千金藤素調(diào)控肝癌細胞HepG2增殖和凋亡的實驗研究

楊曉玲，賴麗金，譚桂蘭

肝癌是一種嚴重威脅人類生命健康和影響人類生活質(zhì)量的惡性腫瘤，其發(fā)生是一個多因素、多步驟的復雜過程，目前肝癌的發(fā)生機制還未完全闡明［1］。手術切除、放射治療和化療等是常見的肝癌治療手段，這些治療方法取得了顯著成果，但仍然不能滿足需求［2］。千金藤素是從傳統(tǒng)中藥千金藤中提取出來的活性成分，具有抗炎、提高免疫力等功效［3］。很多研究顯示，千金藤素還具有抗腫瘤作用，對于腫瘤細胞的增殖具有抑制作用，并且可以在體外誘導細胞凋亡發(fā)生［4］。子宮內(nèi)膜癌細胞經(jīng)過千金藤素處理以后，細胞凋亡增多，細胞增殖能力下降［5］。在研究千金藤素對結腸癌生長影響的研究中發(fā)現(xiàn)，千金藤素可以有效下調(diào)腫瘤中核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號通路的激活程度［6］。NFκB是在腫瘤組織中異常激活的信號通路，抑制其激活可以阻礙腫瘤進展［7］。目前對于千金藤素對肝癌細胞增殖凋亡的影響和機制還不清楚。本研究于2020年1—6月，以肝癌細胞HepG2作為實驗對象，探討千金藤素處理后肝癌細胞增殖和凋亡變化，以期為千金藤素治療肝癌提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料Bcl-2相關X蛋白（Bax）抗體、p21抗體購自美國Proteintech Group公司；千金藤素（BP0334）購自上海紀寧生物科研有限公司；活化胱天蛋白酶3（cleaved-caspase-3）抗體購自美國Abcam；細胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體、核因子κB p65（NF-κB p65）抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；NF-κB信號激活劑腫瘤壞死因子-α（TNF-α）購自美國Sigma；肝癌細胞HepG2購自通派（上海）生物科技有限公司。

1.2 MTT方法檢測細胞增殖活性取對數(shù)期的肝癌細胞，將細胞種植于96孔板，接種的細胞懸浮液濃度為3×103個細胞∕100 μL，將細胞放在培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，然后把上清吸棄，將細胞分成對照組和CEP組（5、10、20、40、80 μmol∕L共5個濃度梯度），對照組細胞用不添加千金藤素的培養(yǎng)液培養(yǎng)，CEP組細胞中添加5、10、20、40、80 μmol∕L千金藤素培養(yǎng)液。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d以后，分別在每個孔內(nèi)添加MTT各15 μL（濃度為5 g∕L），放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用移液槍小心吸盡孔內(nèi)的上清，繼續(xù)添加150 μL的DMSO溶液，震蕩孵育結合10 min，在酶標儀上分別測定每個孔的A值，檢測波長設置為490 nm。

