山羊ZNF32的克隆及表達(dá)分析

盛雪晴 趙楠 林亞秋 陳定雙 王瑞龍 李傲 王永 李艷艷

（西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041）

鋅指蛋白這一結(jié)構(gòu)最早由Miller 在非洲爪蟾轉(zhuǎn)錄因子TF ⅢA 中發(fā)現(xiàn)，是含有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的總稱［1-2］。鋅指蛋白是人類基因組中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，有2%的人類基因參與編碼鋅指蛋白。轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的核心控制器，調(diào)控著細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、代謝、細(xì)胞凋亡、自噬和干性維持等多種生物學(xué)過(guò)程［3］。鋅指蛋白32（zinc finger protein 32，ZNF32）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的屬于Krüppel 相關(guān)鋅指家族的一種轉(zhuǎn)錄因子，人ZNF32包含6 個(gè)連續(xù)的典型C2H2 鋅指基序和一個(gè)簡(jiǎn)并的C2H2 鋅指基序，定位于人10q23-q24染色體區(qū)域［4-6］。已有研究證明，Krüppel 鋅指家族有多個(gè)成員可能在細(xì)胞分化和增殖中發(fā)揮重要作用［7-9］。

ZNF 家族中ZNF423 被確定為前體脂肪形成的主要決定因子并保持白色脂肪細(xì)胞功能。Longo等［10］發(fā)現(xiàn)ZNF423 基因的表觀遺傳修飾調(diào)控小鼠脂肪細(xì)胞形成，Matsubara 等［11］發(fā)現(xiàn)ZNF423 基因與雞脂肪細(xì)胞分化有關(guān)，Chiarella 等［12］發(fā)現(xiàn)ZNF521基因通過(guò)抑制ZNF423 的表達(dá)負(fù)調(diào)控人類脂肪干細(xì)胞分化。因此我們猜測(cè)ZNF32 可能參與脂肪細(xì)胞增殖和分化。

目前關(guān)于ZNF32 的研究較少，主要集中于腫瘤的發(fā)生發(fā)展方面［13-19］，研究指出人ZNF32 與腫瘤細(xì)胞干性及耐藥性相關(guān)；ZNF32 可通過(guò)與干細(xì)胞標(biāo)志物SOX2 啟動(dòng)子特異性結(jié)合調(diào)控斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)的再生能力；也有研究報(bào)道指出ZNF32 參與腫瘤細(xì)胞的自噬、凋亡、失巢凋亡等細(xì)胞程序性死亡；陳宏麗等［20］發(fā)現(xiàn)ZNF32 的表達(dá)水平與STAT3 磷酸化水平呈正比，抑制ZNF32 的表達(dá)能干擾STAT3 信號(hào)通路從而抑制腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)特性。現(xiàn)階段關(guān)于ZNF32 的生物學(xué)功能研究較少，而其在山羊前體脂肪細(xì)胞中的作用未見(jiàn)報(bào)道。

皮下脂肪的累積可影響動(dòng)物的儲(chǔ)能、代謝、保溫等，而前體脂肪細(xì)胞的增殖和分化對(duì)脂質(zhì)沉積具有重要作用［21-22］。簡(jiǎn)州大耳羊是我國(guó)自主培育的第二大山羊品種，本研究旨在以簡(jiǎn)州大耳羊?yàn)檠芯繉?duì)象，利用RT-PCR 克隆山羊的ZNF32 基因序列，通過(guò)生物信息學(xué)分析工具分析其表達(dá)特性，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技術(shù)闡明其在山羊各組織中的表達(dá)水平，并探究ZNF32 對(duì)山羊皮下前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響。本研究將為山羊乃至肉用經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的分子育種等基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集 以成年（1 周歲）健康簡(jiǎn)州大耳羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，購(gòu)自四川省簡(jiǎn)陽(yáng)市大哥大牧業(yè)有限公司。屠宰后收集羊的腎、肺、心、肝、脾等14 個(gè)組織樣品，清洗后置于液氮中保存。本試驗(yàn)經(jīng)過(guò)西南民族大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)術(shù)委員會(huì)審批通過(guò)（SMU20160108）。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 自TaKaRa 公司購(gòu)買(mǎi)TRIzol 試劑、SYBR? Premix ExTaqTM（2×），自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)5×pchone007 Versatile Simple Vector Mix，自天根生化科技有限公司購(gòu)買(mǎi)DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，自康為世紀(jì)有限公司購(gòu)買(mǎi)2×Super Pfx MasterMix，自Thermo 公司購(gòu)買(mǎi)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取和cDNA 的合成 從液氮中取出腎、肺、心、肝、脾等14 個(gè)組織樣品，使用TRIzol法提取總RNA，檢測(cè)OD260/280值及濃度，經(jīng)測(cè)定符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)；將1 μg RNA 作為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 山羊ZNF32 基因克隆 以山羊腎臟組織cDNA 為模板，按照GenBank 上牛的ZNF32 基因序列（登錄號(hào)：NM_001046119.1）設(shè)計(jì)PCR 引物（表1）。

