重度顱腦外傷病人血清T細胞激活性低分泌因子、γ-干擾素誘導蛋白10表達及其預后相關(guān)性

郭清保，楊彥龍，史正華，常濤，李立宏

顱腦外傷是由車禍、墜落等外力引起的危急重癥，預后較差［1-2］。當下臨床多使用格拉斯哥昏迷評分（GCS）、影像學判斷顱腦外傷病人病情嚴重程度，但缺乏有效評估病人預后的指標［3］。有研究顯示，創(chuàng)傷性腦外傷病人的T細胞激活性低分泌因子（RANTES）與調(diào)節(jié)活化正常T細胞表達水平均存在異常，且可能與疾病死亡率存在聯(lián)系［4-5］。另外，γ-干擾素誘導蛋白10（IP-10）是一種趨化因子，其在創(chuàng)傷性腦損傷中水平上調(diào)，經(jīng)阿伐他汀治療后，IP-10水平顯著降低，其可能在創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)展中起重要作用［6］。但RANTES、IP-10在重度顱腦外傷病人血清中的水平及其對重度顱腦外傷預后的評估價值鮮有報道。基于此，本研究通過檢測重度顱腦外傷病人血清RANTES、IP-10水平，分析兩者與預后的關(guān)系，以期為臨床評估重度顱腦外傷病人預后狀況提供臨床證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料將2016年1月至2019年7月中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院收治的174例顱腦外傷病人作為研究對象，其中男114例，女60例，年齡范圍29～45歲，年齡（38.64±6.80）歲；體質(zhì)量指數(shù)范圍16.62～25.77 kg∕m2，體質(zhì)量指數(shù)（21.67±1.92）kg∕m2；利用GCS評分［7］分成輕度組58例（GCS 13～15分）、中度組58例（GCS 9～12分）、重度組58例（GCS 3～8分）。同時抽取58例同期健康體檢者設(shè)為健康組，其中男性37例，女性21例，年齡范圍27～48歲；體質(zhì)量指數(shù)范圍17.01～25.18 kg∕m2。各組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

納入標準：（1）病人均因顱腦外傷送至本院就診；（2）病人入院時GCS評分為3～15分，且病人受傷后昏迷超過6 h；（3）病人近親屬對本研究均知情同意。排除標準：（1）合并感染性疾病或心、肺、腎疾病者；（2）患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變者；（3）合并嚴重多發(fā)傷者。本研究經(jīng)過中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會審批（批號20160217）。預后情況：于病人外傷6個月時，使用格拉斯哥預后評分（GOS）［7］評定，將GOS得分1～3分及未滿6個月死亡病人為預后不良亞組（n=25例），GOS得分4～5分為預后良好亞組（n=33例）。

表1各組一般資料比較

1.2 主要試劑與儀器人RANTES酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（艾美捷科技有限公司，貨號BEK-2088-1P）；人IP-10 ELISA試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司，貨號R-836）。Q3000酶標儀購買于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集于健康體檢者與重度顱腦外傷病人入院當日清晨采集空腹外周靜脈血4～5 mL，室溫下凝集，以4 500 r∕min離心7 min，保存上清液，裝至無菌EP管中，保存于-80℃冰箱中，等待檢查。

1.3.2 血清RANTES、IP-10檢測嚴格按照對應(yīng)試劑盒說明書操作配制濃度不同的標準品，使用酶標儀檢測RANTES、IP-10于450 nm處的吸光度，并繪制標準品回歸曲線；解凍血清樣本，并平衡至室溫，將血清加入酶標板中，每孔100 μL，設(shè)置3個復孔；將酶標板放于37℃培養(yǎng)箱中，孵育25～30 min，每孔分別相應(yīng)添加含有100 μL RANTES、IP-10的生物素工作液，37℃孵育45～50 min，棄掉反應(yīng)液，利用磷酸緩沖液（PBS）洗滌3次；之后，每孔加入100 μL親和素-過氧化物酶復合物工作液，37℃孵育25～30 min，棄去反應(yīng)液，PBS洗滌3次；每孔加入顯色液90 μL，在37℃環(huán)境下孵育25 min，最后每孔加終止液10 μL，檢測各樣本于450 nm處的吸光度，根據(jù)標準曲線計算血清RANTES、IP-10濃度。