1.3 PI單染檢測細胞周期將對照組和CEP組細胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)2 d以后，以0.25%的胰蛋白酶消化，收集細胞，添加冰預冷的乙醇（濃度為75%）溶液固定后，添加PI染液孵育結合20 min。放在流式細胞儀中測定細胞周期變化。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡將對照組和CEP組細胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)2 d以后，以0.25%的胰蛋白酶消化，收集細胞，用PBS溶液將細胞洗滌2次，然后添加PI以及Annexin V-FITC染色液混合，加入300 μL的結合緩沖液，在使用流式細胞儀檢測之前添加200 μL的結合緩沖液混合。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κB p65蛋白表達將對照組和CEP組細胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)2 d以后，以0.25%的胰蛋白酶消化，收集細胞，在細胞沉淀中加入蛋白裂解試劑，置于冰水混合物上孵育20 min，轉(zhuǎn)移到4℃離心機中，以12 000g高速離心10 min。移液槍把離心后的上清溶液轉(zhuǎn)移到離心管中，使用二辛可寧酸（BCA）法檢測蛋白濃度。在蛋白上清中添加5×上樣緩沖液（loading buffer）均勻混合以后，放在沸水浴中孵育5 min，變性后的蛋白在-20℃保存。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制用10%分離膠以及5%濃縮膠。按照每個孔中50 μg蛋白上樣，首先以90 V的電壓在濃縮膠中電泳，等到溴酚藍染料快要進入到濃縮膠以后，把電壓調(diào)整到120 V繼續(xù)電泳，溴酚藍進入到底部以后停止電泳。取出凝膠，把NC膜裁剪成合適大小，在80 V電壓條件下電轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜在冰上進行，轉(zhuǎn)膜進行60 min。把NC膜放在封閉液（5%牛血清白蛋白溶液）中孵育2 h，然后將NC膜放在含有一抗的平皿內(nèi)，在4℃過夜。NC膜置于含有二抗孵育液的平皿內(nèi)，在37℃孵育2 h。ECL方法發(fā)光。內(nèi)參設置為GAPDH，分析目的蛋白表達水平。cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κB p65一抗稀釋倍數(shù)為1∶600、1∶600、1∶600、1∶400、1∶600，二抗稀釋倍數(shù)為1∶4 000。

1.6 NF-κB信號激活劑對千金藤素調(diào)控肝癌細胞增殖、周期和凋亡影響肝癌細胞用20 μg∕L NF-κB信號激活劑TNF-α和20 μmol∕L的千金藤素共同處理記為CEP+TNF-α組，按照MTT、PI單染和Annexin V-FITC∕PI雙染法檢測細胞增殖活性、周期和凋亡變化，蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κB p65蛋白水平，步驟同上。

1.7 統(tǒng)計學方法用SPSS 21.0軟件分析本研究數(shù)據(jù)，按照±s表示，兩組數(shù)據(jù)間比較用t檢驗和Dunnett-t檢驗，多組差異比較用單因素方差，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 千金藤素對肝癌細胞增殖活性影響10、20、40、80 μmol∕L的千金藤素處理后的肝癌細胞增殖活性降低（表1）。20 μmol∕L的千金藤素對肝癌細胞增殖抑制率約為50%，選用20 μmol∕L的千金藤素做后續(xù)研究。

表1 千金藤素（CEP）處理后肝癌細胞吸光度（A值）變化

表1 千金藤素（CEP）處理后肝癌細胞吸光度（A值）變化

注：①與0 μmol∕L比，均P＜0.05。

組別對照組CEP 5 μmol∕L組CEP 10 μmol∕L組CEP 20 μmol∕L組CEP 40 μmol∕L組CEP 80 μmol∕L組F值P值重復次數(shù)3 3 3 3 3 3 A值0.68±0.05 0.63±0.06 0.50±0.03①0.36±0.03①0.28±0.02①0.21±0.01①77.20＜0.001

2.2 千金藤素對肝癌細胞周期和凋亡影響千金藤素處理后的肝癌細胞G0∕G1期細胞比例升高，細胞凋亡率升高，細胞中周期促進因子cyclin D1蛋白水平下降，周期抑制因子p21蛋白水平升高，凋亡促進蛋白Bax、cleaved-caspase-3水平升高（表2）。千金藤素阻滯肝癌細胞周期并誘導細胞凋亡。

表2 千金藤素處理后肝癌細胞周期分布比例、凋亡率和cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3水平

表2 千金藤素處理后肝癌細胞周期分布比例、凋亡率和cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3水平

