基于轉錄組分析溫度誘導黑斑原鮡（Glyptosternum maculatum）選擇性剪接的變化

王萬良，周建設,2，扎西拉姆，張馳，陳美群

（1.西藏自治區農牧科學院水產科學研究所，西藏 拉薩 850032；2.河南農業大學動物科技學院，河南 鄭州 450046）

近些年，全球氣候變化[1]導致了一系列水生態問題[2]。西藏是我國重要的生態安全屏障，對全國乃至全球氣候的變化影響顯著[3]，水生生態系統是西藏生態系統的重要組成部分。魚類是水生低等變溫脊椎動物，與環境水體的熱交換速率高，容易受到外界水溫的影響[4,5]。溫度變化可能對它們的行為、生長和繁殖產生負面影響，甚至導致死亡[6]。為了維持這種自我平衡狀態，魚類需要在生理、細胞和分子水平上迅速有效地響應水溫的變化。

轉錄組分析是研究魚類應對溫度變化的有效手段，揭示了多個與氧化應激、蛋白合成、蛋白折疊、細胞凋亡等相關的基因[7,8]，尤其是熱應激蛋白（Hsps）表達水平在魚類響應溫度變化中顯著上調[9]。然而，有關魚類對溫度脅迫后轉錄后的調控知之甚少，比如轉錄后的選擇性剪接（Alternative Splicing,AS）。選擇性剪接在增強真核生物的調節能力和蛋白質機構組成中起關鍵作用[10]，其基本類型包括外顯子跳躍（SE）、互斥外顯子（MXE）、選擇性5’剪接位點（A5SS）、選擇性3’剪接位點（A3SS）和內含子保留（RI）[11]。選擇性剪接所產生的mRNA 和蛋白質亞型在結構、穩定性、亞細胞定位和功能上可能不同[12]。在發育和對環境壓力的反應過程中，選擇性剪接是一個被嚴格調控的過程[13,14]，它在應對非生物脅迫，包括熱脅迫的過程中發揮著關鍵作用[7,15]。斑馬魚（Danio rerio）響應熱應激后，其熱休克蛋白1（hsf1）轉錄變體的比例發生了明顯的變化[16]。

圖1 黑斑原鮡背部（a）、胸部（b）及棲息地環境（c）（張馳拍攝）Fig.1 Photos of dorsal（a）,chest（b）and habitat of G.maculatum（by Zhang Chi）

1 材料與方法

1.1 實驗設計和數據來源

實驗中，用三層刺網在夜間布網，凌晨收網采捕多雄藏布支流（N29°27′58.72″，E86°54′36.06″）的黑斑原，用魚罐車運輸到西藏自治區農牧科學院水產科學研究所養殖基地水族箱暫養10 d。箱溫度保持在12℃。為了避免性別和年齡對實驗結果的影響[21]，挑選體長、體質量相近的雌性個體90 尾，分為3 組，每組30 尾。根據黑斑原棲息環境溫度的范圍[22]，試驗溫度設置3 個組：A 組為對照組，水溫保持12℃；B 組以2℃/h 從12℃下降到4℃；C 組以2℃/h 上升，達到24℃時，黑斑原表現張口呼吸，鰓蓋猛烈震動，身體顏色變淺，身體出現弓張反應，瀕死魚開始出現。

1.2 樣本收集和RNA 提取

選擇肝組織作為試驗組織[23,24]。C 組在處理過程中，一旦出現瀕死魚，立即取出肝臟，收取3 尾魚的肝臟樣本，然后以2℃/h 降溫至12℃保持。同時從A 組和B 組各收集3 尾魚，用100 mg/L 的MS-222 麻醉致死后取肝臟樣本，樣本均置于液氮中。總RNA 提取使用TRIzol 試劑（Invitrogen，USA）。采用瓊脂糖凝膠電泳和安捷倫2100 生物分析儀（Agilent Technologies,CA,USA）分別測定RNA 濃度和RNA 完整性（RIN）。每個樣本3 μg RNA 用于建庫，使用NEBNextUltraTMRNA 生成測序文庫，使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cbo-hs 對樣本進行聚類。聚類生成后在Illumina Hiseq 平臺進行測序。測序項目由上海派森諾基因科技有限公司服務，RNA-Seq 結果已上傳至NCBI 數據庫（PRJNA634869）。

