消癌解毒方聯合化療對彌漫大B細胞淋巴瘤外周血CD4+CD25+CD127low調節性T細胞的影響

陳曉麗，孔祥圖，于慧，姜鵬君，劉寧，倪海雯

彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL）約占非霍奇金淋巴瘤（NHL）的30%～35%［1］，以R-CHOP（利妥昔單抗聯合環磷酰胺、多柔比星、長春新堿及潑尼松）為基礎的一線治療方案極大地改善了該病的治療現狀，但是依然有約1∕3的病人面臨耐藥或復發［2］，對于RCHOP+X方案的探索是目前研究的熱點及難點［3］。針對療效、安全性、生活質量、治療花費的綜合考慮是優化治療方案探索的重點，治療后感染事件、并發癥均是真實世界中DLBCL治療管理的難題，也帶來了嚴重的經濟和心理負擔［4］。中西整合治療淋巴瘤是發揮中醫藥解決疑難疾病的重要舉措，本團隊繼承及發展國醫大師周仲瑛教授癌毒病機理論，結合本中心淋巴瘤診療實踐創立消癌解毒方。在前期研究中，我們觀察到消癌解毒方聯合R-CHOP方案治療初診DLBCL，相比單純R-CHOP方案化療組，有助于改善中醫證候，減少并發癥、提高病人生活質量［5］。具體作用機制尚需進一步深入探索。有研究顯示，以周仲瑛教授“癌毒”理論為指導的消癌解毒方與化學治療藥物聯合使用時，能調節病人的免疫功能［6］。調節性T細胞（Treg）是一類具有免疫調節功能的T細胞，有維持機體免疫自穩的功能，對調控免疫應答方面也發揮著重要作用［7］。Treg對包括淋巴瘤在內的腫瘤生存預后的影響以及抗腫瘤免疫方面的作用，已成為腫瘤免疫治療的研究熱點［8］。淋巴瘤是一組異質性極強的腫瘤，同一病理亞型的淋巴瘤病人預后和療效也不盡相同，目前，針對初診DLBCL Treg的研究較少。本研究以初診DLBCL病人為研究對象，對比消癌解毒方聯合R-CDOP（利妥昔單抗聯合環磷酰胺、脂質體多柔比星、長春新堿及潑尼松）方案與單純R-CDOP方案治療的臨床療效，及外周血Treg百分比的變化，探索Treg在初診DLBCL病人發病中的意義以及消癌解毒方對于Treg表達的影響，揭示癌毒理論指導下的消癌解毒方對于淋巴瘤免疫調控的可能影響，為進一步形成中西結合臨床新方案提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取南京中醫藥大學附屬醫院2018年1月至2022年1月收治的初診DLBCL病人共47例為研究對象，男26例，女21例，中位年齡61歲，年齡范圍21～83歲。中醫基本病機屬正虛痰毒，瘀熱互結。47例病人經病理組織活檢證實為DLBCL（非特指型），符合2016年修訂第4版WHO淋巴組織腫瘤分類標準［9］，且均未合并嚴重心腦血管、肝、腎、內分泌等其他系統性疾病。47例病人用隨機數字表法隨機分為治療組（消癌解毒方聯合R-CDOP方案）24例和對照組（單純R-CDOP方案）23例。治療組中男14例，女10例，中位年齡59歲，年齡范圍25～83歲。對照組中男12例，女11例，中位年齡63歲，年齡范圍21～83歲。兩組病人一般資料進行比較，差異無統計學意義（P＞0.05），兩組間具有可比性。見表1。本項研究中47例病人均已簽署知情同意書，研究內容已經通過了南京中醫藥大學附屬醫院醫學倫理委員會的批準（批號2017NL-132-02）。按隨機數字表法選取健康對照組45例，男21例，女24例，中位年齡40歲，年齡范圍12～80歲，均來自門診健康體檢者。