PCR 反應(yīng)體系：高保真DNA 聚合酶12.5 μL，腎組織cDNA 0.5 μL，10 μmol/L 上游引物1.25 μL、10 μmol/L 下游引物1.25 μL，ddH2O 9.5 μL，共計(jì)25 μL 反應(yīng)總體系。PCR 擴(kuò)增程序：預(yù)變性（98℃，3 min）；變性（98℃，10 s），退火（58℃，30 s），延伸（72℃，15 s），35 個(gè)循環(huán)；終延伸（72℃，10 min），4℃保溫。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，純化回收連接到007VS 載體上，轉(zhuǎn)化、涂板接種，挑取培養(yǎng)基上陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR 鑒定，送至成都擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 山羊ZNF32 基因生物學(xué)特性分析 山羊ZNF32 基因生物學(xué)特性分析及方法參見(jiàn)表2。

表2 生物信息學(xué)分析內(nèi)容及分析工具Table 2 Analytical contents and analysis tools for bioinformatics

1.2.4 山羊ZNF32 基因組織表達(dá)差異分析 按照“1.2.1”中的方法，將山羊各組織的總RNA 提取并將其反轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)cDNA。使用Primer Primier 5.0對(duì)克隆獲得的山羊ZNF32 基因序列設(shè)計(jì)其特異性qPCR 引物（表1），將TBP基因當(dāng)做內(nèi)參基因［23］，用qPCR 法對(duì)ZNF32 基因在各組織中的表達(dá)差異進(jìn)行檢測(cè)。

qPCR 反應(yīng)體系：SYBR? Premix ExTaqTM（2×）10 μL，cDNA 1 μL，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL，合計(jì)20 μL 反應(yīng)總體系，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。反應(yīng)條件：預(yù)變性（95℃，1 min）；變性（95℃，10 s），退火（60℃，20 s），延伸（72℃，30 s），共39 個(gè)循環(huán)。

1.2.5 山羊ZNF32 基因在皮下前體脂肪細(xì)胞中的時(shí)序表達(dá)分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期建立的山羊前體脂肪細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法對(duì)山羊皮下前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)［24］。獲得原代皮下前體脂肪細(xì)胞后，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞傳至F3代且融合度達(dá)約80%時(shí)，用胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞消化，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后鋪板，細(xì)胞數(shù)為4×104個(gè)/孔（12 孔板）。待細(xì)胞融合度達(dá)約80%時(shí)，使用濃度為50 μmol/L 的油酸誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化，每2 d 換一次液。分別收集0、24、48、72、96 h 后的細(xì)胞。按照“1.2.1”中方法得到各時(shí)期細(xì)胞的cDNA，以UXT基因作為內(nèi)參基因用于矯正基因的相對(duì)表達(dá)水平［25］，利用qPCR 法檢測(cè)ZNF32 基因在山羊皮下脂肪細(xì)胞不同時(shí)期的表達(dá)差異，qPCR 反應(yīng)體系及條件同“1.2.4”。