1.3 熱應激后選擇性剪接分析

使用rMATS[25]檢測不同樣品間的差異剪接基因和樣品自身的剪接事件。通過rMATS 統計模型對不同樣本進行可變剪接事件的表達定量，然后以likelihood-ratio test 計算P-value 來表示兩組樣品在Inclusion Level（IncLevel）水平上的差異，lncLevel 并利用Benjamini Hochberg 算法對P-value 進行校正得FDR。FDR＜5%為選擇性剪接的標準，rMATS 可識別的可變剪接事件有5 種，分別是外顯子跳躍（skipped exon，SE）、第一個外顯子可變剪接（alternative 5′ splice site，A5SS）、最后一個外顯子可變剪接（alternative 3′ splice site，A3SS）、外顯子選擇性跳躍（mutually exclusive exons，MXE）和內含子滯留（retained intron，RI）。

1.4 功能富集分析

根據GO 注釋結果以及官方分類，將差異選擇性剪接基因進行功能分類，同時使用R 軟件中的phyper 函數進行富集分析。

2 結果與分析

2.1 溫度處理后的選擇性剪接分析

RNA-Seq 結果，共獲得395.87 M的Clean reads，每個樣本超過87.29%比對到黑斑原基因組和77.70%比對到外顯子區域（表1）。高溫組、對照組和低溫組選擇性剪接事件均只存在MXE 和SE 兩種，高溫和低溫處理后選擇性剪接事件均顯著減少（圖2-a），其中SE 剪接事件在對照組、高溫組和低溫組分別為4 008、3 336 和3 786 個，MXE 剪接事件在對照組、高溫組和低溫組分別為207、188 和211個。與控制組相比，高溫誘導減少了16.39%選擇性剪接事件和16.35%選擇性剪接基因，低溫誘導減少了5.17%選擇性剪接事件和6.21%的選擇性剪接基因（圖2-b）。

圖2 溫度脅迫下黑斑原鮡肝臟組織可變剪接事件統計Fig.2 Statistical graph of variable splicing events in the liver tissues of Glyptosternum maculatum exposed to different temperature

表1 RNA-Seq 測序結果Tab.1 Summary of RNA-Seq reads mapping to reference genome

2.2 差異選擇性剪接分析

如表2 和圖3-a 所示，通過不同處理組間兩兩比較，對照組與高溫組間有3 425 個差異選擇性剪接事件和2 400 個差異選擇性基因，對照組與低溫組間有3 106 個差異選擇性剪接事件和2 199 個差異選擇性剪接基因，低溫組與高溫組間有3 679 個差異選擇性剪接事件和2 530 個差異選擇性剪接基因。高溫組有75 個特有基因高表達，低溫組有32個特有基因高表達。

表2 差異選擇性剪接事件Tab.2 Differential alternative splicing events in the three comparisons

2.3 功能富集分析

為了進一步了解差異剪接事件和基因的功能，對溫度脅迫產生的選擇性剪接基因進行GO 富集分析。從C vs.H、C vs.L 和L vs.H 的3 個比較組中分別選出309、187 和390 個選擇性剪接基因（P＜0.01）進行GO 富集分析。其中在C vs.H 組有190 個基因富集到生物學過程（biological process，BP），88 個基因富集到細胞組成（cellular component，CC），318 個基因富集到分子功能（molecular functions，MF）；在C vs.L 組，101 個基因富集到生物學過程，50 個基因富集到細胞組成，210 個基因富集到分子功能；在L vs.H 組，富集到生物學功能、細胞組成和分子功能的基因分別是250、109 和406 個（圖3-b）。

