基于網絡藥理學和分子對接技術探討芪藤消濁顆粒治療慢性腎小球腎炎的作用機制

程雨，張磊，王億平

慢性腎小球腎炎（chronic glomerulonephritis，CGN）又稱慢性腎炎（chronic nephritis，CN），病理以腎小球損害為主，腎小球系膜細胞的異常增殖和腎小管間質區免疫介導的炎癥反應在CGN的進展中發揮關鍵作用［1-2］。CGN是導致慢性腎臟病最常見的病因，最終可發展為終末期腎臟病。目前慢性腎炎的治療沒有特異性方法，主要以防止和延緩腎功能進行性惡化、改善臨床癥狀為目的。中藥復方因其安全性良好，同時具有多成分、多靶點、多通路治療疾病的特點逐漸受到關注。

中醫認為脾虛、濕濁、血瘀在CGN基本病機中起關鍵作用，安徽中醫藥大學第一附屬醫院國家級名老中醫曹恩澤先生提出“補脾、行水、化瘀”理論，并以此為組方原則創立芪藤消濁顆粒（曾用名：腎康顆粒、腎康沖劑，批號為皖藥制字20170520）治療CGN［3］。芪藤消濁顆粒臨床用于治療慢性腎小球腎炎已有長達20多年的歷史，前期的臨床研究結果表明，芪藤消濁顆粒能有效改善CGN病人的臨床癥狀，其作用機制可能包括降低尿蛋白、改善腎功能、調節細胞免疫功能以及抑制炎癥反應等，且未見明顯毒副作用［4-7］；動物實驗研究證實，芪藤消濁顆粒能有效治療阿霉素誘導的CGN大鼠模型，其作用機制包括調節炎性因子及炎癥基因的表達、抑制炎癥信號通路等［8］。但是，其具體、綜合的相關作用機制還有待進一步的探索。本研究旨在通過網絡藥理學和分子對接技術分析臨床療效確切的芪藤消濁顆粒治療CGN的作用機制，為臨床應用奠定基礎，為進一步實驗研究提供理論思路。

1 資料與方法

1.1 收集復方活性成分將芪藤消濁顆粒（黃芪、雷公藤、益母草、薏苡仁、白茅根、白花蛇舌草、蟬蛻）輸入TCMSP（https：∕∕tcmsp-e.com∕）數據庫［9］進行檢索，以OB≥30%、DL≥0.18篩選和收集所有滿足條件的活性成分［10］。蟬蛻因未被收錄在TCSMP數據庫中，故通過TCMID（http：∕∕www.megabionet.org∕tcmid∕）［11］和HERB（http：∕∕herb.ac.cn∕）數據庫［12］查詢其化合物作為補充。在Pubchem（https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov∕）數據庫檢索蟬蛻所有化合物成分的SMILES結 構 式，輸 入FAFDrugs4（https：∕∕fafdrugs4.rpbs.univ-paris-diderot.fr∕）數據庫，以系統自帶算法“Drug-like soft”作為篩選條件將結果顯示為“accept”的活性成分納入［13］。

1.2 藥物靶點預測在TCMSP數據庫中搜索藥物活性成分對應的靶點信息，運用SwissTargetPrediction（http：∕∕www.swisstargetprediction.ch∕）、SEA（https：∕∕sea.bkslab.org∕）數據庫對蟬蛻活性成分進行靶點預測。通過UniProt（https：∕∕www.uniprot.org∕）數據庫以“Reviewed”和“Human”作為篩選條件將靶點蛋白轉化為基因名稱，未完成轉化的靶點蛋白再通過STRING（https：∕∕string-db.org∕）數據庫轉化作為補充。

1.3 獲取慢性腎小球腎炎疾病基因運用OMIM（https：∕∕www.omim.org∕）［14］、DrugBank（https：∕∕go.drugbank.com∕）［15］、GeneCards（https：∕∕genealacart.genecards.org∕）［16］、PharmGkb（https：∕∕www.pharmgkb.org∕）、TTD（http：∕∕db.idrblab.net∕ttd∕）數 據 庫［17］，以“chronic glomerularnephritis”“chronic nephritis”作為搜索關鍵詞，種屬選擇“Home sapiens”，獲取慢性腎小球腎炎的疾病靶點，整理剔除假陽性結果，運用Draw Venn Diagram（http：∕∕bioinformatics.psb.ugent.be∕webtools∕Venn∕）軟件制作韋恩圖，并獲取并集疾病基因信息。