1.2.6 山羊ZNF32 基因CDS 區(qū)序列克隆及過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建 利用Primer Primier 5.0 對(duì)克隆獲得的山羊ZNF32 基因序列設(shè)計(jì)CDS 區(qū)引物，上游、下游引物分別添加上EcoRI、XhoI 的酶切位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的保護(hù)堿基（表1），以“1.2.2”中測(cè)序成功后提取的質(zhì)粒為模板克隆ZNF32 基因CDS 序列，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體。PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序同“1.2.2”。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，純化回收后，酶切PCR 產(chǎn)物和pCMV-Tag2B 載體，16℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化、涂板接種，挑取單菌落進(jìn)行PCR 鑒定，送至成都擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染、過(guò)表達(dá)及干擾效率檢測(cè) 同“1.2.5”中方法將細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳至F3代后以7×104個(gè)/孔（6 孔板）鋪板，空白試驗(yàn)組分別以pcDNA3.1 和siRNA（NC）轉(zhuǎn)染，試驗(yàn)組分別以pcDNA3.1-ZNF32 和siRNA-ZNF32 轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 后收取細(xì)胞，UXT作為內(nèi)參基因，使用qPCR 法檢測(cè)其過(guò)表達(dá)。轉(zhuǎn)染體系：2 μg pcDNA3.1-ZNF32，400 μL opti，6 μL turbfect。qPCR 反應(yīng)體系：SYBR?Premix ExTaqTM（2×）6.25 μL，cDNA 0.625 μL，10 μmol/L 上游引物0.625 μL、10 μmol/L 下游引物0.625 μL，ddH2O 4.375 μL，合計(jì)12.5 μL 反應(yīng)總體系，每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。反應(yīng)條件同“1.2.4”。

1.2.8 過(guò)表達(dá)或干擾ZNF32 對(duì)增殖抑制相關(guān)基因表達(dá)量的影響 以“1.2.7”中反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板，使用實(shí)驗(yàn)室前期設(shè)計(jì)并檢測(cè)合格的引物（表3），檢測(cè)過(guò)表達(dá)ZNF32 對(duì)山羊皮下前體脂肪細(xì)胞中增殖抑制相關(guān)基因表達(dá)的影響，每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。qPCR 體系及反應(yīng)條件同“1.2.4”。

表3 增殖抑制相關(guān)基因引物信息Table 3 Primers information of genes associated with proliferation inhibition

1.2.9 數(shù)據(jù)處理與分析 qPCR 數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，并用2-ΔΔCt法進(jìn)行均一化處理；利用SPSS 軟件中的One-way ANOVA 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 山羊ZNF32基因的克隆

為研究山羊ZNF32 的生物學(xué)功能，獲得該基因序列，本研究以簡(jiǎn)州大耳羊腎組織cDNA 為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后獲得與預(yù)期目的產(chǎn)物大小相符的片段（圖1）。測(cè)序得到ZNF32 基因片段長(zhǎng)度1 049 bp，已提交GenBank 獲得登錄號(hào)為MZ054397；經(jīng)序列分析CDS 區(qū)序列長(zhǎng)度為822 bp（圖2），與GenBank上山羊ZNF32 基因核苷酸預(yù)測(cè)序列完全一致，結(jié)果表明山羊ZNF32 基因序列克隆成功。

圖1 山羊ZNF32 基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of ZNF32 gene in goat

2.2 山羊ZNF32生物信息學(xué)分析

經(jīng)分析顯示，山羊ZNF32 蛋白分子式為C1334H2092N424O394S19，分子量為30 983.03 Da；理論等電點(diǎn)為9.52，帶負(fù)電荷（Asp + Glu）和帶正電荷（Arg+ Lys + His）的氨基酸殘基數(shù)分別為21 和60，其不穩(wěn)定系數(shù)為42.47，親水性平均值為-0.813，因此，該蛋白可能為堿性親水不穩(wěn)定蛋白；在氨基酸序列組成中，絲氨酸（Ser）含量為9.2%，占比最高；磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，山羊ZNF32 蛋白有32 個(gè)磷酸化位點(diǎn)（圖2）。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，山羊ZNF32 蛋白包含7 個(gè)C2H2 鋅指結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖2 山羊ZNF32 基因的ORF 序列及推斷的氨基酸序列Fig.2 Sequences of ORF and deduced amino acids of ZNF32 gene in goat

