洛伐他汀調控轉化生長因子-β誘導的卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移的機制研究

弓翠屏，王英

卵巢癌是一種常見女性生殖系統惡性腫瘤。研究表明，由于缺少特異性癥狀和臨床早期診斷方法，導致大多數卵巢癌病人確診時已近晚期或發生轉移［1-2］。對于已轉移的卵巢癌病人，不能采用手術治療，因此探究新型的化療藥物成為臨床的研究熱點。轉化生長因子-β（TGF-β）是TGF家族的重要成員，在細胞生長、分化中發揮重要的作用［3-4］。研究發現，TGF-β對細胞轉移中上皮細胞間充質化（EMT）過程具有關鍵調控作用［5］。近年來研究發現，他汀類藥物如辛伐他汀、洛伐他汀不僅具有降血脂的作用，還可抑制腫瘤細胞的生長［6-7］。據報道，辛伐他汀可阻礙TGF-β誘導的卵巢癌細胞惡性生物學特性及EMT過程［8］。因此本研究于2019年8月至2020年5月，以卵巢癌SKOV3細胞為研究對象，探究洛伐他汀對TGF-β誘導的SKOV3細胞增殖、侵襲、遷移的影響以及作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料人卵巢癌SKOV3細胞購自美國生物標準品收藏中心公司，胎牛血清、RPMI-1640購自美國Gibco公司，細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本同仁化學研究所，Mataigel膠購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Corning公司，兔抗神經鈣黏素（N-cadherin）抗體（1∶300）、鼠抗波形蛋白（Vimentin）抗體（1∶200）、兔抗上皮鈣黏素（E-cadherin）抗體（1∶100）、兔抗p38絲裂原活化蛋白 激 酶（p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK）抗體（1∶1 000）購自英國Abcam公司，鼠抗Phosphorylation p38 MAPK（p-p38）抗體（1∶2 000）購自美國Santa Cruz公司。電泳轉膜儀購自美國BIO-RAD公司，酶標儀購自美國Sigma公司。

1.2 SKOV3細胞的培養SKOV3細胞在RPMI-1640培養基中培養，加入10%滅活胎牛血清，5%二氧化碳、37℃培養箱中，每1～2天換液，細胞密度達到80%，胰酶消化傳代。

1.3 CCK-8實驗檢測SKOV3細胞增殖洛伐他汀與二甲基亞砜混合，濃度調整為0、5、10、20、40、60 μmol∕L；TGF-β溶于去離子水，濃度為10 μg∕L；采用不同濃度（0、5、10、20、40、60 μmol∕L）洛伐他汀培養SKOV3細胞；以每孔1×104個細胞接種至96孔板，37℃分別培養24 h、48 h、72 h，每孔加入10 μL CCK-8，繼續培養1 h，酶標儀檢測450 nm下SKOV3細胞吸光值，吸光值越大，表示SKOV3細胞增殖活性越強。

1.4 劃痕實驗檢測SKOV3細胞遷移率將SKOV3細胞分為對照組、TGF-β（10 μg∕L）組、洛伐他汀（10 μmol∕L）組、洛伐他汀+TGF-β組；對照組細胞常規培養，TGF-β（10 μg∕L）組、洛伐他汀（10 μmol∕L）組細胞中分別加入10 μg∕L TGF-β和10 μmol∕L洛伐他汀處理，洛伐他汀+TGF-β組細胞中同時加入10 μg∕L TGF-β和10 μmol∕L洛伐他汀處理；收集3×105個SKOV3細胞，接種至6孔板，37℃培養至細胞密度約為80%～90%，采用無菌槍頭在培養板中劃線，通過顯微鏡觀察0 h、24 h劃痕面積，計算遷移率。遷移率=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）∕0 h劃痕面積×100%。

1.5 Transwell法檢測SKOV3細胞侵襲、遷移將Mataigel膠與無血清培養基置于冰上按1∶8混合，取50 μL Mataigel膠稀釋液覆蓋Transwell上室，37℃孵育2 h，凝固后備用。收集各組培養24 h的SKOV3細胞，加入200 μL無血清培養基，吸取含1×105個SKOV3細胞懸浮液加入Transwell上室中，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養基，37℃孵育24 h，棉簽擦掉殘留SKOV3細胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min，顯微鏡（×200）下檢測侵襲細胞數；遷移實驗過程中Transwell上室無須添加Mataigel膠，其與同侵襲。

