基于GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫篩選惡性胸膜間皮瘤免疫治療療效預(yù)測關(guān)鍵基因

張明光，齊曉光，徐海軍

惡性胸膜間皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）是惡性程度較高的惡性腫瘤之一，多數(shù)情況下確診時(shí)已是晚期［1］，其主要的手段是內(nèi)科姑息性化療，目前一線化療的中位生存期約為12個(gè)月，尚無標(biāo)準(zhǔn)的二線治療方案［2］。探索新的治療策略是MPM研究的熱點(diǎn)問題之一。

最近研究顯示，針對程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（recombinant cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4）通路的免疫檢查點(diǎn)抑制劑在MPM中顯示出較好的抗腫瘤活性［3-6］，但是這種顯著的免疫治療反應(yīng)僅表現(xiàn)在少數(shù)MPM患者中，而從整體的MPM免疫治療效果來看，總體的免疫治療反應(yīng)還是偏低一些［7］，如何更好地實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)化的免疫治療，需要進(jìn)一步探索并闡明MPM中促使免疫治療反應(yīng)的機(jī)制。2018年7月至2020年7月，本研究基于此出發(fā)點(diǎn)，探索MPM中，免疫治療反應(yīng)組與免疫治療無反應(yīng)組之間表達(dá)譜的差異及其參與的生物學(xué)機(jī)制的不同，闡明免疫治療中起關(guān)鍵作用的分子及其相關(guān)調(diào)控通路，而這對于更好地實(shí)現(xiàn)MPM的精準(zhǔn)的免疫治療具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)獲取及處理檢索GEO數(shù)據(jù)庫，檢索關(guān)鍵詞“惡性胸膜間皮瘤”“免疫治療”“PD-1單抗”等，篩選其中以高通量測序?yàn)榧夹g(shù)平臺研究，只有GSE117358納入研究，該研究中共24個(gè)惡性間皮瘤標(biāo)本，標(biāo)本品系為BALB∕c小鼠，鼠齡范圍8～9周，性別均為雌性，治療藥物：抗程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）單抗及抗CTAL-4單抗；具體處理方案：小鼠皮下移植瘤第7天或第10天，當(dāng)腫瘤約9 mm2時(shí)，腹膜內(nèi)接受100 μg抗CTLA4和100 μg抗PD-L1的劑量，并加100 μL磷酸緩沖鹽溶液。第2天和第4天，小鼠接受額外劑量的100 μg抗PD-L1；按照是否對PD-L1聯(lián)合CTAL-4單抗是否有效分為兩組，免疫治療反應(yīng)組和免疫治療無反應(yīng)組，其中每組各12個(gè)樣本。

療效評估判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)小鼠的腫瘤完全消退并且在治療后至少4周保持無腫瘤時(shí)，將其指定為應(yīng)答者。如果治療開始后4周內(nèi)增長到100 mm2，則被指定為無反應(yīng)者。腫瘤生長延遲或部分消退的小鼠被指定為中間反應(yīng)者，并從分析中排除。

1.2 差異基因的篩選首先，從高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù) 庫（gene expression omnibus，GEO）官 網(wǎng) 下 載GSE117358的RNA表達(dá)譜矩陣，按照免疫治療有無反應(yīng)進(jìn)行分組：免疫治療反應(yīng)組（12個(gè)樣本）和免疫治療無反應(yīng)組（12個(gè)樣本），兩組患者共有39 637個(gè)基因，整理分組之后的表達(dá)譜矩陣以備研究；其次，應(yīng)用R語言中DEseq2和limma軟件包進(jìn)行基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)化及顯著性差異分析，設(shè)置差異基因的篩選條件為：差異倍數(shù)的絕對值＞1.5，且P＜0.01認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；最后應(yīng)用R語言中g(shù)gplot2軟件包進(jìn)行繪制火山圖展示差異表達(dá)基因情況。

