微小RNA-34a在紫草素抑制肺癌H1299細胞增殖和侵襲中的作用及其機制

韓林

紫草素是傳統中藥紫草的主要活性成分之一，除了具有抗炎、抗菌和促進傷口愈合等藥理活性外，還在結腸癌、食管癌和肺癌等腫瘤中表現出較好的抗腫瘤活性［1-3］。微小RNAs（miRNAs）是一類與腫瘤發生發展關系密切的非編碼RNA，可通過與靶基因mRNA的3'非編碼區（3'UTR）結合在轉錄后水平促進靶基因mRNA降解或抑制其翻譯，影響腫瘤細胞增殖、侵襲和凋亡等細胞功能［4］。越來越多的研究顯示，miRNAs如miR-106b和miR-143等在紫草素抗腫瘤過程中發揮著重要作用［5-6］。miR-34a是miR-34家族成員，位于11q23染色體上，被證實在肺癌組織中異常低表達，而上調其表達具有抑制癌細胞增殖和侵襲的作用［7］。近年來，有報道指出，miR-34a表達上調是紫草素抑制視網膜母細胞瘤增殖的重要機制，但miR-34a是否參與紫草素抗肺癌增殖和侵襲的過程尚不清楚［8］。因此，本研究于2019年9月至2020年3月，通過開展體外細胞實驗，觀察miR-34a在紫草素抑制肺癌H1299細胞增殖和侵襲中的作用，并探討其可能的分子機制，以期在臨床上為紫草素治療肺癌提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑RPMI1640培養液購于美國Gibco公司；Yin Yang-1（YY1）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗，辣根過氧化酶標記的二抗均購于美國Abcam公司；pcDNA 3.1-YY1-GFP過表達質粒及其對照pcDNA3.1-GFP空載體質粒購于百奧邁科生物技術有限公司；脂質體2000轉染試劑和Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購于北京天根生化公司；二辛可寧酸（BCA）蛋白定量試劑盒購于美國Thermo公司；紫草素、胰蛋白酶和噻唑藍（MTT）試劑購于美國Sigma公司；Matrigel膠購于美國BD公司；miR-34a模擬物、miR-34a抑制劑及其相應對照購于上海吉瑪生物公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司。

1.1.2 主要儀器細胞培養箱購于美國Thermo Forma公司，凝膠成像分析系統、轉染系統和酶標儀購于美國Bio-Rad公司，倒置顯微鏡購于日本Nikon公司，Transwell小室購于美國Corning公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和紫草素處理將來自中科院上海細胞庫的H1299細胞解凍復蘇后，接種至含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養液中置于細胞培養箱中常規培養。待細胞融合度達80%左右時按1∶3比例進行傳代。將細胞分為對照組（0 μmol∕L），1 μmol∕L、2.5 μmol∕L和5 μmol∕L的紫草素處理組，分別加入終濃度為0、1、2.5和5 μmol∕L紫草素處理。

1.2.2 MTT法檢測細胞存活率將各組H1299細胞按照104個∕孔種植于96孔細胞板上，常規培養48 h，另以不含細胞的培養液作為空白組。待紫草素作用48 h后，棄培養液，加入20 μL 5 g∕L的MTT溶液繼續培養4 h。棄去MTT液后，每孔加入150 μL二甲基亞楓孵育20 min，采用酶標儀在570 nm處檢測吸光度值并計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（藥物組吸光度值-空白組吸光度值）∕（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。

1.2.3 平板克隆實驗檢測細胞克隆形成能力各組H1299細胞經紫草素處理48 h后制成單細胞懸液。將細胞以800個∕孔接種至6孔板，于細胞培養箱內常規培養10～12 d，待有肉眼可見集落形成時終止培養。棄上清，加入4%多聚甲醛固定15 min，應用結晶紫染液染色20 min。洗去染液，通過倒置顯微鏡觀察并計數各組大于15個細胞的集落形成數量。

1.2.4 Transwell小室檢測細胞侵襲能力將Matrigel基質膠與無血清培養液按照1∶4比例混合后，取混合液25 μL平鋪于Transwell小室上室，并置于37℃培養箱中至充分融合。將不同濃度的紫草素處理48 h的H1299細胞制成濃度濃度為105個∕毫升，在Transwell小室上室中加入200 μL細胞懸液，小室下室中加入500 μL含10%FBS的RPMI1640細胞培養液，置于細胞培養箱內培養24 h。取出小室，棄上室內培養液后，使用棉簽拭去小室膜表面細胞，加入4%多聚甲醛固定15 min后，加入結晶紫染液染色20 min。于倒置顯微鏡下每組隨機選取5個視野觀察穿膜細胞數，取平均值。