表1 初診彌漫大B細胞淋巴瘤47例一般資料比較∕例

1.2 治療方案所有病人給予6個療程的R-CDOP方案化療，6個療程后獲得完全緩解的病人，繼續予2個療程利妥昔單抗追加治療。R-CDOP方案具體為：利妥昔單抗劑量為375 mg∕m2，第0天；環磷酰胺750 mg∕m2，第1天；脂質體多柔比星25 mg∕m2，第1天；長春地辛4 mg，第1天；潑尼松60 mg∕m2換算成等量地塞米松第1～5天。治療可以根據病人年齡和體能評分進行調整。年齡大于80歲或體能狀態較差的病人，允許采用R-miniCDOP。所有病人均在每21天進行1次化療，化療過程中均使用5-羥色胺3（5-HT3）受體拮抗劑托烷司瓊預防化療所致的惡心、嘔吐，提高病人化療的耐受性。治療組的6周期化療期間及化療間歇期均口服消癌解毒方。消癌解毒方組成：炙鱉甲15 g、土鱉蟲10 g、三棱10 g、莪術10 g、制南星10 g、浙貝母10 g、澤漆10 g、僵蠶10 g、北沙參10 g、天冬10 g、麥冬10 g、太子參15 g、拔契10 g、蛇舌草15 g、半枝蓮10 g。每日一劑。煎煮方法：加入500 mL水浸泡1 h，濃煎取藥汁150 mL，每次75 mL，每日兩次，飯后1 h溫服。

1.3 主要試劑及儀器本研究中使用的鼠抗人單克隆抗體CD4-FITC（批號51）、CD25-PC5（批號200068）、CD127-PE（批號200070），紅細胞裂解液（批號34）以及流式細胞儀（NAVIOS）購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.4 外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例檢測在第1周期治療前約1周內，及6個周期治療結束約1月后復診時，消癌解毒方聯合R-CDOP方案的治療組、單純R-CDOP方案的對照組，以及健康對照組，均在各組被觀察對象清晨空腹時，采取靜脈血2 mL，以乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-2K）抗凝，采用直接免疫熒光標記法進行標記細胞，以流式細胞儀進行分析。本研究中，免疫表型為CD4+CD25+CD127low的細胞亞群被界定為Treg，并以CD4+CD25+CD12 7low細胞占CD4+細胞的百分比來表示Treg水平。操作步驟：各取鼠抗人單克隆抗體CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE 20 μL，加入到100 μL EDTA-2K抗凝的外周血中，在室溫下避光孵育15 min后，再加入紅細胞裂解液500 μL，繼續避光孵育10 min后，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，離心后棄上清，加入適量的PBS上機檢測。

1.5 臨床療效評價標準6個周期治療結束后，47例病人均行CT或正電子發射斷層顯像／計算機斷層顯像（PET∕CT）掃描檢查進行療效評估，參照2014版Lugano療效評價標準中CT評價標準［10］，分為完全緩解（CR）：靶病灶（淋巴結）長徑≤1.5 cm，無淋巴結外病灶，增大的器官退至正常，無新發病灶；部分緩解（PR）：最多6個可測量靶病灶最大垂直直徑乘積之和（SPD）縮小率≥50%，無新發病灶；疾病穩定（SD）：最多6個靶病灶SPD增大率＜50%，無疾病進展（PD）證據；PD：至少1個病灶進展即可診斷，新發病灶或原有非可測病灶明確進展，新發或復發骨髓受累。總緩解率（ORR）定義為（CR+PR）率。

1.6 統計學方法采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析。計量資料采用Kolmogorov-Smirnov test進行正態性檢驗，本研究計量數據因不符合正態分布，采用M（P25，P75）的方式進行統計描述，以非參數檢驗進行各組間差異的統計學推斷。各組治療前和同組治療前后差別的比較，均采用Mann-Whitney-U檢驗。采用Pearsonχ2檢驗進行兩組療效分布的比較。以例數對計數資料進行統計描述，組間使用χ2檢驗來進行統計推斷。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 初診DLBCL病人外周血Treg百分比水平治療前，治療組及對照組兩組病人和健康對照的Treg百分比中位數（下、上四分位數）分別為6.01%（4.59%，7.82%）、5.73%（4.82%，6.58%）、7.32%（6.03%，8.71%），治療組和對照組病人治療前外周血百分比均低于健康人（Z=2.64、3.42，P＜0.05）。

2.2 DLBCL病人治療前后外周血Treg百分比的比較治療前，治療組和對照組初診DLBCL病人的外周血Treg細胞百分比差異無統計學意義（P＞0.05）。治療6周期結束后，治療組外周血Treg百分比較治療前明顯上升（P＜0.05），對照組治療前后Treg百分比變化差異無統計學意義（P＞0.05），治療組比對照組的Treg百分比明顯上升（P＜0.05）。見表2。