1.4 統(tǒng)計學方法本研究利用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。經(jīng)正態(tài)性檢驗，計量數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，采用xˉ±s表示，進行獨立樣本t檢驗，四組比較，進行單因素方差分析，進一步兩兩比較，行SNK-q檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，行χ2檢驗；采用Pearson法分析重度顱腦外傷病人血清RANTES水平與IP-10的相關(guān)性；以ROC曲線評價血清RANTES、IP-10對重度顱腦外傷病人預后的診斷價值。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清中RANTES、IP-10水平比較較健康組，其他三組血清RANTES、IP-10水平均顯著升高（P＜0.05）；較輕度組，中、重度組血清RANTES、IP-10水平均顯著升高（P＜0.05）；較中度組，重度組血清RANTES、IP-10水平均顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組血清中RANTES、IP-10水平比較

表2 各組血清中RANTES、IP-10水平比較

注：RANTES為創(chuàng)傷性腦外傷病人的分泌因子，IP-10為γ-干擾素誘導蛋白10。①與健康組相比，P＜0.05。②與輕度組相比，P＜0.05。③與中度組相比，P＜0.05。

組別健康組輕度組中度組重度組F值P值例數(shù)58 58 58 58 RANTES∕（μg∕L）0.88±0.27 1.36±0.38①1.68±0.43①②2.06±0.60①②③76.09＜0.001 IP-10∕（ng∕L）194.08±48.33 247.49±54.45①290.53±62.76①②362.18±68.82①②③83.77＜0.001

2.2 重度顱腦外傷病人血清RANTES水平與IP-10的相關(guān)性Pearson法分析顯示，重度顱腦外傷病人血清RANTES水平與IP-10呈正相關(guān)（r=0.46，P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 重度顱腦外傷病人血清T細胞激活性低分泌因子（RANTES）水平與γ-干擾素誘導蛋白10（IP-10）的相關(guān)性

2.3 兩組不同預后重度顱腦外傷病人血清RANTES、IP-10水平比較與預后良好亞組相比，預后不良亞組重度顱腦外傷病人血清RANTES、IP-10均明顯升高（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組不同預后重度顱腦外傷病人血清T細胞激活性低分泌因子（RANTES）與γ-干擾素誘導蛋白10（IP-10）比較

表3 兩組不同預后重度顱腦外傷病人血清T細胞激活性低分泌因子（RANTES）與γ-干擾素誘導蛋白10（IP-10）比較

注：RANTES為創(chuàng)傷性腦外傷病人的分泌因子，IP-10為γ-干擾素誘導蛋白10。

組別預后良好亞組預后不良亞組t值P值例數(shù)33 25 RANTES∕（μg∕L）1.73±0.45 2.45±0.68 4.85＜0.001 IP-10∕（ng∕L）321.29±63.37 406.32±72.45 4.76＜0.001

2.4 血清RANTES、IP-10對重度顱腦外傷病人預后的評估價值通過繪制血清RANTES、IP-10及兩者聯(lián)合對重度顱腦外傷病人預后評估價值的ROC曲線，其AUC 95%CI分別為0.82（0.70，0.94）、0.80（0.68，0.92）、0.90（0.82，0.99），截斷值為2.02 μg∕L、355.31 ng∕L，此時其靈敏度與特異度分別為72.0%、72.0%、88.0%與87.9%、78.8%、84.8%，約登指數(shù)為0.599、0.508、0.728。見圖2。

圖2 血清T細胞激活性低分泌因子（RANTES）水平與γ-干擾素誘導蛋白10（IP-10）對重度顱腦外傷病人不良預后的ROC曲線評價

3 討論

顱腦外傷是神經(jīng)外科較為常見的腦損傷疾病，其可引起顱內(nèi)壓升高、腦水腫，使腦血液循環(huán)受阻、腦血供應(yīng)不足，引發(fā)腦神經(jīng)細胞缺血缺氧，造成認知功能障礙，甚至導致死亡［8-9］。此外，GCS及CT、MRI影像學檢測是判定顱腦外傷的常用手段，但存在一定缺陷，因此，尋找可準確評估顱腦外傷疾病嚴重程度及預后的生物學標志物，對改善病人預后有重要意義。