1.2.5 RT-PCR檢測miR-34a表達水平收集紫草素處理48 h后的各組細胞，加胰酶消化后加入Trizol試劑提取細胞總RNA。將RNA逆轉錄互補DNA（cDNA），以cDNA為模板，根據上海生工生物合成的PCR引物按照94℃、5 min預變性；94℃、30 s變性，60℃、30 s退火，72℃、30 s延伸，共循環38次的反應條件以U6為內參進行PCR擴增。miR-34a正向引物序列為5'-GTGCAGTGGCAGTGTCTTAGC-3'，反向引物序列為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6正向引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，反向引物序列為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'。采用2-ΔΔCt法檢測各組細胞中miR-34a的表達水平。

1.2.6 細胞轉染將對數生長期H1299細胞按照105個∕孔的密度接種于6孔板，常規條件下孵育過夜。通過脂質體2000轉染試劑盒將miR-34a抑制劑及其陰性對照或者pcDNA 3.1-YY1-GFP過表達質粒及pcDNA 3.1-GFP空載體質粒分別轉至H1299細胞中，轉染48 h后給予濃度為5 μmol∕L紫草素處理48 h，并分別標記為紫草素+anti-miR-34a組和紫草素+anitmiR-NC組或紫草素+pcDNA 3.1-YY1組和紫草素+pcDNA3.1組。另以正常培養的H1299細胞作為正常組，以不做轉染只給予5 μmol∕L紫草素處理的H1299細胞作為紫草素組。待處理結束后，收集各組細胞，分別采用MTT法、平板克隆實驗、Transwell小室實驗檢測各組細胞的存活率、克隆形成和侵襲能力。

1.2.7 蛋白質印跡法檢測YY1蛋白表達收集紫草素處理48 h的各組H1299細胞提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白的濃度。將蛋白樣品與5×十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液以4∶1比例混合均勻，沸水浴變性。按照每孔60 μg將蛋白樣品電泳分離后，采用濕轉法將蛋白樣品轉至PVDF膜上。經含5%脫脂奶粉的封閉液封膜處理1.5 h后，加入YY1抗體和GAPDH抗體（稀釋比1∶1 000）4℃下孵育24 h。次日加入二抗（稀釋比1∶2 000）工作液室溫孵育1 h后，滴加化學發光劑顯影。以GAPDH為管家基因，采用凝膠成像系統分析YY1蛋白的表達水平。

1.2.8 雙螢光素酶報告基因實驗驗證miR-34a與YY1靶向關系運用生物信息學軟件TargetScan（https：∕∕www.targetscan.org）、miRBase（https：∕∕microrna.sanger.ac.uk）和MiRanda（https：∕∕www.microrna.org）對miR-34a潛在靶基因進行預測，最終將YY1作為研究對象。將YY1 3’UTR片段克隆并重組于psiCHECK2質粒上，構建psiCHECK2-YY1野生型（YY1-WT）報告基因質粒；同時，利用Takara點突變 試 劑 盒 將YY1 3’UTR與miR-34a結 合 位 點“ACUGCCA”進行突變為“UGACGGU”后，克隆到psiCHECK2質 粒 上，構建psiCHECK2-YY1野生 型（YY1-MUT）報告基因質粒。將質粒分別與miR-34a模擬物、miR-34a抑制劑及其陰性對照參照脂質體2000說明書步驟共轉染至H1299細胞中，48 h后根據雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測各組細胞螢光素酶活性。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0進行統計學分析。實驗數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紫草素以濃度依賴性抑制肺癌H1299細胞增殖和侵襲以1、2.5和5 μmol∕L紫草素處理后發現，肺癌H1299細胞存活率、克隆細胞數和侵襲細胞數呈濃度依賴性降低，且與對照（0 μmol∕L）組比較，均差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1，表1。

表1 不同濃度紫草素對H1299細胞增殖、侵襲的影響

表1 不同濃度紫草素對H1299細胞增殖、侵襲的影響

注：①與0 μmol∕L比較，P＜0.05。②與1 μmol∕L比較，P＜0.05。③與2.5 μmol∕L比較，P＜0.05。

濃度0 μmol∕L 1 μmol∕L 2.5 μmol∕L 5 μmol∕L F值P值重復次數3 3 3 3細胞存活率∕%100 82.15±5.02①71.64±4.28①②58.37±2.53①②③33.93＜0.001克隆細胞數156.55±9.06 127.63±7.38①108.85±6.34①②91.72±6.15①②③43.11＜0.001侵襲細胞數116.00±7.85 93.12±5.56①75.25±4.68①②59.85±3.20①②③56.15＜0.001