注：CEP為千金藤素，cyclin D1為細胞周期蛋白D1，Bax為Bcl-2相關X蛋白，cleaved caspase-3為活化胱天蛋白酶3。

組別對照組CEP組t值P值重復次數(shù)3 3細胞周期比例∕%G0∕G1 50.61±4.17 65.81±3.73 4.71 0.009 S 18.35±1.16 10.54±1.09 8.50 0.001 G2∕M 31.04±2.81 23.65±1.50 4.02 0.016凋亡率∕%2.18±0.12 13.47±1.58 12.34＜0.001 cyclin D1 0.68±0.07 0.39±0.04 6.20 0.003 p21 0.20±0.03 0.41±0.05 6.18 0.003 Bax 0.32±0.03 0.66±0.06 8.71 0.001 cleaved caspase-3 0.15±0.02 0.31±0.04 6.10 0.004

2.3 千金藤素對肝癌細胞中NF-κB信號的影響千金藤素處理后的肝癌細胞中NF-κB關鍵蛋白NFκBp65水平［（0.19±0.02）比（0.36±0.05），t=5.41，P＜0.05］下降（圖1）。千金藤素抑制肝癌細胞中NF-κB信號激活。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測千金藤素對肝癌細胞中NF-κBp65蛋白表達影響

2.4 NF-κB信號激活劑對千金藤素影響肝癌細胞增殖活性、周期和凋亡的作用與單純經(jīng)過千金藤素處理的細胞比較，NF-κB信號激活劑TNF-α和千金藤素共同處理后的肝癌細胞增殖活性升高，G0∕G1期比例降低，凋亡率降低（圖2，表3）。NF-κB信號激活劑逆轉(zhuǎn)千金藤素對肝癌細胞增殖抑制、周期阻滯和凋亡促進作用。

表3 NF-κB信號激活劑和千金藤素（CEP）處理后肝癌細胞A值、細胞周期分布比例和凋亡率

表3 NF-κB信號激活劑和千金藤素（CEP）處理后肝癌細胞A值、細胞周期分布比例和凋亡率

注：CEP為千金藤素，TNF-α為腫瘤壞死因子-α。

組別CEP CEP+TNF-α t值P值重復次數(shù)3 3 A值0.35±0.04 0.46±0.03 3.76 0.020細胞周期比例∕%G0∕G1 66.38±5.80 53.27±4.12 3.19 0.033 S 11.94±1.21 22.65±1.27 10.58 0.001 G2∕M 21.68±2.37 22.08±2.15 0.22 0.837凋亡率∕%14.17±1.28 8.12±0.96 6.55 0.003

圖2 流式細胞術檢測NF-κB信號激活劑和千金藤素處理后肝癌細胞凋亡變化

2.5 NF-κB信號激活劑對千金藤素影響肝癌細胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NFκBp65蛋白表達作用與單純經(jīng)過千金藤素處理的細胞比較，NF-κB信號激活劑TNF-α和千金藤素共同處理后的肝癌細胞中cyclin D1蛋白水平升高，p21、Bax、cleaved-caspase-3蛋 白 水 平 降 低，NF-κBp65蛋白水平升高（圖3，表4）。NF-κB信號激活劑逆轉(zhuǎn)千金藤素對肝癌細胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κBp65蛋白表達影響。

表4 NF-κB信號激活劑和千金藤素處理后肝癌細胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κBp65蛋白水平∕

表4 NF-κB信號激活劑和千金藤素處理后肝癌細胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κBp65蛋白水平∕

注：CEP為千金藤素，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，cyclin D1為細胞周期蛋白D1，Bax為Bcl-2相關X蛋白，cleaved caspase-3為活化胱天蛋白酶3，NF-κB p65為核因子κB p65。

組別CEP CEP+TNF-α t值P值重復次數(shù)3 3 cyclin D1 0.36±0.03 0.54±0.06 4.72 0.009 p21 0.43±0.05 0.20±0.02 7.31 0.002 Bax 0.59±0.07 0.39±0.04 4.28 0.013 cleaved-caspase-3 0.34±0.03 0.18±0.02 7.50 0.002 NF-κBp65 0.35±0.05 0.52±0.04 4.56 0.010

