蘆丁通過抑制NF-κB信號通路緩解大鼠結腸炎的研究

郭建軍，凌應飛，李強

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是以直腸和結腸的淺表性、非特異性炎癥病變為主的腸道疾病，其患大腸癌的發生率明顯高于一般人群。近年來，UC的發病率呈逐漸上升的趨勢，已成為醫學研究領域的熱點［1］。目前潰瘍性結腸炎的病因和發病機制尚未完全闡明，大多數學者認為是免疫、遺傳、環境等多方面因素作用的結果。由于該病病程較長，易反復發作，臨床上對該病的診治較為困難［2］。當前西醫藥用于治療UC的方法包括氨基水楊酸制劑、糖皮質激素、抗生素等，這些藥物雖有一定療效，但長期大量服用會導致副作用，停藥后易復發等問題［3］。有學者的研究結果表明，核因子κB（NFkB）信號通路的激活往往伴有腫瘤或炎癥的發生，并起著至關重要的作用［4-5］。因此，抑制NF-κB信號通路，有利于UC的緩解。

蘆丁（Rutin）是一種從蘆丁中提取得到的黃酮類化合物，具有多種生物活性，例如抗氧化，抗炎，抗糖尿病，抗病毒，心血管保護等［6-8］。有研究報道，蘆丁通過抑制病人腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、C反應蛋白、腦鈉尿肽等，進而起著保護心臟的作用［9］。此外，楊巧麗等［10］發現蘆丁對大鼠佐劑性關節炎具有抗炎和改善腎臟功能的作用。Power等［11］的研究顯示蘆丁可減輕結腸炎的程度和組織損傷。褚旭芳等［12］發現蘆丁可抑制腸固有層Th細胞的應答來緩解實驗性結腸炎的病變。但蘆丁在緩解UC中的研究較少，為此，本研究在2020年4—5月間探討了蘆丁對右旋葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的UC大鼠的治療作用，為蘆丁治療UC提供參考。且本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑SD雄性大鼠購自斯貝福（北京）生物技術有限公司；DSS、蘆丁（純度為99%）、水合氯醛均購自Sigma-Aldrich（美國）；小鼠TNFα ELISA試劑盒購自Biolegend公司；小鼠白細胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司；髓過氧化物酶（MPO）試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒（BCA試劑盒）購自Thermo Fisher Scientific公司；核因子κB p65（NF-κB p65）、人磷酸化IκB激酶-α（p-IκBα）、IκB激酶-α（IκBα）、β-肌 動 蛋 白（β-actin）抗 體 購 自Cell Signaling Technology。

1.2 動物分組和模型建立50只雄性大鼠隨機數字表法分為五組，每組10只。分別為對照組，模型組，蘆丁組（20、40、80 mg∕kg）。大鼠用10%水合氯醛（300 mg∕kg）腹腔注射麻醉。起效后，以硅膠管輕插入其肛門處約8 cm，再向腸內緩慢推入3%DSS溶液0.25 mL。提尾倒置大鼠30 s，確保造模液在腸腔彌散分布。造模24 h后，蘆丁組大鼠給予腹腔注射低中高濃度的蘆丁。連續給藥5 d后，脫頸椎法處死大鼠，收集大鼠結腸組織。

1.3 DAI檢測指標在整個實驗期間，每日觀察并記錄各組大鼠的一般情況，包括精神狀況、活動、大鼠的糞便性狀及便血情況，記錄各組大鼠的生存率，并計算疾病活動指數（disease activity index，DAI）。DAI=（體質量下降得分+糞便性狀得分+便血情況得分）∕3。評分參照DAI評分結果進行。見表1。

表1 潰瘍性結腸炎大鼠DAI評分檢測結果標準值

1.4 大鼠結腸組織MPO活性的測定收集各組大鼠結腸組織后，用生理鹽水對結腸組織進行漂洗，以達到摒除其腸組織表面糞便、血液等黏附物。稱取約50 mg結腸組織，加入勻漿介質制備成5%組織勻漿。按照MPO試劑盒說明書測定MPO活性。