RANTES是一種重要趨化性細胞因子，可趨化多種細胞，介導白細胞浸潤，激活淋巴細胞，調(diào)節(jié)細胞生長、分化，參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等過程［10-11］。研究發(fā)現(xiàn)，RANTES在冠狀動脈粥樣硬化病人血清中水平顯著升高，其可作為早期診治無癥狀冠狀動脈粥樣硬化的靶標［12-13］。此外，Lewis等［14］研究發(fā)現(xiàn)RANTES在急性創(chuàng)傷性腦損傷病人血漿中表達失調(diào)，其水平與創(chuàng)傷性腦損傷后不良結(jié)局關(guān)系密切。以上研究表明，RANTES水平異常可能與腦損傷類神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)。本研究中顱腦外傷病人血清RANTES水平顯著高于健康者，與Albert等［4］研究結(jié)果類似，且其水平隨病情加重而呈上升趨勢，提示RANTES可能在顱腦外傷病理進展中具有重要作用，RANTES有利于輔助評估病人疾病進展程度，推測高水平RANTES促進白細胞浸潤，促進炎癥反應(yīng)，加重機體免疫功能紊亂，從而促進顱腦外傷發(fā)展。

IP-10是一種Th1型趨化因子，屬于趨化因子CXC亞家族成員，其可聚集炎性細胞發(fā)生浸潤、趨化，促進分泌多種與肺炎、腦膜炎等炎癥類疾病相關(guān)的細胞因子［15-16］。研究發(fā)現(xiàn)，IP-10可通過誘導TNF-α產(chǎn)生，進而破壞血腦屏障完整性，從而在日本腦炎疾病進展中發(fā)揮重要作用［17-18］。此外，有研究認為急性腦損傷后交感神經(jīng)系統(tǒng)過度活化，可引起外周炎癥細胞因子∕趨化因子失調(diào)，進而加重繼發(fā)性腦損傷，其中IP-10作為趨化因子家族一員，其在急性腦損傷病人血漿中水平異常升高，IP-10可能在腦外傷發(fā)展進程中起重要作用［19-20］。以上研究表明，IP-10可能參與并影響神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病的出現(xiàn)與疾病進展。本研究顯示健康者血清IP-10水平明顯低于顱腦外傷病人，且隨著疾病進展，IP-10水平越來越高，表明IP-10對顱腦外傷病情發(fā)展具有一定作用，推測與高水平IP-10促進炎性細胞浸潤、釋放多種炎性介質(zhì)，加重免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)，進而促進顱腦外傷發(fā)展。

本研究中重度顱腦外傷病人血清RANTES水平與IP-10呈正相關(guān)，表明IP-10可與RANTES互相作用，從而共同對重度顱腦外傷的發(fā)展產(chǎn)生影響，但其相互影響的機制仍需進一步研究。本研究顯示，預后不良亞組重度顱腦外傷病人血清RANTES、IP-10均明顯高于預后良好亞組，血清RANTES、IP-10水平可能與重度顱腦外傷預后相關(guān)，及時監(jiān)控血清RANTES、IP-10水平對重度顱腦外傷診治、預后評估有一定潛在價值。進一步研究顯示，血清RANTES、IP-10對重度顱腦外傷病人不良預后預測價值的AUC分別為0.82、0.80，當血清RANTES水平＞2.02 μg∕L或IP-10＞355.31 ng∕L時，重度顱腦外傷病人發(fā)生不良預后概率較高，提示血清RANTES、IP-10對重度顱腦外傷病人預后均有一定評估價值；兩者聯(lián)合重度顱腦外傷病人不良預后預測價值的AUC為0.90，其靈敏度88.0%，特異度為84.8%，提示RANTES、IP-10聯(lián)合檢測可有效提高對重度顱腦外傷病人預后的預測價值。

綜上所述，RANTES、IP-10在重度顱腦外傷病人中均呈高水平，兩者可能在顱腦外傷發(fā)展進程中發(fā)揮一定作用，兩者聯(lián)合可有效提高對重度顱腦外傷不良預后的診斷價值，有助于臨床篩查不良預后病人。但本研究未深入探究RANTES、IP-10在重度顱腦外傷中的作用機制、樣本較少，后期將進行深入探討。