1.3 差異基因GO功能注釋及KEGG富集通路分析所有差異基因納入分析，采用基因功能在線注釋分析David工具進(jìn)行下一步研究，包括基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集信號通路分析。該部分的分析目的在于進(jìn)行觀察兩組之間在生物學(xué)行為及信號通路之間的差異。最后應(yīng)用R軟件Hmisc、ggplot2軟件包繪制排名前10的GO及KEGG通路氣泡圖。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及Cytoscape軟件分析免疫相關(guān)關(guān)鍵模塊為了進(jìn)一步分析差異基因表達(dá)蛋白之間的相互關(guān)系，采用String在線軟件，分析差異基因表達(dá)的蛋白的，蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并下載String網(wǎng)站中的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)TSV結(jié)果文件，從而進(jìn)行后續(xù)關(guān)鍵模塊及核心基因篩選研究。

為了進(jìn)一步分析這些將蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中免疫相關(guān)的起重要作用的關(guān)鍵模塊，將下載好的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行研究，剔除網(wǎng)絡(luò)中的孤立節(jié)點(diǎn)，運(yùn)用MCODE模塊，進(jìn)行重要模塊分析。

1.5 關(guān)鍵核心基因的篩選為了進(jìn)一步分析參加這些模塊中的關(guān)鍵核心基因，運(yùn)用運(yùn)用Cytoscape中cytohubba軟件，對這些蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行關(guān)鍵核心Hub基因進(jìn)行篩選。

1.6 TCGA數(shù)據(jù)庫的整合分析考慮前面的機(jī)制探索為小鼠樣本，為了進(jìn)一步在人的胸膜間皮瘤中驗(yàn)證，采用UALCAN在線數(shù)據(jù)庫（http：∕∕ualcan.path.uab.edu∕index.html），在TCGA數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行整合分析，UALCAN是一個(gè)有效的癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘的網(wǎng)站，主要是基于TCGA數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)癌癥數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以對相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)譜分析，生存分析等。

2 結(jié)果

2.1 兩組之間差異表達(dá)基因分析結(jié)果顯示，在免疫治療反應(yīng)組（12個(gè)樣本）及免疫治療無反應(yīng)組（12個(gè)樣本）中，共篩選出1 025個(gè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義基因，相對于免疫治療無反應(yīng)組，在免疫治療反應(yīng)組中有782個(gè)上調(diào)和243個(gè)下調(diào)基因。火山圖見圖1。為了更加直觀地展示基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，按照差異倍數(shù)log FC數(shù)值，對于兩組差異基因表達(dá)情況進(jìn)行排序，排序前20個(gè)差異表達(dá)基因，見表1。

表1 基于|Log FC|排序的前20個(gè)差異表達(dá)基因

2.2 差異基因參與GO功能注釋及KEGG富集通路分析GO是基于大數(shù)據(jù)及生物信息學(xué)發(fā)展，通過對靶基因進(jìn)行功能注釋分析，進(jìn)而揭示其生物學(xué)功能，其包括生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）三個(gè)部分。對這些差異基因進(jìn)行GO功能注釋，結(jié)果顯示，這些差異表達(dá)基因的功能，在BP方面，主要參與了免疫系統(tǒng)激活、炎癥反應(yīng)以及正向調(diào)控T細(xì)胞的分化和增殖等方面；在CC方面，主要包括細(xì)胞質(zhì)膜外側(cè)面、膜型結(jié)構(gòu)、膜的整體成分、等離子體膜以及原生質(zhì)膜的組成部分等；在MF方面，主要參與了碳水化合物結(jié)合、細(xì)胞因子活性及信號傳感器活動等方面（見圖2A～2C）。在KEGG富集信號通路方面顯示，這些差異表達(dá)基因富集通路主要集中在細(xì)胞因子受體通路、細(xì)胞黏附通路、T細(xì)胞受體通路及NF-kappa B信號通路等方面（見圖2D）。

2.3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵模塊分析構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，在蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，共有節(jié)點(diǎn)數(shù)量為534，連接邊數(shù)為1 997，平均節(jié)點(diǎn)度為7.48，平均局部聚類系數(shù)為0.439，期望邊數(shù)為648，PPI富集P＜1.0×10-16。

為了評估這些蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)中，哪些分子模塊可能在免疫治療反應(yīng)中起到更加重要的作用，采用Cytoscape中MCDOE進(jìn)行關(guān)鍵模塊篩選，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度評分，分別列出節(jié)點(diǎn)度排名前3個(gè)模塊，其中節(jié)點(diǎn)度評分分別為25.856、8.632和7.000，見圖3。