分析該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)可知，149 個(gè)氨基酸（54.58%）可能會(huì)形成無(wú)規(guī)卷曲（c），形成β-轉(zhuǎn)角（t）的氨基酸有28 個(gè)（10.26%），48 個(gè)氨基酸（17.58%）可能形成α 螺旋（h），48 個(gè)氨基酸（17.58%）可能形成延伸鏈（e）（圖4-A）；三級(jí)結(jié)構(gòu)經(jīng)預(yù)測(cè)與二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果一致（圖4-B）；在蛋白相互作用方面，可知ZNF32 蛋白可能與SOX2、ZNF821、MED31、ZNF414、FRA10AC1 等蛋白存在相互作用（圖4-C）。使用NCBI 中Blast 進(jìn)行比對(duì)可知，簡(jiǎn)州大耳羊與綿羊、牛的ZNF32 氨基酸序列相似性較高（圖5-A），說(shuō)明該蛋白在不同的物種間具有較高的保守性。利用MEGA 5.0 軟件根據(jù)山羊與其他物種氨基酸序列同源性構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，山羊ZNF32 與綿羊、牛親緣關(guān)系較近，聚于同一分支（圖5-B）。

圖3 山羊ZNF32 蛋白疏水性及氨基酸組成分析Fig.3 Analysis of hydrophobicity and amino acid composition of ZNF32 protein in goat

圖4 山羊ZNF32 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及相互作用預(yù)測(cè)Fig.4 Protein structure and interaction prediction of goat ZNF32

圖5 ZNF32 氨基酸序列比對(duì)及蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Amino acid sequence alignment and protein phylogenetic tree of goat ZNF32 gene

2.3 山羊ZNF32基因組織表達(dá)分析

以TBP為內(nèi)參基因，采用qPCR 檢測(cè)ZNF32 基因在山羊各組織中的表達(dá)差異，以背最長(zhǎng)肌為對(duì)照組織，結(jié)果顯示，山羊ZNF32 基因在心、肝、瘤胃、肺等14 個(gè)組織中均有表達(dá)。其中在大腸中的表達(dá)量極顯著高于其他組織（P＜0.01），其次是臂三頭肌、小腸及脾組織，而山羊ZNF32 基因在肝和肺組織中表達(dá)量最低（圖6）。以上結(jié)果表明山羊ZNF32 基因的表達(dá)具有組織特異性。

圖6 山羊ZNF32 組織表達(dá)譜Fig.6 Expression profile of ZNF32 gene in different tissues of goat

2.4 山羊ZNF32基因時(shí)序表達(dá)分析

分別收集誘導(dǎo)0、24、48、72、96 h 后的細(xì)胞，以UXT為內(nèi)參基因，采用qPCR 技術(shù)檢測(cè)ZNF32 基因在山羊皮下前體脂肪細(xì)胞不同分化程度的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，與誘導(dǎo)0 h相比，誘導(dǎo)分化24 h、48 h、72 h、96 h 后ZNF32 基因表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，在96 h 表達(dá)量達(dá)到最高，差異極顯著（圖7）（P＜0.01）。

圖7 ZNF32 基因在山羊皮下脂肪細(xì)胞不同分化階段的相對(duì)表達(dá)水平Fig.7 Relative expressions of ZNF32 gene in goat during different stages of differentiation

2.5 山羊ZNF32過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

為了進(jìn)一步研究山羊ZNF32 的生物學(xué)功能，以“1.2.2”中測(cè)序成功后提取的007VS-ZNF32 質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增獲得ZNF32 基因CDS 區(qū)序列（圖8）；以ZNF32 基因CDS 序列構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，測(cè)序結(jié)果顯示，CDS 區(qū)序列與克隆序列完全一致，紅色下劃線處為酶切位點(diǎn)（圖9），以上結(jié)果表明pCMVTag2B-ZNF32 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖8 山羊ZNF32 基因CDS 區(qū)擴(kuò)增結(jié)果Fig.8 CDS amplification results of goat ZNF32 gene

圖9 山羊ZNF32 基因過(guò)表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果Fig.9 Sequencing results of goat ZNF32 gene overexpression vector

2.6 山羊ZNF32基因過(guò)表達(dá)效率及增殖抑制相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)

山羊皮下前體脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF32 表達(dá)質(zhì)粒48 h 后，利用qPCR 檢測(cè)ZNF32 過(guò)表達(dá)效率，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ZNF32 基因表達(dá)量上調(diào)了近750 倍（圖10-A）。有研究指出人ZNF32 與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此，我們想到山羊ZNF32 是否調(diào)控皮下前體脂肪細(xì)胞增殖。本研究利用qPCR 法檢測(cè)過(guò)表達(dá)ZNF32 后對(duì)增殖抑制相關(guān)基因p21、p27、p53及p57 的表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)ZNF32 后抑制了增殖抑制相關(guān)基因p27 及p57 的表達(dá)（圖10-B）。

