復方木芙蓉涂鼻軟膏治療變應性鼻炎的臨床療效及其網絡藥理學研究

何俐瑩，陶雪瑩，岑超

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）又稱過敏性鼻炎、變態反應性鼻炎。是一種吸入外界過敏性抗原而引起的、以鼻癢、打噴嚏、流清涕等為主要癥狀的疾病［1］。AR是兒童極為常見的一種慢性鼻黏膜充血的疾病，鼻癢是本病的重要特征；過敏發作期還會出現眼部過敏癥狀；呼吸道過敏嚴重的病兒還會出現過敏性咳嗽和哮喘［2］。

中醫將變態反應性鼻炎歸為“鼻鼽”的范圍，鼽，古籍中指鼻塞不通，也指鼻子流清涕，在此取意后者。中醫認為AR多發于肺、脾、腎三臟的虛弱，其主要包括肺氣虛、脾氣虛、腎陽不足等證［3］；而西醫認為AR是個體接觸過敏原后由免疫球蛋白-E（IgE）介導的超敏反應，由多種細胞因子和炎性因子共同參與的鼻黏膜慢性非感染性炎癥。復方木芙蓉涂鼻軟膏（MNO）是貴州苗族驗方，由木芙蓉葉、地榆兩味中藥組成，具有解表通竅，清熱解毒的功效，現代臨床常應用于干燥性鼻炎［4］、變應性鼻炎［5］、急性鼻炎［6］等多種鼻腔疾病［7］。現代藥理研究表明，復方木芙蓉涂鼻軟膏可以降低小鼠耳郭腫脹，并且能顯著抑制二甲苯致小鼠耳毛細血管通透性增高及對抗醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增高，具有良好的抗炎作用。但復方木芙蓉涂鼻軟膏組方成分復雜，作用靶點多，而目前尚無復方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR的有效靶點及信號通路的研究。

本研究分析了重慶醫科大學附屬婦女兒童醫院采用復方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR的臨床療效，并利用網絡藥理學分析其潛在的關鍵靶點及作用機制，為其以后的臨床及基礎研究提供可靠的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇重慶醫科大學附屬婦女兒童醫院2019年10月至2020年12月確診為AR的病人130例，其中男性68例，女性62例；年齡范圍6～12歲；病程范圍4～12周，按數字表法將入選的病人分為對照組和治療組兩組，每組分別65例；兩組一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。病人及其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求

表1 兩組變應性鼻炎130例一般資料比較

1.2 西醫診斷標準參照《變應性鼻炎的診治原則和推薦方案（2004年，蘭州）》［8］，臨床癥狀：①打噴嚏、清水樣涕、鼻塞、鼻癢等癥狀出現2項以上，每天癥狀持續或累計1 h以上，可伴有眼癢、流淚和眼紅等眼部癥狀；②體征：常見鼻黏膜蒼白、水腫，鼻腔水樣分泌物；③變應原檢測：至少一種變應原皮膚點刺實驗（SPT）和（或）血清特異型IgE陽性。

1.3 中醫診斷標準參照《中醫臨床診療指南-耳鼻咽喉疾病分冊》［9］，本病分為四類證候：①肺氣虛寒證：發作性鼻癢，噴嚏連作，清涕量多，鼻塞，嗅覺減退；鼻黏膜色淡、腫脹；語聲低，易患感冒，經常咳嗽、咳痰；舌淡紅，苔薄白，脈細弱。②脾氣虛弱證：發作性鼻癢，噴嚏連作，清涕量多，鼻塞，嗅覺減退；鼻黏膜色淡、腫脹；食少，便溏，倦怠乏力；舌淡紅或胖，邊有齒痕，苔薄白，脈細弱。③腎陽不足：發作性鼻癢，噴嚏連作，清涕量多，鼻塞，嗅覺減退；鼻黏膜蒼白、腫脹；畏寒，肢冷，腰膝酸軟；舌淡，苔白，脈沉細。④肺經伏熱證：發作性鼻癢，噴嚏連作，清涕量多或為黏稠涕，鼻塞，嗅覺減退；鼻黏膜偏紅、腫脹；口干；舌紅，苔薄白或薄黃，脈數。

