不受基質(zhì)效應影響。

2.2方法應用 結(jié)合我院美羅培南細菌耐藥檢測結(jié)果，將美羅培南最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)1 mg/L作為有效血藥濃度范圍下限，目標濃度范圍為1～30 mg/L。197例次膿毒癥患者美羅培南血藥濃度范圍監(jiān)測結(jié)果為0～16.33 mg/L。見表2。

表2 197例次膿毒癥患者美羅培南血藥濃度Table 2 Plasma concentration of meropenem in 197 sepsis patients

3 討 論

本研究建立了LC-MS/MS法測定膿毒癥患者血漿中美羅培南濃度，該方法特異性強、重復性好，樣品分析時間為3 min，大大縮短了樣品檢測時間，能夠滿足臨床監(jiān)測需求。

在臨床實際采樣過程中，血液樣本常伴有溶血和乳糜血現(xiàn)象，分別考察了輕、中、重度溶血和脂血癥對美羅培南檢測結(jié)果的影響。結(jié)果顯示：輕、中、重度溶血和脂血癥不影響血漿中美羅培南結(jié)果測定，但重度脂血癥血液樣本會給樣品前處理帶來一定困難。因此，在處理重度脂血癥樣本時，應給予充分離心和渦旋振蕩。同時，考察了枸櫞酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉作為抗凝劑對美羅培南測定的影響。結(jié)果表明：枸櫞酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉不影響美羅培南和卡馬西平測定。

美羅培南血漿蛋白結(jié)合率低，主要通過腎臟以原型排泄，患者肌酐清除率顯著影響美羅培南的清除率[13]。由于膿毒癥患者肝、腎功能的改變，同時伴有多器官功能障礙，使美羅培南在膿毒癥患者體內(nèi)藥代動力學參數(shù)與健康受試者體內(nèi)藥代動力學參數(shù)存在較大差異從而影響到臨床療效[14-15]，所以應對膿毒癥患者體內(nèi)美羅培南血藥濃度進行監(jiān)測，并根據(jù)血藥濃度監(jiān)測結(jié)果進行給藥方案調(diào)整。197例次膿毒癥患者中，美羅培南血藥濃度低于1 mg/L占比為67.0%。因此，膿毒癥患者在采用美羅培南治療過程中，應根據(jù)治療藥物監(jiān)測結(jié)果，結(jié)合患者性別、年齡、體重、肝腎功能等實際情況給予適當?shù)慕o藥方案調(diào)整，以期達到最佳治療效果。研究表明：美羅培南全血樣本在2～6 ℃和室溫下放置6 h開始降解，血漿樣品處理后3 h穩(wěn)定[7,10]。本研究穩(wěn)定性實驗表明美羅培南血液樣本室溫放置4 h、樣品處理后4 ℃放置6 h穩(wěn)定，但美羅培南穩(wěn)定性差，應在樣本采集后盡快完成樣本處理、檢測，如不能在第一時間進行測定，應將美羅培南血液樣本離心后，-20 ℃保存。標準化的美羅培南血液樣本采樣流程直接影響美羅培南檢測結(jié)果的準確性。因此，根據(jù)實驗結(jié)果建立了《臨床樣本采樣流程》，并對臨床醫(yī)師和護師進行培訓，保證樣品采集、存儲、轉(zhuǎn)運標準化，進而保證美羅培南血藥濃度檢測結(jié)果的準確性，提高美羅培南治療膿毒癥的有效性，實現(xiàn)從經(jīng)驗治療到個體化精準治療的轉(zhuǎn)變。本試驗建立了敏感、準確、可靠、簡便、快速的美羅培南檢測方法，為美羅培南藥物的臨床監(jiān)測提供了技術(shù)支持。根據(jù)美羅培南血藥濃度監(jiān)測結(jié)果，實現(xiàn)了臨床治療方案從經(jīng)驗治療模式向精準的個體化治療的轉(zhuǎn)變，對提高美羅培南治療的有效性、有效控制細菌耐藥的產(chǎn)生均有重要意義。