1.5 血清TNF-α和IL-6水平測定稱取20 mg各組大鼠結腸組織，用電動混勻器把結腸組織磨成勻漿，3 000g離心5 min，取上清液。按照ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠結腸組織勻漿上清液中TNF-α、IL-6的釋放水平。

1.6 免疫印跡分析取各組結腸組織20 mg，加入200 μL組織蛋白裂解液，冰浴充分研磨后裂解20 min，在4℃、12 000g轉速下離心10 min，取上清液，用BCA測定總蛋白濃度。30 μg上樣，以10%的SDS凝膠分離，完成后轉移至PVDF膜上。再用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗p65、p-IκBα、IκBα，4℃下孵育過夜，隨后加入二抗，室溫下孵育控制在1 h左右。然后用Supersignal West Pico系統顯影。

1.7 統計學方法采用SPSS 19.0進行統計，計量資料以xˉ±s表示，采用one way ANOVA對多組間數據進行性比較檢驗，行LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蘆丁對DSS誘導DAI評分的影響從造模開始后即對各組大鼠每日進行固定時間評估其DAI評分，結果見表2。模型組大鼠造模后出現排便次數增加，軟便、水樣便、大便隱血、血便等情況。蘆丁組大鼠情況有一定的改善。第5天時，模型組DAI評分為（2.98±0.57）分，顯著高于對照組的0分（t=16.53，P＜0.001）；而蘆丁組（20、40、80 mg∕kg）的DAI評分［（1.97±0.46）、（1.38±0.38）、（1.09±0.39）分］顯著低于模型組（2.98±0.57）分（t=4.36，7.39，8.65，均P＜0.001），并呈劑量依賴性。

2.2 蘆丁對DSS誘導的MPO活性的影響與對照組（0.52±0.09）U∕g相比，模型組大鼠結腸組織中MPO活性（1.26±0.07）U∕g明顯升高（t=20.52，P＜0.001）；而蘆丁組（20、40、80 mg∕kg）MPO活性［（0.98±0.06）、（0.75±0.08）、（0.74±0.04）U∕g］顯 著 低 于 模 型 組（1.26±0.07）U∕g（t=9.60，15.17，20.40，均P＜0.001），且高劑量組（80 mg∕kg）的MPO活性最低。結果提示，蘆丁可以有效降低DSS誘導的大鼠UC中MPO活性的異常升高。

2.3 蘆丁對DSS誘導的TNF-α和IL-6的影響采用ELISA法檢測各組大鼠結腸組織中IL-6、TNF-α的水平。模型組中TNF-α水平［（5.19±0.93）μg∕L］顯著高于對照組（0.36±0.07）μg∕L（t=16.38，P＜0.001）；蘆丁組（20、40、80 mg∕kg）的TNF-α水平（4.26±0.87）、（3.75±0.72）、（3.16±0.52）μg∕L均顯著低于模型組（5.19±0.93）μg∕L（t=2.31，3.87，6.03，均P＜0.05）。同樣地，模型組中IL-6水平（6.54±0.85）μg∕L顯著高于對照組（0.18±0.03）μg∕L（t=23.65，P＜0.001）；蘆丁組（20、40、80 mg∕kg）的IL-6水平（5.12±0.93）、（4.28±0.72）、（3.72±0.65）μg∕L均顯著低于模型組（6.54±0.85）μg∕L（t=3.56，6.41，8.33，均P＜0.05）。結果表明蘆丁可以抑制UC大鼠局部結腸組織TNF-α和IL-6的水平。

2.4 蘆丁對DSS誘導的NF-κB的影響最后，采用蛋白質印跡法研究了蘆丁對DSS誘導的NF-κB信號通道的影響。DSS誘導可明顯激活p-IκBα［對照組的（3.24±0.31）倍］和核p65［對照組的（2.64±0.25）倍］的表達（t=22.85，20.74，均P＜0.001），而蘆丁（20、40、80 mg∕kg）處理可有效地降低p-IκBα［對照組的（2.76±0.24）、（2.43±0.22）、（1.16±0.09）倍］（t=3.87，6.74，20.38，均P＜0.05）和核p65［對照組的（1.74±0.21）、（1.46±0.14）、（1.25±0.11）倍］（t=8.72，13.02，16.09，均P＜0.001），且高劑量組（80 mg∕kg）時p-IκBα和核p65的表達最低。結果表明，蘆丁可有效下調DSS激活的NF-κB信號通路。