2.7 山羊ZNF32基因干擾效率及增殖抑制相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)

轉(zhuǎn)染ZNF32-siRNA入皮下前體脂肪細(xì)胞48 h后，qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與Negative control（NC）組相比，干擾效率為25%左右（圖10-C），干擾ZNF32后促進(jìn)了增殖抑制相關(guān)基因p21、p27、p53 及p57的表達(dá)（圖10-D）。

圖10 山羊ZNF32 基因表達(dá)效率及增殖抑制相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)Fig.10 Detection of ZNF32 gene expression efficiency and the expressions of genes related to proliferation inhibition in goats

2.8 ZNF32調(diào)控山羊皮下脂肪細(xì)胞增殖作用的機(jī)制探索

為了進(jìn)一步明析ZNF32 對(duì)山羊皮下前體脂肪細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制，鑒于其轉(zhuǎn)錄因子的身份，人ZNF32 的轉(zhuǎn)錄結(jié)合序列為GA（C/T）ATTT［12］，上述研究結(jié)果表明過(guò)表達(dá)ZNF32 后增殖抑制相關(guān)基因p27 及 p57 基因表達(dá)明顯下調(diào)，干擾ZNF32 后增殖抑制相關(guān)基因p21、p27、p53 及 p57 明顯上調(diào)。經(jīng)過(guò)對(duì)人p21、p27、p53 及p57 基因啟動(dòng)子區(qū)（-2 000-+100）分析發(fā)現(xiàn)，p21、p27 及 p53 基因啟動(dòng)子區(qū)存在ZNF32 轉(zhuǎn)錄結(jié)合序列（圖11）。以上結(jié)果表明ZNF32 可能通過(guò)靶向p21、p27 及 p53 的表達(dá)來(lái)調(diào)控山羊皮下脂肪細(xì)胞增殖。

圖11 p53、p21 和p27 啟動(dòng)子區(qū)ZNF32 結(jié)合序列Fig.11 Binding sequence of ZNF32 in p53，p21 and p27 promoter region

3 討論

Krüppel 樣轉(zhuǎn)錄因子是一類DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，這個(gè)家族內(nèi)的每一個(gè)調(diào)控因子的羧基端都有Cys2/His2 鋅指結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域十分保守。ZNF32 基因作為Krüppel 樣鋅指家族的一種轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于DNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有重要的作用。研究表明ZNF32 參與調(diào)控人腫瘤細(xì)胞增殖和分化等多種行為［13-18］。

為了研究山羊ZNF32 的表達(dá)特性，本研究成功克隆了山羊ZNF32 基因序列，得到CDS 區(qū)822 bp，共編碼273 個(gè)氨基酸。通過(guò)生物信息學(xué)分析工具對(duì)山羊ZNF32 序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，ZNF32 蛋白理論等電點(diǎn)為9.52，親水性平均值為-0.813，因此，該蛋白可能為堿性親水蛋白。山羊ZNF32 蛋白有32個(gè)磷酸化位點(diǎn)，磷酸化作為蛋白翻譯后修飾的方式之一，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等功能［26］，因此這些磷酸化位點(diǎn)可能有助于ZNF32 蛋白發(fā)生磷酸化。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，山羊ZNF32 蛋白包含7 個(gè)C2H2 鋅指結(jié)構(gòu)，其中6 個(gè)連續(xù)的典型C2H2 鋅指序列和1 個(gè)簡(jiǎn)并的C2H2 鋅指序列，與Han［4］的報(bào)道一致，且研究表明，C2H2 型鋅指蛋白參與細(xì)胞的增殖、分化和發(fā)育等過(guò)程［27-28］，因此ZNF32 可能參與皮下前體脂肪細(xì)胞增殖與分化。利用STRING 預(yù)測(cè)蛋白相互作用，結(jié)果顯示，ZNF32蛋白可能與SOX2 等蛋白存在相互作用，Wei 等［15］發(fā)現(xiàn)，ZNF32 與干細(xì)胞標(biāo)志物SOX2 啟動(dòng)子特異性結(jié)合后，可負(fù)調(diào)控SOX2 的表達(dá)，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。通過(guò)構(gòu)建山羊ZNF32 組織表達(dá)譜，知悉其在山羊各組織中均有表達(dá)，在大腸中表達(dá)量最高。