圖3 差異選擇性剪接基因韋恩圖（a）及GO 富集分析（b）Fig.3 The Venn diagram（a）and GO enrichment analysis（b）of differential alternative splicing genes in the three comparisons

KEGG 分析表明，83、9 和88 個通路分別顯著富集（P＜0.05）在C vs.H 組、C vs.L 組和L vs.H 組，這些通路中，Protein processing in endoplasmic reticulum 和Purine metabolism 在3 個比較組中共有（圖4）。2 個共有通路中共有7 個基因（表3），其中熱休克蛋白40 同源物亞家族C 成員1（dnajc1）和次黃嘌呤脫氫酶1（impdh1）基因在C vs.H 組差異顯著（P＜0.05），內質網內降解蛋白2（derl2）、dnajc1、黃嘌呤脫氫酶（xdh）和3′磷酸腺苷5′磷酰硫酸合成酶2（papss2）在C vs.L 組差異顯著（P＜0.05），xdh、papss2、impdh1、聚合酶（RNA）III（DNA 引導）肽H（polr3h）、dnajc1、derl2 和熱休克蛋白40 同源物亞家族C 成員10（dnajc10）在L vs.H 組差異顯著（P＜0.05）。值得注意的是，dnajc1 在3 個比較組中均差異顯著。該基因屬hsp40 亞家族成員[26]。

表3 3 個比較組共有通路中基因名稱Tab.3 Gene name of co-pathway in the three comparison groups

圖4 3 個比較組基因數目前20 個KEGG 通路分析Fig.4 The top 20 KEGG pathways in the three comparison groups

2.4 dnajc1 基因生物信息學分析

人dnajc1 基因選擇性剪接轉錄本如圖5-A 所示有12 種，其中選擇性剪接體a 為基礎轉錄本，含12 個外顯子和11 個內含子，其他轉錄本均是由a轉錄本通過外顯子跳躍、互斥外顯子、選擇性5’剪接位點、選擇性3’剪接位點和內含子保留的方式衍變而來。本研究中，dnajc1 基因在對照組和低溫組魚肝臟中均產生1 個剪接體。該剪接體在13 號染色體跳過外顯子起始和終止位點分別為11110521和11110612、上游外顯子起始和終止位點分別為11110338 和11110429、下游外顯子起始和終止位點分別為11110761 和11110922。而高溫處理后發現了選擇性剪接，除了原有剪接體外產生了1 個剪接體。該剪接體在13 號染色體跳過外顯子起始和終止位點分別為11109595 和11109642、上游外顯子起始和終止位點分別為11109387 和11109489、下游外顯子起始和終止位點分別為11109728 和11109894（表4）。生物信息學分析顯示，黑斑原肝臟dnajc1 基因選擇性剪接轉錄本如圖5-C 所示，與人dnajc1 基因比較，黑斑原選擇性剪接體a 為基礎轉錄本，與鯰（Silurus asotus）（圖5-B）和人dnajc1基因一樣都有12 個外顯子，11 個內含子，黑斑原肝臟選擇性剪接體b 在本研究的對照組、低溫組和高溫組出現，而選擇性剪接體e 只在高溫組出現，也有報道對鯰進行熱應激后誘導了熱休克蛋白基因hsf1 產生了2 種選擇性剪接體[27]，進一步說明dnajc1 基因在黑斑原遭遇溫度脅迫后肝臟通過產生選擇性剪接體來保護細胞的穩態。

表4 不同溫度下dnajc1 基因選擇性剪接轉錄體Tab.4 Alternative splicing transcript of dnajc1 gene at different temperatures

