微小RNA-K1-5p調控G1/S期相關基因的表達影響內皮細胞周期

張靜，彭靖淇

卡波西肉瘤（Kaposi's sarcoma，KS）是由KS相 關皰疹病毒（KSHV）感染內皮細胞發生的梭形細胞腫瘤［1］。多見于人類免疫缺陷病毒相關的免疫缺陷綜合征（HIV-AIDS）或免疫缺陷病人［2-4］。近年來，miRNA在醫學領域引起關注［5-8］，通過與mRNA的3'-非翻譯區（3'UTR）結合，降解或沉默靶基因的表達［9-12］，并通過復雜機制在各種細胞過程中發揮重要作用［13-17］。之前的研究顯示KSHV編碼的13個miRNA，在KS中都顯著上調，其中與細胞周期密切相關的miR-K1-5p上調最為明顯［18-19］。G1∕S關卡是細胞周期最重要的檢查點，細胞周期素依賴性激酶抑制劑4（CDKN4）、細胞周期蛋白A∕細胞周期素依賴性激酶2（Cyclin A∕CDK2）、細胞周期蛋白D2∕細胞周期素依賴性激酶4（Cyclin D2∕CDK4）均是G1∕S期調控的主要基因。自從KS細胞株（SLK）被證實為腎癌細胞來源后，便缺乏了可信賴的細胞株［20］，但是對于KSHV致瘤作用的研究，目前公認的模型是將KSHV的基因組或miRNA轉染人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）后進行基因表型檢測［21-24］。本研究將miR-K1-5p轉 染HUVECs，探 討miR-K1-5p對CDKN4、Cyclin A∕CDK2和Cyclin D2∕CDK4的調控作用及其對內皮細胞周期的影響。本研究進行于2020年1—12月。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑人臍靜脈內皮細胞（HUVECs，美國ScienCell生物公司）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）；293T細胞（上海玉博生物科技有限公司）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；miR-K1-5p模擬物（mimics）、mimics陰性對照∕NC（武漢艾斯萊德生物科技有限公司）；雙螢光素酶報告系統（上海碧云天生物技術有限公司）；Trizol（美國Ambion公司）；miScriptSYBR Green PCR Kit試劑盒（美國VAZYME公司）；細胞周期分析試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）；CDKN4、Cyclin A∕CDK2和Cyclin D2∕CDK4（美國BOSTER公司）；GAPDH（杭州賢至生物有限公司）。

1.2 細胞培養與轉染使用密度為80%，對數生長期的HUVECs（此細胞株廣泛用于KS的研究［21-24］），以每孔1×105個細胞接種于6孔培養板中，培養24 h。設立兩組：miR-K1-5p mimics組和mimics NC組，使用Lipofectamine 2000將它們分別轉染到HUVECs中，轉染時間為48 h。

1.3 miR-K1-5p靶基因預測使用TargetScanHuman Custom 5.2和miRDB的生物信息學軟件預測miR-K1-5p的靶基因及靶基因3'UTR中的結合位點。

1.4 雙螢光素酶試驗將野生型（WT）和突變型（MUT）CDKN4 3'UTR構建到雙螢光素酶報告載體（pYr-miRTarget）質粒上，將質粒（1 μg）和miR-K1-5p mimics、mimics NC（50 nmol∕L）共轉染到293T細胞5×104，Lipofectamine 2000轉染24 h后，使用雙螢光素酶報告系統分析。

1.5 蛋白質印跡法檢測轉染48 h后，使用RIPA裂解液從細胞中提取總蛋白。根據蛋白質含量繪制標準曲線。制備5%層濃縮膠和12%分離凝膠。進行電泳，結束后將蛋白質轉移到膜上，用5%脫脂奶粉封閉膜2 h，一抗CDKN4、Cyclin D2、CDK2、CDK4均稀釋（1∶1 000）、Cyclin A稀釋（1∶500）、GAPDH稀釋（1∶1 000）在4℃下孵育過夜，HRP二抗稀釋（1∶10 000）在37℃下孵育2 h；而后增強化學發光成像；灰度值分析。