為進(jìn)一步研究ZNF32 在山羊脂肪細(xì)胞中的功能，本研究構(gòu)建了山羊ZNF32 時(shí)序表達(dá)譜，知悉ZNF32 基因表達(dá)水平在誘導(dǎo)分化過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，在96 h 表達(dá)量達(dá)到最高，極顯著高于分化前。據(jù)報(bào)道，在目前KLF 家族中發(fā)現(xiàn)的18 個(gè)成員（即KLF1-KLF18）中有6 個(gè)成員（KLF2、KLF3、KLF4、KLF6、KLF7 和KLF15）在分化的細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著或極顯著高于前體脂肪細(xì)胞，KLF4、KLF9、KLF12 可能在山羊前體脂肪細(xì)胞中具有重要調(diào)控作用［29］。研究發(fā)現(xiàn)，與ZNF32 同屬ZNF 家族的ZNF423 控制小鼠脂肪細(xì)胞形成并與雞脂肪細(xì)胞分化有關(guān)，ZNF521 是人類脂肪干細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控因子［10-12］。因此，ZNF32 基因在山羊脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中可能具有調(diào)控作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步闡明ZNF32 在山羊脂肪細(xì)胞中的作用機(jī)制。

利用qPCR 技術(shù)檢測(cè)增殖抑制相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)ZNF32 后顯著抑制了p27 及p57 基因的表達(dá)，干擾ZNF32 后顯著促進(jìn)了p21、p27、p53 及p57 基因的表達(dá)。P21、p27 及p57 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的激酶抑制蛋白CIP/KIP 基因家族，參與細(xì)胞周期及新陳代謝的調(diào)節(jié)，發(fā)揮對(duì)細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控作用［30-32］，p53 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，p53 蛋白轉(zhuǎn)錄激活下游靶基因p21 和MDM2的表達(dá)，從而抑制CDK 活性，對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行負(fù)性調(diào)控［33］。Sun 等［34］報(bào)道，過(guò)表達(dá)KLF15 可部分通過(guò)調(diào)控p21 和p57 抑制胃癌細(xì)胞的增殖；Wang 等［35］報(bào)道，HOXA5 通過(guò)調(diào)控p27 抑制宮頸癌細(xì)胞增殖；Yang 等［36］報(bào)道，BOP1 通過(guò)調(diào)節(jié)p53 的表達(dá)調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖；孫等［37］報(bào)道，MIR221 可通過(guò)與p57 mRNA 3′-UTR 區(qū)域結(jié)合使結(jié)腸癌細(xì)胞中p57 蛋白表達(dá)下降而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，本研究經(jīng)過(guò)對(duì)人p21、p27、p53 及p57 基因啟動(dòng)子區(qū)（-2 000-+100）分析發(fā)現(xiàn)，p21、p27 及p53 基因啟動(dòng)子區(qū)均存在ZNF32 轉(zhuǎn)錄結(jié)合序列，因此推測(cè)ZNF32 可能通過(guò)靶向調(diào)控p21、p27 或p53 基因表達(dá)調(diào)控山羊皮下脂肪細(xì)胞增殖。

4 結(jié)論

本研究成功克隆獲得山羊ZNF32 基因序列（登錄號(hào)：MZ054397），全長(zhǎng)1 049 bp，CDS 區(qū)822 bp，共編碼273 個(gè)氨基酸。組織表達(dá)譜顯示，ZNF32 在山羊各組織中均有表達(dá)，在大腸中表達(dá)量最高。時(shí)序表達(dá)譜顯示，隨著誘導(dǎo)分化時(shí)間的延長(zhǎng)，ZNF32的表達(dá)量升高，ZNF32 基因可能促進(jìn)皮下脂肪細(xì)胞的分化。過(guò)表達(dá)ZNF32 后抑制增殖抑制相關(guān)基因p27 及p57 的表達(dá)，干擾ZNF32 后促進(jìn)了增殖抑制基因p21、p27、p53 及p57 基因的表達(dá)，ZNF32 可能通過(guò)靶向p53、p21 及p27 基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)皮下脂肪細(xì)胞增殖的調(diào)控。