QuEChERS/高效液相色譜－串聯(lián)質譜法測定黃金羅漢果中50種常用農藥殘留

李 純，陳俊妃，熊 穎，謝思敏，顧利紅

（國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質量評價重點實驗室，廣州市藥品檢驗所，廣東 廣州 510160）

羅漢果為葫蘆科植物羅漢果Siraitia grosvenorii（Swingle）C.Jeffrey ex A.M.Lu&Zhi Y.Zhang的干燥果實［1］，具有清熱潤肺、利咽開音、滑腸通便的功效，是國家衛(wèi)生部首批批準的藥食兩用的品種之一。黃金羅漢果是新鮮羅漢果采摘后采用真空微波工藝脫水處理的成品，表面呈金黃色，故稱“黃金羅漢果”。與傳統(tǒng)烘烤干燥的羅漢果相比，黃金羅漢果中更多營養(yǎng)物質得以保存，更符合現代健康環(huán)保的理念。

通過查閱《中國農藥信息網》數字平臺的農藥登記數據發(fā)現，目前尚未有羅漢果種植中使用的農藥登記品種，羅漢果行業(yè)標準（NY/T 694－2003）［2］僅收載了4種有規(guī)定最大殘留限量的農藥。《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763－2021）［3］也未規(guī)定羅漢果中農藥的最大殘留限量（MRL）。根據2019年4月“農業(yè)農村部辦公廳關于印發(fā)《用藥短缺特色小宗作物名錄》、《特色小宗作物農藥登記藥效試驗群組名錄》和《特色小宗作物農藥登記殘留試驗群組名錄》的通知”［4］，“羅漢果”歸類在用藥短缺特色小宗作物名錄（2019版）藥用植物的“果實、種子類”，該藥用植物的“果實、種子類”代表作物為枸杞，枸杞目前已登記使用的農藥有23種。為控制農藥殘留，建立黃金羅漢果中常用農藥多殘留的檢測方法尤為重要。

與氣相色譜法、液相色譜法相比，QuEChERS技術結合色譜－串聯(lián)質譜檢測方法具有專屬性好、靈敏度高和適用范圍廣等特點，已被廣泛應用于乳制品、中藥、茶葉和蔬果等基質中農藥的檢測［5－9］，但目前適用于黃金羅漢果中多類別農藥殘留檢測的方法尚未見報道。王夢月等［10］采用氣相色譜法測定羅漢果中的有機氯農藥；秦富等［11］采用QuEChERS－高效液相色譜－串聯(lián)質譜法測定羅漢果中55種殺菌劑；陳曉蘭等［12］采用QuEChERS－氣相色譜法測定羅漢果中的噠螨靈；潘艷坤等［13］采用固相萃取/高效液相色譜檢測羅漢果及其提取物中的甲基托布津與多菌靈。本研究基于實地調研，以改良的QuEChERS技術結合高效液相色譜－串聯(lián)質譜（HPLC－MS/MS），建立了黃金羅漢果中涵蓋6類用途共50種常用農藥的檢測方法，并對基地收集的28批樣品進行檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC－30A高效液相色譜儀－8050三重四極桿質譜儀（日本Shimadzu公司）；AG245型電子分析天平（瑞士Mettler－Toledo公司），Millipore超純水處理系統(tǒng)（德國Merck公司），ST 16型高速離心機（美國Thermo公司），Maxi Mix II旋渦儀（美國Thermo公司），N－EVAP氮吹儀（美國Oganomation公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；甲酸、甲酸銨、冰乙酸（色譜純，上海安譜有限公司）；無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末鹽包（質量比4∶1，7.5 g，美國Waters公司）；無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺（PSA，40～60 μm）、石墨化炭黑（GCB，30～90 μm）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，50 μm，60?）（農殘級，上海安譜有限公司）。分散型凈化材料管（美國Dikma公司）。農藥化合物標準品（Dr.Ehrenstorfer、ANPEL、BePure、O2SI公司）。