1.4 納入標準①符合變態反應性鼻炎中∕西醫診斷標準；②至少有2個主要癥狀；③2周內未接受抗過敏藥或免疫調節藥物。

1.5 排除標準①非變態反應性鼻炎；②患上、下呼吸道感染，及其他鼻部疾病；③近1個月用過腎上腺糖皮質激素，或2周內進行過變應性鼻炎治療；④正在使用大環內酯類抗生素和（或）系統使用咪唑類抗真菌藥者。

1.6 退出（脫落）標準①對復方木芙蓉涂鼻軟膏出現或疑似過敏反應或嚴重不良事件；②治療過程中，出現其他情況不宜繼續使用；③病人依從性差，未遵醫囑用藥者，或自動中途換藥者；

1.7 治療方法對照組采用丙酸氟替卡松鼻噴霧劑（葛蘭素史克集團公司，輔舒良50 μg×120噴）治療，觀察組采用復方木芙蓉涂鼻軟膏（貴州良濟藥業有限公司），早晚各1次，取長約1 cm涂于鼻腔內，治療療程4周。

1.8 觀察指標觀察對比病人用藥前后尿中白三烯E4（LTE4）以及血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-4、IL-6、IL-12等炎性因子水平。

1.9 療效評價標準根據癥狀記分評定療效。觀察病人用藥前后的主要癥狀變化情況：①鼻塞：主要以口呼吸為4分；需用口輔助呼吸為3分；用鼻子勉強自主呼吸為2或1分。②鼻癢：無法忍受為4分；持續性鼻癢可耐受為3分；間歇性鼻癢可耐受為2分；偶有鼻癢為1分。③打噴嚏：1次連打噴嚏個數≥11個為4分；6～10個為3分；3～5個為2分，1～2個為1分。④流涕：每日流涕次數≥10次為4分；5～9次為3分；≤4次為1～2分。⑤眼癢流淚：持續眼癢流淚為3分；間歇性眼癢流淚為2分；偶有眼癢流淚為1分。癥狀改善百分率＝（治療前總分-治療4周后總分）∕治療前總分×100%。①顯效：癥狀改善百分率≥66%；②有效：癥狀改善百分率26%～65%；③無效：癥狀改善百分率≤25%。

1.10 基于網絡藥理學研究利用TCMSP數據庫（https：∕∕tcmspw.com∕tcmsp.php）、UniProt數 據 庫（https：∕∕www.uniprot.org∕）、GeneCards數 據 庫（https：∕∕www.genecards.org∕）、STRING數 據 庫（https：∕∕string-db.org∕）、DrugBank數 據 庫（https：∕∕www.drugbank.ca∕）對復方木芙蓉涂鼻軟膏潛在有效成分進行篩選［10-11］，化合物篩選標準：DL≥0.18［12-14］或符合Lipinski類藥性五原則。通過OMIM數據庫、GeneCards數據庫、DrugBank數據庫，以Allergic rhinitis為關鍵詞，同時以來源為人類（homo sapiens）為條件，檢索和篩選AR相關的靶點。將每個化合物與其作用的AR靶點相聯系，采用Cytoscape 3.7.1軟件進行復方木芙蓉涂鼻軟膏的成分-AR相關靶點相互作用網絡的構建并繪制網絡圖。采用R語言中的Bioc-Manager包對復方木芙蓉涂鼻軟膏活性成分和AR共同靶點進，基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。

1.11 統計學方法數據采用SPSS 20.0統計學軟件處理，其中癥狀積分數據采用非參數秩和檢驗；計量資料用±s表示，采用t檢驗，計數資料用例（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床療效比較治療4周后，觀察組的總有效率明顯高于對照組，兩組臨床總有效率差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組變應性鼻炎130例臨床療效比較∕例（%）

2.2 兩組治療前和治療4周后尿中LTE4水平治療前，觀察組與對照組比較差異無統計學意義，治療4周后，兩組尿LTE4水平均顯著低于治療前（P＜0.001）。治療后，對照組、觀察組TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12表達水平均出現顯著下降，組間相比，采用復方木芙蓉涂鼻軟膏的觀察組TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12表達量顯著低于對照組，差異有統計學意義（均P＜0.05）。見表3。