1.4 獲取藥物與疾病交集基因分別將“1.2”項所得的藥物活性成分基因和“1.3”項所得的疾病基因導入Draw Venn Diagram軟件制作韋恩圖，得出二者交集基因信息。

1.5 構建“中藥活性成分-交集基因”網絡分別用“1.1、1.2、1.4”項中獲取的中藥活性成分、靶點及交集基因制作“network”“type”“list”文本文件，導入Cytoscape 3.8.2軟件繪制“中藥活性成分-交集靶點”網絡圖，并根據degree值的大小設定活性成分節點的大小，degree值越大，活性成分節點面積越大。

1.6 構建蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）［18］網絡及核心基因篩選網絡將“1.4”項所得的藥物與疾病的交集基因信息導入STRING數據庫，物種設置為人，隱藏網絡中游離的節點，最低交互分數設定為0.900，構建芪藤消濁顆粒治療CGN PPI網絡，并下載tsv格式文件，將其導入Cytoscape 3.8.2軟件對數據進行可視化分析，通過其插件CytoNCA分析網絡中靶點的拓撲參數，根據節點連接度（degree centralities，DC）、介數中心性（betweenness centralities，BC）、接近中心性（closeness centralities，CC）、本征向量中心性（eigenvector centralities，EC）為篩選條件評價基因的重要性，找出每個條件大于中位值的基因再次構建網絡，依此循環，篩選出基因功能關聯網絡的核心基因。

1.7 基因本體論（GO）功能與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析將藥物與疾病交集基因導入DAVID（https：∕∕david.ncifcrf.gov∕）數據庫［19］，分別選擇生物學過程（biological processes，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞成分（cellular composition，CC）進行GO富集分析，將校正P值篩選條件設置為≤0.05；KEGG通路富集分析，校正P值設定為≤0.01。通過OmicShare基迪奧生物信息云平臺（https：∕∕www.omicshare.com∕）繪制GO富集條形圖和KEGG通路氣泡圖。

1.8 分子對接將“1.5”項所得的關鍵活性成分作為小分子配體，“1.6”項中篩選的核心靶點作為受體蛋白，運用Pubchem數據庫（https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載關鍵活性成分2D結構的SDF格式文件；通過Uniprot數據庫［20］查找核心靶點，盡可能篩選分辨率高、單鏈∕雙鏈的晶體結構，并在PDB數據庫（https：∕∕www.rcsb.org）下載相應晶體結構的PDB格式文件。采用SailVina平臺進行Autodock vina分子對接。用OpenBabel軟件將分子對接結果pdbqt格式轉化為pdb格式文件，導入PyMOL軟件進行可視化分析，并運用PLIP（https：∕∕plip-tool.biotec.tu-dresden.de∕plip-web∕plip∕index）網站［21］確定結合位點，并將結合位點文件導入PyMOL軟件標記結合位點氨基酸殘基。

2 結果

2.1 芪藤消濁顆粒潛在活性成分及靶點預測獲取芪藤消濁顆粒活性成分102個，其中黃芪20個，雷公藤51個，益母草8個，白花蛇舌草7個，薏苡仁9個，白茅根4個，蟬蛻3個（表1）。綜合TCSMP、SwissTargetPrediction、SEA數據庫得到靶點蛋白共1 655個，經Uniprot、STRING數據庫對靶點蛋白標準化處理，刪除重復值，得到235個基因。

表1 芪藤消濁顆粒“中藥-活性成分-靶點”信息∕個

2.2 不同數據庫慢性腎小球腎炎疾病基因獲取刪除重復值后，5個不同疾病基因數據庫共收集并集基因1 847個（圖1），其中GeneCards數據庫1 789個，OMIM數 據 庫19個，PharmGkb數 據 庫64個，TTD.數據庫19個，DrugBank數據庫5個。

2.3 構建藥物活性成分與疾病基因交集藥物活性成分靶點對應的基因與疾病基因取交集，235個藥物活性成分靶點對應的基因與1 847個疾病基因取交集，得到交集基因134個。

2.4 構建芪藤消濁顆粒“中藥活性成分-交集靶點”網絡剔除沒有對應靶點或重復的活性成分，“中藥活性成分-交集靶點”網絡（圖2）共有183個節點，包括49個活性成分節點，134個靶點節點，511條邊。得出degree值最大的前3個活性成分分別是quercetin（槲皮素）（degree=87）、Kaempferol（山柰酚）（degree=32）、triptolide（雷公藤內酯）（degree=31）。