課題組共收集黃金羅漢果樣品28批，均為2020～2021年采收，產地分別為廣西桂林（16批）、湖南郴州（7批）與貴州黔東南苗族侗族自治州（5批），經廣州市藥品檢驗所顧利紅主任中藥師鑒定為葫蘆科植物羅漢果的干燥果實。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制及標準曲線繪制混合標準品儲備溶液：精密量取50種農藥對照品溶液（100 mg/L）各1 mL，置于50 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容制備成混合標準品儲備溶液，于-30℃冰箱中保存。

混合標準品工作溶液：精密量取混合標準品儲備液25 mL，置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容制備成混合標準品工作溶液。臨用前現配。

基質匹配標準工作溶液：分別取不含待測農藥的羅漢果樣品9份，按“1.2.2”處理至“置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至約0.4 mL”，分別加入混合標準品工作溶液20、40、100、200、300、400、600、800、1 000 μL，用乙腈稀釋并定容至2.0 mL，配制系列質量濃度的基質匹配標準工作溶液。

分別量取基質匹配標準工作溶液及經“1.2.2”處理的樣品溶液，過微孔濾膜（0.22 μm），按“1.2.3”條件測定，以各農藥的質量濃度（X，ng/mL）為橫坐標，以各農藥定量離子峰的峰面積響應值（Y）為縱坐標繪制標準曲線，權重系數選擇1/X，得到50種農藥的回歸方程及相關系數。

1.2.2 樣品前處理取供試品粉末（過三號篩）3 g，精密稱定，置于50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入15 mL水，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min，精密加入1%乙酸乙腈15 mL，渦旋混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）5 min，于冰浴中冷卻10 min，加入無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末（4∶1）7.5 g，立即搖散，置振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）3 min，離心（4 000 r/min）5 min。取9 mL上清液，置于分散固相萃取凈化管（裝有無水硫酸鎂900 mg，PSA 450 mg，C18300 mg，GCB 50 mg）中，渦旋充分混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）5 min使凈化完全，離心（4 000 r/min）5 min，精密吸取5 mL上清液，置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至約0.4 mL，加乙腈稀釋至2.0 mL，即得。

1.2.3 分析條件色譜條件：Agilent Poroshell 120 EC－C18色譜柱（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）；柱溫：35℃；樣品盤溫度：10℃；流動相：A為0.05%甲酸水溶液（含10 mmol/L甲酸銨），B為95%甲醇（含10 mmol/L甲酸銨和0.05%甲酸）。梯度洗脫程序：0～1 min，95%A；1～4 min，95%～40%A；4～8 min，40%～36% A；8～8.5 min，36%～32% A；8.5～9 min，32%～25% A；9～16 min，25%～5% A；16～20 min，5%A；20～20.1 min，5%～95%A；20.1～25 min，95%A。流速：0.4 mL/min；進樣體積：2 μL。

質譜條件：電噴霧（ESI）離子源；掃描方式：正負離子同時掃描；檢測模式：多反應監(jiān)測模式（MRM）；霧化氣流速：1.5 L/min；加熱氣流速：10 L/min；接口溫度：300℃，脫溶劑溫度：500℃，DL溫度：180℃，加熱塊溫度：400℃；干燥氣流速：10 L/min。50種農藥的保留時間、離子對、碰撞能量見表1。

表1 50種農藥的保留時間、離子對及碰撞能量Table 1 Retention times，ion pairs and collision energies of 50 pesticides

（續(xù)表1）

2 結果與討論

2.1 農藥目標物的選擇

本文的50種農藥目標物主要包括：①實地調研中發(fā)現的羅漢果種植基地及周圍環(huán)境中可能使用的農藥；②枸杞子品種中有登記使用的農藥；③羅漢果行業(yè)標準（NY/T 694－2003）中規(guī)定最大殘留限量的農藥；④具有毒理學意義的代謝產物及異構體。從化學結構上分析，主要為有機磷類（13種）、氨基甲酸酯類（5種）、三唑類（10種）、雜環(huán)類（18種）、其他（4種）。從農藥用途上分析，包括殺蟲劑（25種）、殺菌劑（13種）、殺螨劑（6種）、植物生長調節(jié)劑（3種）、毒性代謝物（2種）、除草劑（1種）。