2.2 紫草素以濃度依賴性上調肺癌H1299細胞中miR-34a表達0、1、2.5和5 μmol∕L紫草素處理后H1299細胞中miR-34a的表達水平分別為1.03±0.08、1.65±0.12、1.65±0.12、5.12±0.50，組間比較差異有 統計學 意義（F=99.27，P＜0.001）。與對照（0 μmol∕L）組比較，1、2.5和5 μmol∕L紫草素處理后H1299細胞中miR-34a的表達水平明顯升高（P＜0.05），且呈濃度依賴性。

2.3 miR-34a與YY1靶向關系驗證生物信息學軟件預測顯示，YY1與miR-34a之間存在互補結合位點，見表2。同時，miR-34a與YY1 3'UTR野生型質粒（YY1-WT）共轉染后細胞的螢光素酶活性較對照miR-NC明顯降低（P＜0.05），而anti-miR-34a與YY1-WT共轉染后細胞的螢光素酶活性較對照antimiR-NC明顯升高（P＜0.05）。但是，miR-34a或者anti-miR-34a與YY1 3'UTR突變型質粒（YY1-MUT）共轉染后細胞的螢光素酶活性與相應對照比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表2 YY1 3'UTR與miR-34a的結合位點

表3 各組細胞螢光素酶活性的對比

表3 各組細胞螢光素酶活性的對比

注：YY1-WT為psiCHECK2-YY1野生型報告基因質粒，YY1-MUT為psiCHECK2-YY1突變型報告基因質粒。①與miR-NC組比較，P＜0.05。②與anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

組別miR-NC miR-34a anti-miR-NC anti-miR-34a F值P值重復次數3 3 3 3螢光素酶活性YY1-WT 0.96±0.05 0.32±0.03①1.01±0.07 3.56±0.21②470.39＜0.001 YY1-MUT 1.02±0.07 0.97±0.06 0.96±0.06 1.00±0.08 0.49 0.698

2.4 下調miR-34a逆轉紫草素對肺癌H1299細胞增殖、侵襲的抑制作用并促進YY1蛋白表達與正常組比較，紫草素處理后H1299細胞中miR-34a的表達水平明顯升高，而YY1蛋白的表達水平、細胞存活率、克隆細胞數和侵襲細胞數均明顯降低（P＜0.05）；與紫草素組比較，轉染anti-miR-34a后紫草素對H1299細胞的上述作用得到部分逆轉（P＜0.05）；而轉染anti-miR-NC后紫草素對H1299細胞的上述作用未有顯著改變（P＞0.05）。見圖2，表4。

表4 下調miR-34a對肺癌H1299細胞中Yin Yang-1（YY1）蛋白表達及細胞增殖、侵襲的影響

表4 下調miR-34a對肺癌H1299細胞中Yin Yang-1（YY1）蛋白表達及細胞增殖、侵襲的影響

注：①與正常組比較，P＜0.05。②與紫草素組比較，P＜0.05。

組別正常組紫草素組紫草素+anti-miR-NC組紫草素+anti-miR-34a組F值P值重復次數3 3 3 3 miR-34a 1.00±0.06 4.68±0.35①4.56±0.37①1.25±0.13①②175.11＜0.001 YY1蛋白1.32±0.13 0.35±0.03①0.38±0.03①0.76±0.05①②115.64＜0.001細胞存活率∕%100 60.15±3.23①61.08±3.35①82.42±5.21①②41.43＜0.001克隆細胞數161.35±11.26 82.48±5.35①80.72±5.28①126.51±9.36①②66.35＜0.001侵襲細胞數123.48±8.21 57.82±3.52①55.65±3.17①90.35±4.05①②115.55＜0.001

圖2 下調miR-34a對紫草素處理的肺癌H1299細胞中YY1蛋白表達的影響

2.5 上調YY1表達逆轉紫草素對肺癌H1299細胞增殖和侵襲的抑制作用與正常組比較，紫草素處理后H1299細胞中YY1蛋白的表達水平、細胞存活率、克隆細胞數和侵襲細胞數均明顯降低（P＜0.05）；與紫草素組比較，轉染YY1-pcDNA3.1過表達質粒后紫草素對H1299細胞的上述作用明顯減弱（P＜0.05）；而轉染pcDNA3.1空載體質粒后顯著未影響紫草素對H1299細胞的上述作用（P＞0.05）。見圖3，表5。