1.6 q-PCR檢測轉染48 h后，從細胞中提取總RNA（需1mL Trizol）。使 用miScriptSYBR Green PCR Kit試劑盒定量mRNA和miRNA表達水平。PCR反應條件為：在95℃下預變性10 min，在95℃下15 s，在60℃下60 s進行40個周期。采用2-ΔΔCt相對定量法進行數據分析。其中U6為miRNA內參引物；GADPH為mRNA內參引物，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 細胞周期分析miR-K1-5p mimics、mimics NC分別轉染HUVECs細胞中，48 h后收獲1×105細胞，用200 μL細胞液離心5 min，用PBS洗滌細胞2次，使用細胞周期分析試劑盒檢測：向細胞中添加RNase A溶液（20 μL），使用PI染料溶液（400 μL），最后使用流式細胞儀進行分析。

1.8 統計學方法SPSS 20.0軟件用于統計分析，數據經過正態性檢驗及方差齊性檢驗。正態分布的計量數據以±s表示。t檢驗用于單變量兩組資料之間的比較。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-K1-5p的表達水平miR-K1-5p mimics和mimics NC轉染HUVECs細胞。48 h后，q-PCR結果顯示miR-K1-5p mimics組表達水平0.91±0.08明顯高于mimics NC組表達水平0.00±0.00（t=19.54，P＜0.001），40個循環未檢測出∕低于檢測下限。

2.2 miR-K1-5p靶基因的預測靶基因的預測結果：TargetScan Human Custom顯示有637個靶基因，miRDB顯示有1 102個靶基因，取交集顯示有354個靶基因。miR-K1-5p靶基因的功能主要富集在細胞周期、調節轉錄、表達調控等。其中靶基因CDKN4與細胞周期的調控密切相關。圖1示CDKN4 3'UTR與miR-K1-5p的結合位點。

圖1 CDKN4 3'UTR與miR-K1-5p的結合位點

2.3 miR-K1-5p靶向CDKN4基因將miR-K1-5p mimics+CDKN4-WT、mimics NC+CDKN4-WT、miRK1-5p mimics+CDKN4-MUT和mimics NC+CDKN4-MUT分別轉染293T細胞。24 h后測定各組螢光素酶活性，miR-K1-5p mimics+CDKN4-WT組明顯低于其余組的螢光素酶活性（P＜0.01）；轉染miR-K1-5p mimics后，CDKN4蛋 白∕mRNA表 達 水 平 均 低 于mimics NC組（P＜0.01）。因此，CDKN4是miR-K1-5p直接作用的靶基因。miR-K1-5p可以負性調控CDKN4的表達。見表2。

表2 相對螢光素酶活性、CDKN4蛋白及mRNA相對表達比較±s

表2 相對螢光素酶活性、CDKN4蛋白及mRNA相對表達比較±s

注：miR-K1-5p mimics為miR-K1-5p模擬物，mimics NC為模擬物陰性對照，CDKN4-WT為細胞周期素依賴性激酶抑制劑4野生型螢光素酶載體，CDKN4-MUT為細胞周期素依賴性激酶抑制劑4突變型螢光素酶載體。①與mimics NC組相比，P＜0.01。

組別mimics NC miR-K1-5p mimics t值P值重復次數3 3 CDKN4-WT 0.81±0.04 0.42±0.05①17.73＜0.001 CDKN4-MUT 0.80±0.05 0.82±0.03 0.93 0.364 CDKN4蛋白0.28±0.02 0.11±0.01①12.91＜0.001 CDKN4 mRNA 1.00±0.01 0.33±0.02①47.90＜0.001

2.4 轉染后Cyclin A/CDK2蛋白及mRNA的相對表達量轉染48 h后結果顯示：與mimics NC組相比，miR-K1-5p過表達顯著增加Cyclin A∕CDK2蛋白和mRNA的表達水平（P＜0.01）。因此，miR-K1-5p可以正性調控Cyclin A∕CDK2的表達。見表3。