1.6 蛋白質印跡法檢測蛋白水平收集各組SKOV3細胞，每孔加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，提取總蛋白；將蛋白樣品適量稀釋，100℃加熱5 min；吸取40 μg蛋白樣品上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST清洗3次，加入一抗（按照說明書進行稀釋），4℃過夜，TBST清洗3次，加入二抗，37℃孵育1.5 h，顯影、拍照，Quantity One軟件測定蛋白灰度，分析蛋白灰度值∕GAPDH蛋白灰度值的比值。

1.7 統計學方法SPSS 22.0統計學軟件分析實驗結果，計量資料表示為±s，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗，不同濃度、不同時間作用下細胞增殖活性采用重復測量方差法分析，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度洛伐他汀對TGF-β誘導SKOV3細胞增殖的影響結果見表1，與對照組相比，TGF-β（10 μg∕L）組提高SKOV3細胞24 h、48 h和72 h的增殖活性，均差異有統計學意義（P＜0.05）。與TGF-β（10 μg∕L）組相比，隨著洛伐他汀濃度的不斷增加，5、10、20、40、60 μmol∕L TGF-β誘導的SKOV3細胞24 h、48 h和72 h增殖活性逐漸降低；隨著洛伐他汀作用時間的不斷增加，TGF-β誘導的SKOV3細胞增殖活性逐漸升高；差異有統計學意義（P＜0.05）。其中，10 μmol∕L洛伐他汀在24 h即對TGF-β誘導的SKOV3細胞增殖具有明顯抑制作用。

表1 不同濃度洛伐他汀對轉化生長因子-β（TGF-β）誘導SKOV3細胞增殖的影響

表1 不同濃度洛伐他汀對轉化生長因子-β（TGF-β）誘導SKOV3細胞增殖的影響

注：①與對照組相比，P＜0.05。②與對照組TGF-β（10 μg∕L）組相比，P＜0.05。③與對照組TGF-β+洛伐他汀5μmol∕L組相比，P＜0.05。④與對照組TGF-β+洛伐他汀10 μmol∕L組相比，P＜0.05。⑤與對照組TGF-β+洛伐他汀20 μmol∕L組相比，P＜0.05。⑥與對照組TGF-β+洛伐他汀40 μmol∕L組相比，P＜0.05。

組別對照組TGF-β（10 μg∕L）組TGF-β+洛伐他汀35μmol∕L組TGF-β+洛伐他汀10 μmol∕L組TGF-β+洛伐他汀20 μmol∕L組TGF-β+洛伐他汀40 μmol∕L組TGF-β+洛伐他汀60 μmol∕L組F值P值重復次數3 3 3 3 3 3 3細胞活性（OD 450 nm）24 h 0.224±0.021 0.885±0.066①0.746±0.059②0.625±0.051②③0.518±0.044②③④0.402±0.033②③④⑤0.276±0.022②③④⑤⑥86.95＜0.001 48 h 0.434±0.041 1.365±0.114①1.173±0.135②1.015±0.062②③0.856±0.067②③④0.703±0.062②③④⑤0.536±0.043②③④⑤⑥51.28＜0.001 72 h 0.688±0.061 1.669±0.123①1.458±0.126②1.284±0.086②③1.101±0.081②③④0.917±0.072②③④⑤0.756±0.071②③④⑤⑥47.72＜0.001

2.2 洛伐他汀對TGF-β誘導SKOV3細胞遷移的影響與對照組相比，TGF-β（10 μg∕L）組提高SKOV3細胞遷移率和遷移細胞數，但洛伐他汀（10 μmol∕L）組降低SKOV3細胞遷移率和遷移細胞數；與TGF-β（10 μg∕L）組相比，洛伐他汀降低TGF-β（10 μg∕L）誘導的SKOV3細胞遷移率和遷移細胞數。見表2。