2.2 檢測條件的優(yōu)化

50種農藥中大多數化合物適合質譜正離子模式檢測，但部分化合物（虱螨脲、氟蟲胺、除蟲脲）在負離子模式下的響應更好，因此采用正負離子同時掃描的質譜檢測方式。為使溫度敏感型農藥化合物（如丁硫克百威）在分析過程中保持穩(wěn)定，樣品盤溫度選擇為10℃。

對50種農藥混合標準溶液（100 ng/mL）在m/z30～900范圍內進行全掃描，并調整目標物的母離子、子離子、碰撞能量等質譜參數，同時加入羅漢果空白基質進行優(yōu)化。每個化合物選擇同時監(jiān)測2組MRM離子對作為定性離子對，選擇響應值高且干擾少的離子對作為定量離子對，并設定每個化合物的采集時間窗為1 min，顯著降低樣品中多組分分析的循環(huán)時間，增加采集點，提高儀器響應值。黃金羅漢果空白基質匹配的50種農藥混合標準溶液（10 ng/mL）的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 黃金羅漢果空白基質匹配的50種農藥混合標準溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of 50 pesticide mixed standard solutions matched with blank matrix of golden siraitia grosvenoriis

2.3 前處理方法的優(yōu)化

50種農藥的pKa為1.0～14.4，涵蓋酸性、中性及弱堿性農藥，理化性質差異較大。QuEChERS法通常采用1%乙酸水溶液先對樣品進行浸泡，但部分酸堿度敏感型農藥可能容易降解。實驗比較了10 LOQ加標水平下，分別采用1%乙酸水溶液－乙腈與水-1%乙酸乙腈作為提取溶劑時50種農藥的回收率。結果顯示，采用水-1%乙酸乙腈的平均回收率（95%）整體略高于1%乙酸水溶液－乙腈（89%），且部分弱堿性農藥的回收率顯著提高，例如乙酰甲胺磷（pKa 11.0）的回收率由47.0%增至80.0%，霜霉威（pKa 12.7）由22.0%增至65.0%，吡蚜酮（pKa 12.9）由45.0%增至67.0%，氧樂果（pKa 14.4）由55.0%增至81.0%。因此選擇水-1%乙酸乙腈為提取溶劑。

QuEChERS法的凈化材料主要包括PSA、C18、GCB、無水MgSO4。其中，無水MgSO4可去除多余的水分。PSA可去除酸性及中性物質（例如有機酸、脂肪酸、酚類等），其凈化效果與含水量有關，含水量越高，凈化效果越差。C18可去除非極性有機物（如木質素、萜類等）。GCB去除色素的能力較強，同時也容易吸附部分平面結構的化合物［8］。羅漢果提取液含有糖類、色素、黃酮類等，經過液液分層，大部分色素與糖類留在水層。參考《中華人民共和國藥典》2020年版［1］，并在前期研究的基礎［14－16］上對凈化步驟進行優(yōu)化。固定無水MgSO4用量為900 mg，以10 LOQ加標水平進行考察，對比了PSA、C18、GCB凈化材料3種用量配比時的回收率。3種用量配比分別為：①300 mg PSA、300 mg C18、90 mg GCB；②300 mg PSA、450 mg C18、90 mg GCB；③450 mg PSA、300 mg C18、90 mg GCB。結果顯示，上述3種配比下50種農藥的平均回收率分別為85.0%、91.0%、94.0%，總體差異不大，但部分平面結構化合物（如多菌靈、伏殺硫磷等）的回收率低于50.0%，原因可能是GCB含量太高。而采用配比③，再將GCB用量降至50 mg，多菌靈、伏殺硫磷等農藥的回收率提高至70.0%以上，95%農藥的回收率在70.0%～120%范圍內，滿足殘留分析要求。因此凈化劑確定為450 mg PSA、300 mg C18、50 mg GCB。