表5 上調Yin Yang-1（YY1）表達對肺癌H1299細胞增殖和侵襲的影響

表5 上調Yin Yang-1（YY1）表達對肺癌H1299細胞增殖和侵襲的影響

注：①與正常組比較，P＜0.05。②與紫草素組比較，P＜0.05。

組別正常組紫草素組紫草素+pcDNA3.1組紫草素+pcDNA3.1-YY1組F值P值重復次數3 3 3 3 YY1蛋白1.41±0.22 0.32±0.03①0.36±0.03①0.88±0.06①②58.68＜0.001細胞存活率∕%100 62.38±3.16①64.15±3.32①79.46±5.85①②31.40＜0.001克隆細胞數158.46±10.35 81.72±6.18①83.05±5.96①118.54±8.05①②64.27＜0.001侵襲細胞數118.85±7.62 56.46±3.28①58.23±3.36①85.26±5.02①②97.41＜0.001

圖3 上調YYI對紫草素處理的肺癌H1299細胞中YY1蛋白表達的影響

3 討論

肺癌是最常見的肺原發性惡性腫瘤，也是導致人類癌癥相關死亡的首因。目前手術切除和化療是肺癌的主要治療手段，但治療效果并不理想。隨著中藥抗腫瘤熱度的增加，越來越多的抗腫瘤藥物被發現。紫草素是一種從中草藥紫草中提取的萘醌類化合物，主要用于靜脈炎、肝炎、燒傷和血管性紫癜等疾病的治療［9］，此外，紫草素還在多種腫瘤中表現出較好的抗腫瘤作用。Guo等［10］報道，紫草素可通過CD147抑制膠質瘤細胞的增殖并誘導其凋亡，被認為是一種很有前途的腫瘤治療藥物。Zhang等［11］研究證實，紫草素可通過下調DNMT1表達抑制甲狀腺癌TPC-1細胞侵襲和遷移。Shilnikova等［12］研究指出，紫草素可通過誘導耐藥的人卵巢癌A2780-CR細胞線粒體介導的凋亡和減弱上皮間充質轉化增強順鉑的抗腫瘤作用。本研究1、2.5和5 μmol∕L紫草素處理后發現，紫草素可呈濃度依賴性抑制肺癌H1299細胞增殖和侵襲。該結果與王媛等［13］得到的紫草素抑制肺腺癌H1975細胞增殖以及Hsieh等［14］得到的紫草素可抑制肺癌HCC827細胞侵襲的結果相吻合。

此外，本研究還發現紫草素可呈劑量依賴性上調miR-34a的表達。這提示，miR-34a可能在紫草素抗肺癌H1299細胞增殖和侵襲過程中發揮著重要作用。miR-34a屬于miR-34a家族，最早是在秀麗隱桿線蟲中被發現的；其上游區域中含有能夠與抑癌因子p53結合的位點，受p53的直接調控［15］。多個研究顯示，miR-34a異常低表達于肝癌、乳腺癌和前列腺癌等多種惡性腫瘤，可抑制腫瘤細胞增殖和侵襲［16-18］。Wang等［7］研究得出miR-34a具有抑制肺癌細胞增殖和侵襲的作用。本研究通過轉染miR-34a抑制劑成功下調miR-34a表達后發現，miR-34a低表達可通過促進肺癌H1299細胞增殖和侵襲，逆轉紫草素抗H1299細胞增殖和侵襲的作用。結果提示，紫草素可通過上調miR-34a表達抑制肺癌H1299細胞增殖和侵襲。

為了進一步探討miR-34a參與紫草素抗肺癌細胞增殖和侵襲的分子機制，本研究運用生物信息學軟件對miR-34a的潛在靶基因進行預測發現在YY1與miR-34a之間存在互補的結合位點，最終選用YY1作為研究對象。YY1是鋅指類轉錄因子GLl-Kruppel家族成員，定位于人類14號染色體端粒區，可通過調控不同的蛋白輔助因子影響腫瘤相關基因表達，參與腫瘤的發生、發展［19］。雙螢光素酶報告基因實驗證實，miR-34a可靶向結合YY1降低細胞的螢光素酶活性；同時，下調miR-34a表達可促進YY1蛋白的表達。這一系列結果顯示，YY1是miR-34a的靶基因。Huang等［20］研究證實，YY1異常高表達于肺癌組織和細胞中，通過促進腫瘤細胞的增殖和侵襲過程參與腫瘤的發生、發展。本研究通過轉染pcDNA3.1-YY1-GFP過表達質粒成功上調YY1表達后發現，紫草素對肺癌H1299細胞增殖和侵襲的抑制作用明顯減弱。結果提示，紫草素可能通過介導miR-34a靶向調控YY1抑制肺癌H1299細胞增殖和侵襲。

綜上所述，miR-34a在紫草素抑制肺癌H1299細胞增殖和侵襲過程中發揮著積極作用，其作用機制可能與靶向調控YY1表達有關。

（本文圖1見插圖1-4）

圖1 紫草素對H1299細胞克隆形成和侵襲的影響:A為平板克隆實驗結果；B為Transwell實驗結果（結晶紫染色×200）