表3 兩組變應性鼻炎130例LTE4水平、血清炎性因子變化比較

表3 兩組變應性鼻炎130例LTE4水平、血清炎性因子變化比較

注：LTE4水平為白三烯E4水平，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-4為白細胞介素-4，IL-6為白細胞介素-6，白細胞介素-12為IL-12。

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2.3 活性化合物的篩選及其靶點預測通過篩選，共得到9個主要活性成分，包括山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、丁子香萜、2，3，8-三鄰甲基鞣花酸等，見表4。通過變應性鼻炎靶點篩選，得到AR相關靶點3 715個，復方木芙蓉涂鼻軟膏藥物靶點基因146個，并且得到復方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR的潛在靶點117個，其結果見圖1-Venn diagram。

表4 復方木芙蓉涂鼻軟膏的9個主要活性成分

2.4 靶點PPI網絡、關鍵基因分析將117個潛在靶點倒入String數據庫，進行蛋白互作分析，最后使用String繪制軟件構建復方木芙蓉涂鼻軟膏蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡圖，見圖2。Degree值越大表示該靶點為AR疾病的關鍵靶點，與AR密切相關，選取Degree值前10的關鍵靶點，構建其關鍵靶點的PPI網絡，見圖3，4。前10個疾病靶點如下：AKT1、IL6、ALB、VEGFA、CASP3、JUN、MAPK8、PTGS2、MAPK1、MYC，表明前10個靶點在復方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR過程中起關鍵性作用。

2.5 成分-靶點-通路網絡構建采用Cytoscape 3.7.1軟件，構建了復方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR成分-靶點-通絡網絡圖，見圖5。其中綠色為活性成分，紫色為化合物作用的靶點，其中作用靶點117個，提示這些蛋白可作為復方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR的潛在靶點。

2.6 GO分析和KEGG通路富集分析為解釋復方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR的作用機制，采用R語言對復方木芙蓉涂鼻軟膏活性成分和AR共同靶點進行GO分析（圖6），共獲得117條GO生物學過程，其主要包括核受體活性、轉錄因子活性、類固醇激素受體活性、細胞因子受體結合、細胞因子活性、血紅素結合、四曲吡咯結合、氧化還原酶活性等，表明復方木芙蓉涂鼻軟膏可以通過多種生物學調控過程發揮治療AR的作用。

KEGG通路富集顯示復方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR關鍵基因靶點主要富集通路有108條，主要涉及流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路、糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、輔助性T細胞17信號通路、HIF-1信號通路、NF-κB信號通路、甲型流感通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等，根據P≤0.05選取排名靠前的30條通路，見表5。

表5 復方木芙蓉涂鼻軟膏治療變應性鼻炎KEGG富集分析結果

3 討論

變應性鼻炎發生機制和輔助性T淋巴細胞亞群Th1∕Th2平衡、炎性因子異常表達關系密切，炎性因子異常不僅在變應性病變過程中具有關鍵作用，而且其對疾病預后有一定影響［15］。在Th1∕Th2平衡中，Th1主要釋放Th1型細胞因子γ干擾素（IFN-γ）、IL-2抑制Th2釋放的炎性因子TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12，從而控制機體的免疫應答。本研究治療后，兩組的TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12均有顯著下降，說明在治療之后，病人體內炎癥反應多得到有效抑制，進一步對組間數據對比發現，使用復方木芙蓉涂鼻軟膏的觀察組炎癥抑制效果顯著優于常規治療的對照組，說明其具有抑制炎癥反應的效果。并且藥物可降低變應性鼻炎病人尿LTE4水平，提示其一方面可能通過干預的生物合成或作用于白三烯（LTs）受體，抑制LTs的釋放，從而降低對中性粒細胞、嗜酸粒細胞及單核細胞等的趨化作用，使作用于鼻腔黏膜的炎癥介質、細胞因子的數量降低，炎性細胞聚集、浸潤減少，從而達到減少鼻腔炎癥反應的作用，從而達到緩解AR發作的目的。本研究中，將復方木芙蓉涂鼻軟膏直接涂于病人鼻腔黏膜，藥物成分可被鼻腔黏膜快速吸收，直接作用于鼻腔黏膜肥大細胞等致敏細胞，改善細胞功能，在達到快速緩解癥狀的同時，減少藥物用量，避免不良反應發生。若將其涂抹于身體其他部位，其效果明顯不如涂抹于鼻腔黏膜處。本研究治療期間，觀察組所有病人未見鼻腔黏膜損傷或黏膜功能減退者，說明將復方木芙蓉涂鼻軟膏直接涂于病人鼻腔黏膜具有較高的安全性。而長期大量使用丙酸氟替卡松等激素類藥物則易導致聲嘶、鼻衄等多種不良反應。