2.4 基質效應考察

質譜分析中待測物不可避免地會受到基質效應的影響。實驗采用絕對法［17－18］評價基質效應（Matrix effect，ME），計算公式為ME（%）=100%×B/A，其中A為純溶劑中待測物標準品溶液的平均響應值，B為空白基質中相同濃度的待測物標準品溶液的平均響應值。當ME為85%～115%時，表明基質效應較弱，對結果的影響可忽略；當ME＞115%或＜85%時，表明存在基質增強或抑制效應，應采用適當方法進行校準。比較了質量濃度為10 ng/mL的溶劑標準溶液與羅漢果基質標準溶液的響應值。結果顯示，有44種農藥的ME為85%～115%，表明其影響可忽略；氧樂果受基質抑制影響嚴重（ME＜50%）；吡蟲啉、伏殺硫磷、霜霉威、多菌靈受基質抑制影響輕微（60%＜ME＜85%）；毒死蜱受基質增強影響輕微（ME＞115%）。為保證實驗結果的準確性，采用基質匹配標準溶液進行定量分析。

2.5 方法學考察

按照“1.2.1”方法繪制標準曲線，結果顯示，乙酰甲胺磷在10～500 ng/mL，鮮胺酯、氯吡脲、呋蟲胺、噻蟲嗪、異草松在6～300 ng/mL，丙環(huán)唑在7.5～375 ng/mL，其余43種農藥在5～250 ng/mL 范圍內線性關系良好，相關系數（r）均大于0.99。按照定量離子對MRM色譜峰的信噪比S/N≥10確定定量下限（LOQ），除乙酰甲胺磷、丙環(huán)唑的LOQ為0.02 mg/kg外，其余48種農藥的LOQ均為0.01 mg/kg。

在羅漢果空白樣品中分別添加2 LOQ、5 LOQ、20 LOQ、40 LOQ的50種農藥混合標準溶液，靜置30 min，待農藥被樣品充分吸收后，按“1.2.2”方法處理并進行回收實驗。每個水平平行處理3份，回收率及相對標準偏差（RSD）見表2。結果顯示，4個加標水平下50種農藥的平均回收率為60.7%～115%，90%以上農藥的回收率為70.0%～120%，涵蓋全部有檢出值的農藥，95%以上農藥的RSD（n=3）小于15%，符合農藥多殘留的檢測要求［19］。

表2 50種農藥的相關系數、定量下限、回收率和相對標準偏差Table 2 Correlation coefficients，LOQs，average recoveries and RSDs of 50 pesticides

（續(xù)表2）

2.6 實際樣品測定

采用本方法測定28批黃金羅漢果，結果顯示，共有21批次樣品（占75%）檢出10種農藥。農藥殘留量為0.01～0.27 mg/kg，最高檢出量為吡唑醚菌酯，其殘留量為0.27 mg/kg（1批次），其余檢出量均低于0.1 mg/kg，說明黃金羅漢果中農藥殘留量總體不高（見表3）。根據枸杞子已登記的農藥范圍，有5種檢出的農藥并未進行登記，分別為虱螨脲、丙溴磷、毒蟲畏、霜霉威、乙拌磷亞砜，表明黃金羅漢果種植中存在超范圍使用農藥的現象。

表3 樣品中10種檢出農藥的用途、檢出批次及殘留量Table 3 Usages，batches and residual amounts of 10 detected pesticides in samples

（續(xù)表3）

3 結論

本文采用改良的QuEChERS法結合高效液相色譜－串聯(lián)質譜技術，建立了黃金羅漢果中50種常見農藥的測定方法。該方法具有良好的靈敏度與準確度，為羅漢果中多類別農藥殘留提供了可靠的分析手段，為中藥羅漢果農藥殘留的日常監(jiān)督、風險評估等提供了基礎數據。