2.4 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵核心基因分析基于EPC算法，計(jì)算排名前10的重要的核心基因：Tnf，Il6，Ptprc，Csf2，Cd86，Cxcl9，Sell，Cxcr3，Ccl2，Cd40。見圖4。

2.5 TCGA數(shù)據(jù)庫中關(guān)鍵核心基因整合分析為避免小鼠樣本的局限性，本研究進(jìn)一步在人的胸膜間皮瘤樣本中進(jìn)行驗(yàn)證和整合分析，結(jié)果顯示，雖然在不同的病理類型的胸膜間皮瘤中，各個(gè)基因表達(dá)水平方面有一定的差異，但是本研究的一個(gè)重要結(jié)果顯示，Tnf，Il6，Cd86，Cxcl9，Sell，Cxcr3，Cd40等療效相關(guān)關(guān)鍵分子在肉瘤樣胸膜間皮瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

MPM是惡性程度較高的腫瘤之一，因缺乏有效的治療藥物，5年生存率較低［8］。近年來隨著免疫治療在腫瘤中的應(yīng)用，免疫治療已經(jīng)在肺癌、黑色素瘤、腸癌等多種腫瘤中顯示了良好的前景［9-12］。目前已有研究表明，針對PD-1和CTLA-4通路的免疫治療，在MPM中顯示出可喜的進(jìn)步［3-6］；免疫治療在MPM的綜合治療中，正在成為一種很有希望的治療策略。然而，免疫治療在MPM中總體有效率偏低［7］，如何利用GEO數(shù)據(jù)庫中腫瘤基因信息平臺的支撐［13］、更好地提高免疫治療在MPM的精準(zhǔn)化治療，是腫瘤個(gè)體化診療中迫切需要解答的問題［14］。本研究正是基于此理論基礎(chǔ)和此臨床問題為出發(fā)點(diǎn)，探索了MPM中免疫治療療效預(yù)測標(biāo)志物，從而更好地實(shí)現(xiàn)更加精準(zhǔn)化的免疫治療。

結(jié)果提示，相對于免疫治療無反應(yīng)組，免疫治療反應(yīng)組相關(guān)差異分子更多參與了細(xì)胞因子受體、T細(xì)胞受體等相關(guān)通路，而這些通路已經(jīng)被諸多研究證實(shí)在PD-1單抗等免疫治療中起到了至關(guān)重要的促進(jìn)免疫激活的作用，從而導(dǎo)致更好的免疫治療反應(yīng)。其可能的機(jī)制在于T細(xì)胞通路的激活，增加了腫瘤微環(huán)境中浸潤性T細(xì)胞的數(shù)量，而浸潤性T淋巴細(xì)胞的浸潤與良好的免疫治療反應(yīng)呈正相關(guān)［15-17］，這一理論同樣適用于MPM的抗腫瘤免疫反應(yīng)，同時(shí)也在一定程度上支持本研究的結(jié)果。

本研究的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)在于，除了已經(jīng)被證實(shí)的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的分子通路外，我們的結(jié)果還提示，在MPM中核因子κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）信號通路可能也與良好的免疫治療反應(yīng)相關(guān)，其可能的機(jī)制在于NF-κB轉(zhuǎn)錄因子在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，包括促進(jìn)免疫系統(tǒng)的發(fā)展，先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)等生物學(xué)過程［18］，這或許可以在一定程度上解釋，NF-kappa B信號通路在MPM的免疫治療中與良好的免疫治療反應(yīng)有關(guān)的原因。

另外本研究為進(jìn)一步探索參與免疫治療調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)及其關(guān)鍵分析，進(jìn)行了重要模塊及關(guān)鍵分子分析，對MPM免疫治療參與重要通路及其功能調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因研究結(jié)果提示，這些關(guān)鍵基因大致分為三類，一類是細(xì)胞表面共刺激分子，比如CD86、CD40和PTPRC等；另一類是細(xì)胞因子類，比如腫瘤壞死因子（TNF）和白細(xì)胞介素6（IL-6）等；其他的還有趨化因子類，比如CXCL9、CXCR3及CCL2等。