表2 洛伐他汀對TGF-β誘導SKOV3細胞遷移的影響∕

表2 洛伐他汀對TGF-β誘導SKOV3細胞遷移的影響∕

注：TGF-β為轉化生長因子-β。①與對照組相比，P＜0.05。②與TGF-β（10 μg∕L）組或洛伐他汀（10 μmol∕L）組相比，P＜0.05。

組別對照組TGF-β（10 μg∕L）組洛伐他汀（10 μmol∕L）組洛伐他汀+TGF-β組F值P值重復次數3 3 3 3遷移率0.423±0.045 0.786±0.074①0.258±0.026①0.485±0.051②54.16＜0.001遷移細胞數163.895±15.473 357.962±32.632①65.241±6.487①212.341±20.523①②100.86＜0.001

2.3 洛伐他汀對TGF-β誘導SKOV3細胞侵襲的影響對照組、TGF-β（10 μg∕L）組、洛伐他汀（10 μmol∕L）組、洛伐他汀+TGF-β組的細胞侵襲數分別為89.658±8.746、179.635±15.432、32.163±3.054、114.362±10.963，四組之間比較差異有統計學意義（F=100.81，P＜0.001）。與對照組相比，TGF-β（10μg∕L）組提高SKOV3細胞侵襲數，但洛伐他汀（10 μmol∕L）組降低SKOV3細胞侵襲數；與TGF-β（10 μg∕L）組相比，洛伐他汀降低TGF-β（10 μg∕L）誘導的SKOV3細胞侵襲數。

2.4 洛伐他汀對TGF-β誘導SKOV3細胞EMT的影響與對照組相比，TGF-β（10 μg∕L）組提高SKOV3細胞中N-cadherin、Vimentin蛋白水平，降低E-cadherin蛋白水平，但洛伐他汀（10 μmol∕L）組降低SKOV3細胞中N-cadherin、Vimentin蛋白水平，升高E-cadherin蛋白水平；與TGF-β（10 μg∕L）組相比，洛伐他汀降低TGF-β（10 μg∕L）誘導的SKOV3細胞中N-cadherin、Vimentin蛋白水平的增加和E-cadherin蛋白水平的降低。見表3，圖1。

表3 洛伐他汀對TGF-β誘導SKOV3細胞EMT的影響

表3 洛伐他汀對TGF-β誘導SKOV3細胞EMT的影響

注：TGF-β為轉化生長因子-β，N-cadherin為神經鈣黏素，E-cadherin為上皮鈣黏素，Vimentin為波形蛋白。①與對照組相比，P＜0.05。②與TGF-β（10 μg∕L）組或洛伐他汀（10 μmol∕L）組相比，P＜0.05。

組別對照組TGF-β（10 μg∕L）組洛伐他汀（10 μmol∕L）組洛伐他汀+TGF-β組F值P值重復次數3 3 3 3 N-cadherin 1.000±0.078 2.017±0.186①0.341±0.032①1.325±0.112①②107.47＜0.001 E-cadherin 1.000±0.075 0.569±0.053①2.317±0.216①1.685±0.154①②89.99＜0.001 Vimentin 1.000±0.068 1.698±0.138①0.215±0.023①0.831±0.079①②146.60＜0.001

圖1 洛伐他汀對TGF-β誘導SKOV3細胞EMT的影響

2.5 洛 伐 他 汀 對TGF-β誘 導SKOV3細 胞p38MAPK信號通路的影響各組p38蛋白水平無明顯差異；與對照組相比，TGF-β（10 μg∕L）組提高SKOV3細胞中p-p38蛋白水平，但洛伐他汀（10 μmol∕L）組降低SKOV3細胞中p-p38蛋白水平；與TGF-β（10 μg∕L）組相比，洛伐他汀降低TGF-β（10 μg∕L）誘導的SKOV3細胞中p-p38蛋白水平的增加。見表4，圖2。

圖2 洛伐他汀對TGF-β誘導SKOV3細胞p38MAPK信號通路的影響

表4 洛伐他汀對TGF-β誘導SKOV3細胞p38MAPK信號通路的影響

表4 洛伐他汀對TGF-β誘導SKOV3細胞p38MAPK信號通路的影響

注：TGF-β為轉化生長因子-β，p38為p38絲裂原活化蛋白激酶，p-p38為磷酸化的p38絲裂原活化蛋白激酶。①與對照組相比，P＜0.05。②與TGF-β（10 μg∕L）組或洛伐他汀（10 μmol∕L）組相比，P＜0.05。