2.5 交集基因蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡和網絡核心基因獲取運用STRING數據庫構建交集基因PPI網絡（圖3），該網絡有115個節點，496條邊。其中節點代表蛋白質，不同節點顏色代表蛋白質不同作用的外殼，邊代表蛋白質-蛋白質關聯，不同顏色代表基于不同的證據類型，包括文本挖掘、實驗研究、數據庫、共表達、鄰居節點、基因融合以及共定位。經過對網絡拓撲參數進行四次篩選（圖4），最終獲取5個核心基因，分別為MAPK1、JUN、STAT3、RELA、IL6（表2）。

表2 芪藤消濁顆粒治療慢性腎小球腎炎的核心基因篩選

2.6 芪藤消濁顆粒治療慢性腎小球腎炎的交集靶點GO富集分析、KEGG通路富集分析在DAVID數據庫中，輸入交集基因通過篩選條件進行GO功能注釋，獲得BP富集條目393條，主要與炎癥反應、老化、免疫應答、對缺氧的反應、氧化應激反應、細胞對脂多糖的反應、凋亡過程的負面調節、細胞增殖的正調控、血小板激活、缺乏配體的外源性凋亡信號通路等關系密切；CC富集條目36條，包括細胞質基質、細胞膜、外泌體、細胞外基質等；MF富集條目75條，主要與酶結合、蛋白質結合、轉錄因子結合、酶活性、蛋白質活性、細胞因子活性和轉錄因子活性等相關。通常認為富集P值越小與疾病之間的關系越密切，故截取P值最小的前20條目展示（圖5）。

KEGG通路經過富集閾值P≤0.01的drugs-disease篩選條件共得到216條通路，篩選前20條信號通路進行展示（圖6），主要包括TNF信號通路、TOLL樣受體信號通路、HIF-1信號通路、NOD樣受體信號通路、NF-κB信號通路等。

2.7 核心活性成分與核心靶點分子對接將篩選得到的3個核心活性成分作為配體與5個核心靶點蛋白（MAPK1、JUN、STAT3、RELA、IL6）作為受體進行分子對接。核心靶點蛋白PDB ID的選取及其與活性成分的結合能信息見表3。對接結果顯示槲皮素、山柰酚、雷公藤甲素能夠通過形成氫鍵、鹽橋、疏水作用和陽離子-π用于核心靶點蛋白穩定地對接，并且具有較好的結合活性。

表3 芪藤消濁顆粒治療慢性腎小球腎炎核心活性成分與核心靶點蛋白結合能

3 討論

中藥方劑是中醫藥理論的主要表現形式，是中醫整體觀念和辯證論治思想集中體現。面對日新月異的現代醫學發展，課題組結合蛋白組學及轉錄組學多層次多參數地為芪藤消濁顆粒治療慢性腎炎作用機制研究奠定了扎實的基礎［22-26］。而網絡藥理學的興起為進一步研究中藥復方提供了新方向，通過構建活性成分群與疾病靶點蛋白網絡直觀地揭示了芪藤消濁顆粒可以通過多成分、多靶點發揮治療慢性腎小球腎炎的效用。

本研究發現，芪藤消濁顆粒重要潛在活性成分共49種，根據相關文獻研究報道，篩選得到的核心活性成分槲皮素、山柰酚、雷公藤甲素等均具有強大的抗炎潛力和免疫調節作用。槲皮素作為一種有效抗炎物質，其作用機制可能是抑制中性粒細胞IL-6的表達改善炎癥反應［27］；通過阻止促炎細胞因子TNF-α、IL-1β激活細胞外信號相關激酶（ERK）、應激激活蛋白激酶（JNK）與核因子κB（NF-κB），抑制細胞中炎性細胞因子和趨化因子的產生，增強抗炎因子活性，從而拮抗炎癥基因的轉錄活性，直接或間接地抑制炎癥基因表達［28-29］。山柰酚可通過抑制脂氧合酶（5-LOX）途徑［30］，顯著性抑制細胞炎癥介質前列腺素（PGE2）［31］、炎性細胞因子、環氧合酶2（COX2）的表達，抑制一氧化氮合酶（NOS）和一氧化氮（NO）的產生，從而在炎癥級聯反應，特別是在炎癥的關鍵啟動步驟和信號傳導方面發揮調節作用［32-33］；同時通過抑制NF-κB及相關轉錄因子的活性參與調節機體免疫功能［34］。雷公藤甲素能抑制炎性細胞因子趨化、炎癥介質（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8）產生與釋放，抑制炎癥信號通路（Toll樣受體信號通路、MAKP信號通路、NF-κB信號通路）、調節炎癥基因（miR-224-3p、miR-130a）功能表達從而抑制炎癥反應［35-36］。