通過篩選，共得到9個主要活性成分，其中槲皮素可抑制一氧化氮（NO）、前列腺素D2（PGD2）、環氧化酶-2（COX-2）的水平，并通過抑制核因子κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路發揮抗炎作用［16］；山柰酚能夠有效降低煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶-4（NOX4）、吞噬細胞NADPH氧化酶的一個亞單位p67phox蛋白的表達量，從而發揮抗氧化作用［17］。胡蘿卜甙功能廣泛，具有良好的抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用［18］。2，3，6-O-三沒食子酰甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷、6-O-雙沒食子酰甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷、2，3，8-三鄰甲基鞣花酸是地榆中糖苷類成分，有研究表明，有研究發現地榆中的抗炎活性物質是糖苷類化合物，能顯著降低IL-1β水平，升高IL-10水平，且明顯下調NFκB蛋白活性，具有明顯的抗炎效果［19-20］。

變應性鼻炎是變應原進入人體后，經巨噬細胞等抗原呈遞細胞處理后，產生IgE抗體，附著于肥大細胞等的細胞膜上，因而使鼻黏膜致敏。當變應原再次進入人體時，與IgE結合，使肥大細胞膜變構，釋放出大量生物活性介質如組胺、白三烯、嗜酸性粒細胞趨化因子、血小板活化因子、TNF-α、IL-4，IL-6及IL-12等［21］。本研究治療后，觀察組的總有效率明顯高于對照組，說明復方木芙蓉涂鼻軟膏治療變應性鼻炎可有效改善病人臨床癥狀。丙酸氟替卡松可經抑制白細胞、巨噬細胞等釋放細胞因子，發揮抗過敏、抗炎作用，達到緩解臨床癥狀的目的。與丙酸氟替卡松治療變應性鼻炎相比較，復方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR機制更加復雜。網絡藥理學研究表明，復方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR可能是通過PTGS2、IL-6、MAPK1、VEGFA等關鍵靶點發揮作用，其中PTGS2與炎癥和有絲分裂發生相關的前列腺素生物合成有關，MAPK蛋白激酶調控著炎癥反應等多種重要的細胞生理∕病理過程，其中P38MAPK∕NF-κB通路是經典的炎癥免疫通路，是一種重要的炎癥調控因子［22-23］。復方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR可能參與調控AGE-RAGE、TNF、IL-17炎性因子通路等多條通路信號，通過控制其中炎性因子的釋放、激素的水平、Th1∕Th2平衡來對AR起治療作用。本研究的臨床研究也證實，復方木芙蓉涂鼻軟膏可降低AR病人TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12炎性因子水平，從而改善其癥狀。本研究因治療時間相對較短，所得結果可能存在一定偏差。

綜上所述，采用網絡藥理學結合臨床研究，初步闡明了復方木芙蓉涂鼻軟膏治療AR的作用機制，可能是通過作用于PTGS2、IL-6、MAPK1等靶點參與調控AGE-RAGE、TNF、IL-17等信號通路，發揮控制炎癥的作用，從而控制AR的發生，此為后續復方木芙蓉涂鼻軟的藥理機制分析和實驗驗證提供了理論支撐。

（本文圖1～6見插圖1-7）