關(guān)于細(xì)胞表面共刺激分子與腫瘤免疫的研究，多表達(dá)于樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、記憶T淋巴細(xì)胞、活化B淋巴細(xì)胞及活化T淋巴細(xì)胞等腫瘤免疫微環(huán)境中，尤其是CD86的發(fā)現(xiàn)，促使了CTAL-4單抗藥物在成功研究，給腫瘤的治療帶來了新的希望。另外，已有多項(xiàng)研究在其他腫瘤中提示，細(xì)胞因子在腫瘤的免疫治療中起關(guān)鍵的作用，從而調(diào)節(jié)腫瘤的免疫治療反應(yīng)。Tsukamoto等［19］研究發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中研究發(fā)現(xiàn)，以促炎細(xì)胞因子IL-6為靶點(diǎn)可以增強(qiáng)荷瘤小鼠的腫瘤特異性Th1反應(yīng)和隨后的抗腫瘤作用。IL-6阻斷后上調(diào)了免疫檢查點(diǎn)分子PD-L1在黑色素瘤細(xì)胞上的表達(dá)，研究提示IL-6在免疫治療中起到了重要的調(diào)節(jié)作用。Yi等［20］研究發(fā)現(xiàn)，TNF可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞共刺激分子免疫和促進(jìn)CD4+和CD8+T細(xì)胞的終末分化，也提示TNF基因在抗腫瘤免疫中可能作為一個(gè)新的治療策略；我們的研究提示，這些關(guān)鍵基因同樣在MPM的免疫治療中起到了重要的調(diào)節(jié)作用，與前期的在其他腫瘤中的研究結(jié)果相一致。

而本研究中，除了這些已經(jīng)被臨床應(yīng)用中證實(shí)的免疫治療相關(guān)的關(guān)鍵基因之外，本研究結(jié)果還提示，某些趨化因子在MPM的免疫治療調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用。Tokunaga等［21］研究發(fā)現(xiàn)，CXCL9及CXCR3等可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的遷移、分化和活化，從而通過旁分泌作用導(dǎo)致腫瘤抑制作用。Pascual-García等［22］亦研究發(fā)現(xiàn)，阻斷CXCL9及CCL2，可以增加腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞浸潤，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫治療。盡管這些還多數(shù)處于臨床前研究，但是仍提示，趨化因子通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫浸潤細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫治療的反應(yīng)，與我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)相一致。對這些趨化因子進(jìn)行深入研究，有望為抗腫瘤免疫聯(lián)合治療的策略提供新的思路。

另外本研究的一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)在于，這些關(guān)鍵療效預(yù)測分子在不同病理類型的MPM中的表達(dá)譜是有差異的，在肉瘤樣亞型的MPM中，Tnf，Il6，Cd86，Cxcl9，Sell，Cxcr3，Cd40等療效預(yù)測關(guān)鍵分子呈相對高的表達(dá)，提示這一類的肉瘤樣的MPM更可能從免疫治療中獲益，但是限于目前為TCGA中表達(dá)譜的研究，有待臨床進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究也有一定的局限性，是以小鼠為研究載體，探索免疫療效相關(guān)標(biāo)志物；但是檢索GEO數(shù)據(jù)庫，目前研究胸膜間皮瘤與免疫的療效的研究中，標(biāo)本目前只有小鼠來源的測序數(shù)據(jù)，但是，小鼠來源的標(biāo)本受到的干擾因素更容易控制，反而避免了在不同人群樣本中的影響或者其他混雜因素，因此，作為疾病的內(nèi)在機(jī)制的研究，小鼠標(biāo)本或許是一個(gè)很好的研究載體；而且結(jié)合既往研究，通過對小鼠樣本的研究中，對于揭示人類的疾病機(jī)制研究中扮演了非常重要的作用，所以，這也在一定程度上奠定了本研究的理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫分析，探索了MPM免疫治療療效相關(guān)分子及其參與調(diào)控的關(guān)鍵通路，進(jìn)一步對于這些關(guān)鍵基因進(jìn)行深入研究，有望為MPM更加精準(zhǔn)化的免疫治療提供預(yù)測分子標(biāo)志物，同時(shí)為進(jìn)一步開發(fā)新的藥物靶點(diǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

（本文圖1～4見插圖1-5）