PPI網絡拓撲參數分析結果顯示，MAPK1、JUN、STAT3、RELA、IL6為排列前五的關鍵靶點。MAPK1作為MAPK信號轉導途徑的重要組成部分，在MAPK∕ERK信號級聯中起著關鍵調節作用。參與激活炎癥反應啟動的信號級聯，通過轉錄、翻譯、細胞骨架重新排列來調節細胞增殖、黏附、凋亡和分化等多種生物功能［37］。IL-6作為攻擊性炎癥介質，參與啟動和維持免疫調節中的炎癥反應，通過自分泌及旁分泌促進腎小球系膜細胞增殖和系膜基質增多，參與誘導內皮細胞毒性反應，發揮致腎小球炎癥作用，同時可導致腎組織免疫損傷［38］。STAT3是參與腎臟炎癥反應的重要信號分子，STAT3表達高低與間質炎癥浸潤程度相關［39］。JUN可引起與凋亡有關的基因的過度表達，誘發機體內炎性因子的大量產生與釋放［40］。RELA-NFKB1復合物作為多效性轉錄因子，是一系列信號轉導事件的終點，參與機體內炎癥、免疫等多種生物學過程，也是T細胞中細胞因子基因表達所必需的［41］。這些因子均可直接或間接地參與細胞增殖、分化及介導免疫炎癥反應，芪藤消濁顆粒很可能是通過調節上述靶基因，從而影響CGN的疾病進展。結合分子對接結果分析，配體與受體的結合能大多數均≥-7.0 kJ∕mol，且結合位點成鍵多，均有穩定的氫鍵和疏水鍵，提示構象穩定，充分體現了芪藤消濁顆粒治療CGN的作用機制可能與通過多成分作用于多靶點發揮調節免疫介導抗炎反應有關。

KEGG通路富集分析前20條信號通路，其中NFκB信號通路能夠調節細胞凋亡、免疫反應，誘導炎性因子的表達，促進腎小球基底膜硫酸類肝素蛋白多糖分解代謝，致使腎小球濾過屏障受損，形成蛋白尿［42］。腫瘤壞死因子（TNF）是觸發機體免疫和炎癥反應的重要細胞介質，TNF信號通路還可通過家族蛋白的募集激活多種信號轉導途徑，包括NF-kB和MAPK途 徑，調 控細胞 凋 亡和免 疫炎癥 反 應［43］。TOLL樣受體信號通路與NOD樣受體信號通路在炎癥、免疫細胞調控方面發揮協同作用，均能夠通過對病原相關分子模式（PAMPs）的識別，快速激活接頭蛋白、信號復合體和NF-κB轉錄因子負責的細胞內信號級聯反應，調節機體內促炎細胞因子、抗炎細胞因子及趨化因子的產生與釋放，激活啟動多種免疫反應［44］。HIF-1信號通路可在自身免疫性疾病病人炎癥部位低氧環境下被激活，HIF可以激活NFκB信號通路刺激免疫細胞對低氧的應答，從而導致下游炎性因子基因轉錄激活［45］。芪藤消濁顆粒可能通過調節與CGN發病機制密切相關的通路發揮抗炎及免疫調節作用。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學方法和分子對接技術對中藥復方芪藤消濁顆粒治療慢性腎炎的分子機制進行闡述，認為其可能與復方中所含的多種有效成分協同作用參與調節炎癥基因表達、抗炎因子和炎性細胞活性，調控免疫炎癥相關信號通路轉導有關。

（本文圖1～6見插圖1-2）

圖1 不同數據庫慢性腎小球腎炎疾病基因并集圖 圖2 芪藤消濁顆粒治療慢性腎小球腎炎“中藥活性成分-靶點”網絡圖 圖3 芪藤消濁顆粒治療慢性腎小球腎炎交集基因蛋白質-蛋白質相互作用網絡 圖4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡拓撲結構篩選核心基因 圖5 芪藤消濁顆粒治療慢性腎小球腎炎的作用靶點GO生物學功能注釋富集分析 圖6 芪藤消濁顆粒治療慢性腎小球腎炎的作用靶點KEGG 通路富集分析