表2 彌漫大B細胞淋巴瘤47例外周血Treg百分比的變化比較∕［%，M（P25，P75）］

2.3 兩組DLBCL病人臨床療效比較治療組可評價病人24例（CR16例、PR3例、SD0例、PD5例），ORR為79.17%；對照組可評價病人23例（CR13例、PR3例、SD2例、PD5例），ORR為69.56%。兩組病人療效比較，差異無統計學意義（χ2=0.57，P=0.450）。

3 討論

DLBCL是最常見的侵襲性NHL，R-CHOP方案作為一線治療歷經20年依然是初診DLBCL病人的治療基石。對于R-CHOP方案耐藥和治療后復發的病人治療選擇有限，優化目前治療方案的探索依然是淋巴瘤研究領域的熱點和挑戰［11］。疾病相關、靶向藥物治療相關的免疫缺陷，抗腫瘤免疫的失衡在淋巴瘤的臨床及基礎研究中受到學者們的關注［12］，開發針對免疫調控環節的有效藥物具有非常重要的實踐意義。眾多的具有補氣、化痰、解毒功效的天然藥物擁有抗腫瘤及調節免疫的雙重作用［13］。課題組長期致力于探索國醫大師經驗方的開發應用，開展中西整合優化方案的臨床和機制研究，尋找中藥療效評價新靶標。

相比于實體瘤來說，DLBCL免疫微環境調控存在更加復雜的機制，Treg是近年來抗腫瘤免疫研究的熱點之一。Treg是CD4+T細胞的一個亞群，通過免疫抑制，來維持免疫系統對自身成分的耐受，從而發揮保持機體免疫穩態的作用。大多數的腫瘤免疫研究認為，Treg通過抑制機體的抗腫瘤免疫反應，在腫瘤免疫逃逸機制中發揮著重要的作用。叉頭框蛋白P3（FoxP3）是Treg發揮抑制作用的主要調節因子，CD4+CD25+Foxp3+是Treg較為普遍應用的分子標記，但因Foxp3在細胞內表達，在Treg的功能研究中應用受限，多個研究表明，細胞表面蛋白分子IL-7受體（CD127）和Foxp3表達呈現密切的負相關，CD4+CD25+CD127low與CD4+CD25+Foxp3+表達高度一致，外周血CD4+CD25+CD127low可以作為Treg的分子標記［14］。因此，本研究采用流式細胞儀檢測CD4+CD25+CD127lowTreg在外周血的百分比，探索Treg在初診DLBCL中的變化，揭示其在DLBCL免疫調控中的意義。

本研究中我們檢測了47例初診的DLBCL病人和45名健康人的外周血Treg百分比，發現初診DLBCL病人治療前的外周血Treg百分比低于健康人，該觀察結果與已報道的多種實體腫瘤病人外周血或組織中Treg表達水平偏高的情況不一致。目前在肺癌［15］、卵巢癌［16］、肝癌［17］等實體腫瘤的研究發現，病人的外周血或腫瘤組織中Treg比例較正常人增高，且高水平的外周血或腫瘤組織中Treg往往提示疾病預后不良［18］。

Treg對淋巴瘤病人生存預后的影響及其機制，目前有不同于實體瘤的研究報道。有研究發現Treg在淋巴系統腫瘤的免疫調控作用與實體瘤相比，體內Treg增多促進非血液系統腫瘤發生，相反，Treg減少促進淋巴瘤發生［19］。Dehghani等［20］研究發現Treg對腫瘤性B淋巴細胞的增殖具有抑制作用，外周血中更高比例的Treg以及Treg∕Th17（調節性T細胞∕輔助性T細胞17）比例與淋巴瘤的預后良好具有相關性，并與更好的治療反應以及較低的復發率有關。惰性淋巴瘤中的濾泡性淋巴瘤向DLBCL的轉化，也與腫瘤微環境中Treg數量的顯著減少有關［21］。在DLBCL病人中，疾病惡性程度高的常見外周血Treg絕對數減低，且可作為獨立于國際預后指數危險度分層的不良預后因素［22］。DLBCL病人外周血或腫瘤組織中Treg的增多或浸潤，與預后良好相關［20，23］。產生這些現象的機制可能為Treg通過穿孔素∕顆粒酶調節惡性B細胞或Fas-FasL相互作用［24］，也可能是通過間接抑制B細胞成熟所必需的Th細胞來間接抑制B細胞［25］。