3 討論

DSS誘導結腸炎模型具有簡單，快速，可重復性和可控性等優點，廣泛應用在炎癥性腸病的研究中，該模型能夠模擬人UC，出現腹瀉、血便、體質量減輕等癥狀［13］。本研究采用DSS誘導結腸炎模型，研究了蘆丁對結腸炎的保護作用及潛在的機制，結果表明蘆丁能有效抑制DSS誘導的結腸炎，降低MPO、TNF-α、IL-6水平，并抑制NF-κB信號通路的激活。

DAI評分是一種大鼠精神狀況、活動、糞便性狀及便血情況的綜合評價指標，可反映結腸炎的狀況。DSS誘導后，模型組DAI評分顯著升高，而給予蘆丁后，蘆丁組（20、40、80 mg∕kg）DAI較模型組顯著降低，且高劑量組（80 mg∕kg）的DAI評分最低。結果提示，蘆丁可有效緩解DSS誘導的UC。MPO為血紅素蛋白，是嗜中性多形核粒細胞功能活性及其狀態的產物，可直接誘發MPO下的中性粒細胞浸潤性改變［14］。我們的研究結果顯示：模型組MPO水平顯著高于對照組；而蘆丁處理則可以有效地降低DSS誘導MPO的異常升高，且高劑量組（80 mg∕kg）的MPO活性最低。結果表明，蘆丁可以有效抑制DSS誘導UC大鼠結腸組織MPO的活性。此外，DSS誘導大鼠結腸炎后，可引起TNF-α和IL-6等促炎因子大量釋放［15］。TNF-α是炎癥和免疫反應中的一種重要介質，由多種細胞分泌，包括脂肪細胞、活化的單核細胞、巨噬細胞、B細胞、T細胞和成纖維細胞［16］。IL-6作為網絡中細胞因子的主產物，在提示急性炎癥反應環節發揮了關鍵性作用，該指標水平的異常升高，誘導C反應蛋白和降鈣素原的生成，促進炎癥的發生和發展［17］。TNF-α和IL-6受NF-κB信號通路的調控，其水平異常升高將導致大鼠結腸組織發炎和損傷，嚴重可誘發結腸癌。本研究評估了蘆丁對DSS誘導UC的TNF-α和IL-6水平，發現蘆丁（20、40、80 mg∕kg）處理可以有效地降低結腸組織TNF-α和IL-6水平，且高劑量組（80 mg∕kg）的TNF-α和IL-6水平最低。結果表明，蘆丁可有效緩解DSS誘導TNF-α和IL-6水平的異常升高。

NF-κB在炎癥中負責調控炎癥基因轉錄，為最重要的基因轉錄因子。NF-κB激活后，導致p65從細胞質進入細胞核中并發生易位，調控炎性細胞因子的分泌，同時NF-κB又被這些炎性因子進一步激活［18］。IκBα是NF-κB的抑制劑，刺激因子誘導IκB磷酸化，從而釋放NF-κB，調節炎癥介質的合成與釋放［19］。有研究發現，UC病人腸上皮細胞和黏膜巨噬細胞中，活化的NF-κB表達明顯增加［20］。因此，我們評估了蘆丁對NF-κB信號通路的影響，以明確蘆丁緩解UC的機制，結果顯示：蘆丁（20、40、80 mg∕kg）處理后p-IκBα和核p65的表達較模型組顯著下降，且高劑量組（80 mg∕kg）時p-IκBα和核p65的表達最低。結果證實，蘆丁可有效下調DSS誘導UC的NF-κB信號通路的激活。

綜上所述，蘆丁可有效緩解DSS誘導的大鼠潰瘍性結腸炎的癥狀和炎癥反應，其作用機制可能通過下調NF-κB信號通路實現。