圖5 dnajc1 基因選擇性剪接示意圖Fig.5 Diagram of alternative splicing of dnajc1 gene

3 討論

3.1 選擇性剪接在溫度應激中的作用

魚類是研究環境脅迫下生理和分子反應的良好材料[28]。環境脅迫下生物體通過調控基因的表達模式快速改變轉錄產物來適應環境[29]，環境脅迫因子對基因表達的影響可能是來自于選擇性剪接機制的調控[14,30]。然而，選擇性剪接事件對魚類應對環境影響的報道并不多。隨著全球氣候的逐漸變暖[31]，溫度脅迫對魚類的各種影響也在增加。本研究分析了黑斑原在低溫和高溫處理下肝臟組織的選擇性剪接，同時對溫度脅迫下選擇性剪接基因進行了富集分析，為更好地理解選擇性剪接調控機制在應對溫度脅迫中的作用提供理論基礎。研究表明，選擇性剪接有助于動植物更好地適應環境的各種變化[13-15,30]。本研究中，黑斑原經低溫和高溫處理后，肝臟組織選擇性剪接基因和事件數量均減少（圖2-b），表明選擇性剪接在黑斑原溫度脅迫后肝臟組織調解基因表達發揮了作用，這與鯰肝臟[27]熱應激后選擇性剪接事件和基因均增加相反，選擇性剪接在發育和對環境壓力的反應過程中受到嚴格調控[13,14]，是增加基因表達復雜性的重要機制，在細胞分化和機體發育中起重要作用[32]，溫度應激后選擇性剪接事件和基因的增加和減少均是對熱應激的反應。黑斑原屬冷水性魚類，常年生活在平均海拔4 000 m 以上、水溫低于15℃的水域中[19]，環境溫度的改變致使其減少一些生物功能以維持在高寒環境中生存的需要很有必要。

3.2 熱休克蛋白保護機體細胞穩態

Hsp40 蛋白（也稱為Dna J 蛋白）是hsp 超級家族中成員最多的亞家族之一，其結構中保守的J 區域為hsp40 與hsp70 結合并調節hsp70 蛋白ATP 酶活性所必需[33]。hsp40 蛋白參與多種細胞功能，包括調節蛋白質折疊、易位和組裝，具有多達50 余個同源基因，其中包括dnajc1 基因[26]。本研究中黑斑原經低溫和高溫處理后，dnajc1 基因在3 個比較組中均差異顯著，都富集在內質網內蛋白過程通路中，內質網是一個動態的、復雜的細胞器，在細胞內調節細胞過程，維持細胞內穩態。當這種動態平衡被打破，便出現內質網應激，使內質腔內未折疊的蛋白質不斷累積，一種稱為未折疊蛋白反應（UPR）信號轉導機制啟動以恢復內質網的功能和蛋白質平衡[34]。HSP 蛋白在協助內質網內合成蛋白質、保護新生多肽免受各種應激刺激和維持蛋白停滯等方面起著決定性的作用[35]。內質網應激后誘導的選擇性剪接可能有重要的生理和病理意義[36]。本研究中，高溫處理后黑斑原的dnajc1 基因產生了2 個剪接體，而低溫處理后和對照組一樣只產生了1 個剪接體（表4）。黑斑原屬冷水性魚類，高溫的脅迫作用比低溫更明顯，因此dnajc1 基因在高溫脅迫選擇性剪接體發生了變化，以保護多肽免受溫度脅迫的應激。大量證據已經證實，Hsp 蛋白的表達對機體的熱應激具有保護作用[37,38]，但具體保護哪些酶或結構蛋白以及哪些核苷酸的代謝值得研究，Smolenski等[39]通過分析熱休克大鼠心臟腺嘌呤、鳥嘌呤、嘧啶和吡啶核苷酸的濃度，證實熱應激引起大鼠心臟核苷酸代謝的顯著改變，在含氧量正常的條件下，鳥嘌呤和嘧啶核苷酸水平升高，而本研究中溫度脅迫下黑斑原肝臟中的4 個基因（表3）均在嘌呤代謝通路中差異顯著，進一步推測黑斑原可能在溫度脅迫下，dnajc1 基因通過產生選擇性的可變剪接來保護嘌呤代謝過程以維持機體細胞的穩態。