實驗二的詞匯測試結束后，要求兩組學生如實填寫查閱了哪些單詞，用以確定各組查閱目標詞的人次，結果表明，兩組學生不同程度地查閱了目標詞的用法。統計結果如下：

表3 Cyclin A/CDK2蛋白及mRNA相對表達量比較

表3 Cyclin A/CDK2蛋白及mRNA相對表達量比較

注：mimics為模擬物，mimics NC為模擬物陰性對照，Cyclin A為細胞周期蛋白A，CDK2為細胞周期素依賴性激酶2。①與mimics NC組，P＜0.01。

組別mimics NC mimics t值P值重復次數3 3 Cyclin A蛋白0.05±0.01 0.13±0.01①10.61＜0.001 CDK2蛋白0.21±0.02 0.65±0.04①16.50＜0.001 Cyclin A mRNA 0.99±0.08 2.94±0.13①22.66＜0.001 CDK2 mRNA 1.02±0.09 1.96±0.3①5.02 0.007

2.5 轉染后Cyclin D2/CKD4蛋白及mRNA的相對表達量轉染48 h后，行蛋白質印跡法和q-PCR檢測Cyclin D2∕CDK4蛋白和mRNA的表達水平。結果顯示，與mimics NC相比，miR-K1-5p mimics顯著增加了Cyclin D2∕CDK4蛋白和mRNA表達水平（P＜0.05）。因此，miR-K1-5p可以正性調控Cyclin D2∕CDK4的表達。見表4。

表4 Cyclin D2/CDK4蛋白及mRNA相對表達量比較

表4 Cyclin D2/CDK4蛋白及mRNA相對表達量比較

注：mimics為模擬物，mimics NC為模擬物陰性對照，Cyclin D2為細胞周期蛋白D2，CDK4為細胞周期素依賴性激酶4。①與mimics NC組，P＜0.01。

組別mimics NC mimics t值P值重復次數3 3 Cyclin D2蛋白0.28±0.03 0.56±0.03①10.68＜0.001 CDK4蛋白0.19±0.04 0.43±0.05①7.03 0.002 Cyclin D2 mRNA 1.03±0.06 1.67±0.30①3.92 0.017 CDK4 mRNA 1.00±0.07 1.64±0.24①4.39 0.012

2.6 CDKN4、Cyclin A、Cyclin D2、CDK、CDK4的western blotting電泳圖蛋白質印跡法檢測結果示：mimics組CDKN4的蛋白表達水平低于mimics NC組；mimics組Cyclin A、Cyclin D2、CDK、CDK4的蛋白表達水平高于mimics NC組。見圖2。

圖2 CDKN4∕Cyclin A∕CDK2∕Cyclin D2∕CDK4蛋白質印跡電泳圖

2.7 miR-K1-5p對細胞周期的影響轉染后顯示mimics組的PI值（PI=S+G2期∕G1+S+G2期；PI為增殖活性指數，PI值越大，細胞周期變短、增殖變快）及S期、G2期比值均高于mimics NC組（P＜0.05）；mimics組的G1期比值低于mimics NC組（P＜0.01），見表5；細胞周期流式圖見圖3，因此，miR-K1-5p可以使細胞周期進展加速，促進細胞增殖和G1∕S期轉換。

表5 轉染后對HUVECs細胞周期影響比較/（%

表5 轉染后對HUVECs細胞周期影響比較/（%

注：HUVECs為人臍靜脈內皮細胞，mimics為模擬物，mimics NC為模擬物陰性對照。

組別mimics mimics NC 3 t值p值重復次數3 S+G2期∕G1+S+G2期23.37±0.29 15.00±0.75 18.03＜0.001 G1期76.63±0.28 85.00±0.76 17.96＜0.001 S期15.34±0.36 8.45±0.20 28.86＜0.001 G2期8.02±0.17 6.55±0.80 3.11 0.04

圖3 轉染后人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）細胞周期流式圖：A為mimics NC組；B為mimics組