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測NF-κB信號激活劑和千金藤素處理后肝癌細胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κBp65蛋白水平

3 討論

本研究表明，千金藤素處理后的肝癌細胞增殖能力下降，千金藤素具有抑制肝癌細胞生長的作用。千金藤素是一種雙親性、帶有正電荷的生物堿，能夠增加質(zhì)膜的穩(wěn)定性，提高機體免疫力、抑制炎癥發(fā)生［8］。千金藤素還具有抗腫瘤生長的作用，單獨使用千金藤素能夠抑制腫瘤細胞的生長并提高機體免疫力［9］。研究顯示，千金藤素可以在體外抑制口腔鱗癌、結腸癌等腫瘤細胞增殖［10-11］。本研究結果與上述研究報道相符合，均提示千金藤素具有體外抗腫瘤細胞生長的作用。

研究表明，千金藤素抑制腫瘤細胞生長與影響細胞周期進程有關［12］。細胞周期進展是細胞增殖的關鍵，細胞從上一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂結束稱為一個細胞周期，在這一過程中，細胞周期調(diào)控因子扮演重要角色［13］。cyclin D1是細胞周期的正調(diào)控因子，其可以促進細胞從G0∕G1期向S期轉(zhuǎn)變［14］。p21是細胞周期的負調(diào)控因子，其表達水平升高后可以抑制腫瘤細胞有序進展［15］。細胞凋亡減少是腫瘤發(fā)生的重要特征，細胞凋亡與細胞內(nèi)凋亡相關蛋白的表達有關，其中Bcl-2和caspase蛋白家族是目前研究最多的與細胞凋亡有關的調(diào)節(jié)因子［16］。Bax是Bcl-2蛋白家族成員，其在細胞凋亡過程中發(fā)揮促進作用［17］。caspase-3是caspase凋亡級聯(lián)反應的下游執(zhí)行因子，其活化后形成cleavedcaspase-3被認為是細胞凋亡發(fā)生的標志［18］。本研究顯示，千金藤素處理后的肝癌細胞G0∕G1期比例升高，細胞中cyclin D1蛋白水平降低，p21蛋白水平升高，細胞凋亡率升高，細胞中Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達增多，提示千金藤素可以抑制肝癌細胞周期進展并誘導細胞凋亡發(fā)生。

NF-κB是在B細胞中發(fā)現(xiàn)的一種核因子，其常常以二聚體的形式在細胞內(nèi)存在，NF-κB在多種類型的細胞中均有表達，并且參與細胞多種病理和生理過程［19］。NF-κBp65是NF-κB信號轉(zhuǎn)導的必需因子，也是NF-κB信號激活程度的標志［20］。NF-κB與人類腫瘤進展有關，其在腫瘤發(fā)生中過度激活，通過靶向抑制NF-κB的激活可以降低腫瘤的惡性程度［21］。本研究顯示，千金藤素處理以后的肝癌細胞中NF-κB信號激活程度降低，提示千金藤素可能通過抑制NF-κB信號通路調(diào)控肝癌細胞增殖和凋亡。之前的研究報道表明，千金藤素在抵抗結直腸癌等腫瘤細胞惡性生長的同時可以下調(diào)細胞內(nèi)NF-κB信號通路的激活水平，千金藤素作用機制與NF-κB信號有關［6］。本研究表明，NF-κB信號激活劑可以逆轉(zhuǎn)千金藤素對肝癌細胞增殖抑制和凋亡促進作用，提示千金藤素通過抑制NF-κB調(diào)控肝癌細胞增殖和凋亡。

以上表明，千金藤素具有體外抑制肝癌細胞增殖、阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡的作用，其作用機制與抑制NF-κB信號有關。本研究結果為研究千金藤素抗腫瘤作用機制提供了參考，為千金藤素治療肝癌的臨床應用提供了理論資料。在以后的實驗中會對千金藤素的具體作用機制進行探討和驗證。