淋巴瘤為現代病名，目前中醫藥研究缺乏統一標準，“癌毒”理論是國醫大師周仲瑛結合了近60年的臨床經驗總結而成的，在臨床實踐中成為指導腫瘤治療的權威理論，并得到不斷豐富和發展。程海波教授團隊發展了癌毒病機學說，創立了以國醫大師經驗基礎上的腫瘤辨治體系指南，以“消癌解毒”貫穿始終的癌毒病機理論突出了“癌毒”的特征，針對各科腫瘤的不同特點以法統方，組成消癌解毒類核心方［26］，并開展臨床和基礎的深入研究，揭示癌毒病機的本質及在臨床研究中的意義和價值［27］。課題組在癌毒病機理論指導下結合臨床實踐，以病機要素“痰、熱、瘀、毒、虛”為核心，組成消癌解毒方，其中，僵蠶、土鱉蟲、鱉甲化痰搜剔；制南星、浙貝母化痰解毒；白花蛇舌草、半枝蓮清熱解毒。三棱、莪術活血化瘀。癌毒傷正，以氣虛、陰虛為多見，故以太子參、北沙參、麥冬氣陰雙補。

在本研究中發現，消癌解毒方聯合化療組與對照組相比可以提高DLBCL病人外周血Treg百分比。揭示了消癌解毒方有可能通過調控Treg恢復免疫微環境的失衡、從而對于DLBCL的抗腫瘤免疫發揮積極影響。癌毒病機指導下的消癌解毒方聯合化療，具有調控腫瘤病人免疫功能的作用［28］，既往研究報道均以實體瘤較多，淋巴瘤方面鮮有報道。淋巴瘤異質性較強，化療方案較難統一，但是初診DLBCL目前標準一線方案仍以R-CHOP方案為主。相比于傳統多柔比星，脂質體多柔比星可提高對腫瘤組織的靶向殺傷作用，減弱對心臟的不良反應［29］。因此，本研究以初診DLBCL的病人作為研究對象，開展對照研究，采用一線R-CDOP方案聯合或不聯合消癌解毒方治療，觀察消癌解毒方對于Treg的影響。結果提示初診DLBCL病人外周血Treg百分比低于健康對照，兩組病人6個療程治療結束后，治療組比對照組病人的外周血Treg百分比明顯上升（P＜0.05）。本研究結果與近年來Treg在淋巴瘤腫瘤免疫調控的意義具有一致性。本研究中客觀療效比較，治療組總緩解率高于對照組，但差異無統計學意義，考慮與本研究中病例數偏少、初診DLBCL臨床療效的影響因素比較復雜，受疾病分期、分子學異質性等影響有關。另外，本研究觀察時間尚短，消癌解毒方調控Treg發揮抗腫瘤免疫的影響尚不足以轉化為臨床客觀療效的獲益。外周血Treg百分比減低是否可以用于判斷DLBCL病人預后，能否成為獨立于危險度分層的不良預后因素，后續須擴大樣本量細化亞組分析并結合包括臨床及代謝組學等多指標參數進一步在全程隨訪管理中觀察總結、綜合評估。

總之，本研究通過隨機對照研究，探索了課題組臨床經驗方消癌解毒方對于初診DLBCL病人外周血Treg百分比的影響、部分闡述了消癌解毒方發揮增效解毒的可能原因。目前中藥復方臨床應用的隨機對照研究是中醫藥現代化研究的方向和難點。基于國醫大師理論的中醫臨床實踐指南，開展疑難疾病中西整合優化方案探索，結合客觀指標闡釋作用機制，開發有效方劑符合國家中醫藥發展的戰略方向。Treg在淋巴瘤領域的相關研究揭示了其與腫瘤細胞、免疫微環境、分子靶向藥應用均存在復雜的相互影響［30］，在分子靶向藥治療的時代，積極探索中醫藥調控Treg發揮抗腫瘤免疫的作用，同時關注中藥與分子靶向藥的相互作用，可形成中西結合治療DLBCL的有效臨床新方案。