3 討論

KS是一種起源于內皮細胞的血管肉瘤［25］。KSHV是7種可導致人類惡性腫瘤的病毒之一，是KS的重要致病因子［2-3］。KSHV主要通過編碼miRNA對KS產生影響，KSHV miRNAs可以調節宿主細胞的分化，影響其細胞周期，最終誘導癌變發生［26-28］。研究miRNAs在KS和癌旁組織中的差異表達，結果顯示69個miRNAs的表達上調；101個miRNA表達下調，特別是KSHV編碼的miR-K1-5p表達上調最為顯著［18］。因此高表達的miR-K1-5p可能在KS中發揮重要作用。GO和KEGG信號通路分析表明：miR-K1-5p主要參與細胞周期信號通路，通過它的靶基因介導信號通路發揮作用。CDKN4（miRK1-5p的靶基因）、Cyclin A∕CDK2、Cyclin D2∕CDK4是該通路中G1∕S期的關鍵基因，G1∕S關卡是細胞周期中最主要的調控點，因此研究miR-K1-5p對CDKN4、Cyclin A∕CDK2、Cyclin D2∕CDK4的調控作用具有重要意義。

細胞周期依賴于精準調控。調控體系中細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子CKI、細胞周期蛋白依賴性激酶CDK、細胞周期蛋白Cyclin均發揮重要作用；CDK結合Cyclin使細胞不斷增殖、分裂；而CKI與Cyclin競爭結合CDK或優先結合Cyclin∕CDK復合物，發揮抑制作用。它們共同參與細胞周期的正常循環。當CKI丟失、Cyclin∕CDK表達異常、檢測點發生變化，可能導致細胞周期紊亂，細胞增殖失控，腫瘤形成。CDKN4作為一種CKI因子，抑制G1期進程，負性調控Cyclin∕CDK，避免DNA錯誤復制。其表達減少促進瘤細胞G1∕S期轉化，使大量瘤細胞進入S期，加速瘤細胞的惡性轉化。Cyclin A在G1晚期表達，近年來，在許多人類腫瘤中發現Cyclin A過表達，抑制其表達，可使腫瘤細胞周期運轉受阻，引起腫瘤細胞死亡，具有靶向治療的良好前景。Cyclin D2既往研究較少，它由CCND2基因編碼，由5個外顯子及4個內含子構成，G1早期表達，能促進細胞增殖，在結腸癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤中可見Cyclin D2的異常表達［29］。CDK自身不與底物反應，形成CDK∕Cyclin復合物時才能表現出活性，參與細胞周期的調控，不同細胞周期時相產生不同的Cyclin∕CDK復合物，促進時相之間的轉換，CDK2和CDK4是G1-S轉換的主要限速因子，形成CyclinA∕CDK2和Cyclin D2∕CDK4復合物促進G1-S轉換。

本研究通過雙螢光素酶試驗證實CDKN4是miR-K1-5p的靶基因；miR-K1-5p對CDKN4、Cyclin A∕CDK2、Cyclin D2∕CDK4具 有 明 顯 的 調 控 作 用。miR-K1-5p mimics轉染HUVECs細胞后，CDKN4蛋白和mRNA表達水平均顯著下調；Cyclin A∕CDK2、Cyclin D2∕CDK4蛋 白 及其mRNA表 達 水 平顯 著 上調。推測miR-K1-5p作為一種KSHV miRNA，在轉錄后通過抑制靶基因CDKN4的表達。發揮其調控細胞周期的功能。CDKN4作為G1∕S期重要監控因子，扮演交通紅燈的作用，miR-K1-5p減少CDKN4表達，使其原始功能喪失，解除或減弱了對Cyclin A∕CDK2和Cyclin D2∕CDK4的抑制，細胞增殖失控，細胞周期信號通路異常激活，從而導致腫瘤的發生。此外，本研究采用PI法研究miR-K1-5p對HUVECs細胞周期的影響。如數據所示，miR-K1-5p過表達后，G1期時長減短，S期和G2期細胞數量顯著增加。因此，miR-K1-5p促進了G1∕S期轉變，抑制HUVECs細胞凋亡，促進HUVECs細胞增殖。

綜上，研究證實了上調miR-K1-5p的表達，減少了CDKN4表達，增加了Cyclin A和Cyclin D2的表達，提高了CDK2和CDK4的活性，使腫瘤細胞無限增殖；反之即可抑制腫瘤性的增殖。鑒于miR-K1-5p作為促癌基因對細胞周期具有顯著的調控作用，它很可能成為KS的一個新的治療靶點。