組別對照組TGF-β（10 μg∕L）組洛伐他汀（10 μmol∕L）組洛伐他汀+TGF-β組F值P值重復次數3 3 3 3 p38 1.000±0.076 1.023±0.095 1.014±0.103 0.997±0.098 0.05 0.983 p-p38 1.000±0.074 1.897±0.145①0.378±0.039①1.256±0.116①②114.01＜0.001

3 討論

卵巢癌嚴重威脅女性的生命健康，其發病機制是一個多因素參與的過程。臨床上主要采用手術和放化療結合，但由于大部分病人確診時已是晚期，無法采取手術治療，化療易產生耐藥性，導致病人預后較差［9-10］。其中腫瘤組織的遠端轉移以及化療耐藥性是目前制約臨床治療效果的主要原因之一。EMT是腫瘤細胞侵襲、遷移過程中的重要過程，去EMT化已成為腫瘤研究的重點和熱點。Ncadherin、Vimentin、E-cadherin是EMT過程中的關鍵調控因子［11-12］。E-cadherin是上皮細胞表型的標志物質，是EMT過程的關鍵限速因子；而N-cadherin、Vimentin是間質細胞表型的標志物質，E-cadherin表達量降低及N-cadherin、Vimentin表達量增加均可促進細胞侵襲、遷移。EMT過程受多種信號因子的調控，TGF-β是其中最重要的信號因子［13-14］。

洛伐他汀是一種常見他汀類藥物，可抑制羥甲基戊二酰單酰輔酶A還原酶轉變為甲基二羥戊酸，從而調節細胞的重要生物學功能。臨床試驗結果證實，洛伐他汀通過抑制鼻咽癌細胞凋亡、阻滯細胞周期，增強細胞的化療敏感性，為臨床治療鼻咽癌提供新的思路［15］；洛伐他汀通過上調或下調細胞增殖、凋亡、周期、EMT相關蛋白的表達量，從而抑制乳腺癌的發生發展［16］；洛伐他汀通過調控環氧合酶-2和過氧化物酶體增殖物活化受體γ誘導人肺癌細胞凋亡［17］。上述研究均表明，洛伐他汀可通過調控細胞的生物學特性抑制腫瘤的病理進展，但其在腫瘤轉移過程中的作用及機制尚不完全清楚。

在本研究中，10 μg∕L TGF-β作用于SKOV3細胞，提高細胞增殖活性，增強其侵襲、遷移能力，與前人的研究結果相似；不同濃度（0、5、10、20、40、60 μmol∕L）洛 伐 他 汀 對10 μg∕L TGF-β作 用 于SKOV3細胞增殖具有抑制作用，其中10 μmol∕L洛伐他汀在24 h即可明顯抑制細胞的增殖，因此后續選取10 μmol∕L洛伐他汀進行研究；10 μmol∕L洛伐他汀對10 μg∕L TGF-β作用于SKOV3細胞侵襲、遷移具有明顯的抑制作用，提高上皮細胞表型標志物E-cadherin蛋白水平，降低間質細胞表型標志物N-cadherin、Vimentin蛋白的表達量，表明洛伐他汀可抑制TGF-β誘導的卵巢癌細胞增殖、侵襲、遷移以及EMT過程。研究證實，TGF-β、洛伐他汀均可通過調控p38MAPK信號通路的活性發揮作用［18-19］。為進一步探究洛伐他汀的作用機制，本實驗檢測了p38MAPK信號通路關鍵蛋白因子p38總蛋白以及磷酸化p38蛋白水平，結果發現，洛伐他汀對TGF-β誘導的卵巢癌細胞中p38總蛋白水平無明顯影響，但可降低磷酸化p38蛋白水平，表明洛伐他汀可能通過抑制p38MAPK信號通路阻礙TGF-β誘導的卵巢癌細胞增殖、侵襲、遷移以及EMT過程。

綜上所述，洛伐他汀可逆轉TGF-β誘導的卵巢癌細胞增殖、侵襲、遷移以及EMT過程，可能通過抑制p38MAPK信號通路發揮作用，提示洛伐他汀有可能成為卵巢癌治療的潛在藥物。未來會進一步在多株細胞以及動物模型中進一步探究洛伐他汀的抗腫瘤作用，為腫瘤的臨床治療提供新的實驗基礎。