利拉魯肽通過調控自噬和Na+，K+-ATPase活性抑制高糖誘導的心肌細胞肥大

張 哲，野戰鷹，王 杏，楊林泉，馬慧娟

(河北省人民醫院 1. 代謝病重點實驗室、2. 神經外三科，河北 石家莊 050051)

近年來，糖尿病患病率持續增高，預計截至2030年全球范圍內糖尿病患病人數將達到3億，而心血管并發癥是糖尿病患者致死和致殘的主要原因。心室重構是糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的重要病理機制，而心肌肥厚是心室重構的起始階段，持續的心肌肥厚進一步加重心臟收縮和/或舒張功能障礙，最終發展為心力衰竭[1]。因此，探索逆轉心肌肥厚的新靶點對于延緩DCM進展，降低心力衰竭致死率具有重要臨床意義。

自噬是真核生物細胞內的一種自我保護機制，可通過溶酶體降解途徑清除受損的細胞器、錯誤折疊的蛋白、應激產物等，在維持細胞穩態、促進能量再生方面發揮重要作用。自噬障礙與代謝性疾病發病密切相關，如肥胖、胰島素抵抗、糖尿病、動脈粥樣硬化等。近來研究發現，在多種心肌肥厚模型中均存在自噬缺陷，而增強AMPK/mTOR通路介導的自噬可逆轉心肌肥厚，提示調控自噬活性有可能成為減輕心肌肥厚的潛在策略[2-3]。

Na+，K+-ATPase(NKA)是哺乳動物細胞膜上普遍存在的一種跨膜蛋白，在維持離子平衡、靜息電位及肌細胞興奮性方面發揮重要調控作用。已證實NKA活性下降可引起細胞內Na+、Ca2+積聚，從而促進肥厚相關基因的表達，導致心肌肥厚發生，而上調NKA活性能夠抑制心肌肥厚[4]。新近研究表明，自噬與NKA之間存在相關性，激活自噬可通過調控NKA活性影響疾病發生發展。Singh等[5]報道，自噬誘導劑雷帕霉素可減輕氧化應激損傷并上調NKA活性，從而延緩神經退行性變進程。Liu等[6]也提示，激活自噬可減輕缺血/再灌注所致腎損傷，并顯著提高NKA等Na+轉運體活性；利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)或敲除自噬標志基因Atg5能夠阻斷這一作用。但是，自噬能否通過調控NKA抑制糖尿病心肌肥厚仍未可知。

利拉魯肽(liraglutide，LRG)是一種新型降糖藥，可通過抗炎、抗氧化、抗凋亡等機制發揮心血管保護作用。本課題組前期研究表明，LRG可調控Sirt1/AMPK通路減輕DCM大鼠心肌損傷[7]。本研究建立高糖誘導的H9c2心肌細胞肥大模型，探討LRG對心肌細胞肥大的保護作用及其與自噬、NKA間的關系，并進一步闡明其分子機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑大鼠心肌H9c2細胞株，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。LRG(國藥準字J20160037)，諾和諾德；羅丹明標記鬼筆環肽(CA1610)、單丹磺胺戊二胺(MDC)試劑盒(G0170)，索萊寶；FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(U8918)，天根；Na+，K+-ATPase(NKA)測定試劑盒(A070-2-2)，建成；ANP(sc-515701)，Santa Cruz；β-MHC(ab207926)、Beclin-1(ab62557)、NKA α1(ab7671)、NKA α2(ab166888)，Abcam；LC3(CST4108)、p62(CST5114)、Sirt1(CST8469)、AMPK(CST2532)、p-AMPK(CST2535)、mTOR(CST5536)、p-mTOR(CST2983)，Cell Signaling Technology；3-MA(T1879)，Targetmol；EX 527(S1541)、Compound C(CC，S7840)，Selleck。

1.2 儀器HERA cell-150i二氧化碳培養箱、ND-2000紫外分光光度計，Thermo Fisher Scientific；AXOVERT25C倒置顯微鏡，Zeiss；DMI3000B熒光顯微鏡，Leica；Fresco17冷凍高速離心機，Thermo；7500實時熒光定量PCR儀，ABI；JY300HE電泳儀，君意；MiniChemi 610 Plus凝膠成像系統，賽智。

1.3 細胞培養及分組H9c2細胞在含10%胎牛血清的DMEM-F12培養基中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞達80%融合時收集細胞進行實驗。細胞分為對照(CON)組(5.5 mmol·L-1葡萄糖處理細胞48 h)、高糖(HG)組(33.3 mmol·L-1葡萄糖處理細胞48 h)、低、中、高劑量LRG(LRG-L、LRG-M、LRG-H)組(分別用25、50、100 nmol·L-1LRG和33.3 mmol·L-1葡萄糖共同處理細胞48 h)、LRG-H+自噬抑制劑3-MA組(1 mmol·L-13-MA作用細胞24 h后，用100 nmol·L-1LRG和33.3 mmol·L-1葡萄糖共同處理細胞48 h)、LRG-H+Sirt1抑制劑EX 527組(200 nmol·L-1EX 527作用細胞24 h后，用100 nmol·L-1LRG和33.3 mmol·L-1葡萄糖共同處理細胞48 h)、LRG-H+AMPK抑制劑CC組(20 μmol·L-1CC作用細胞24 h后，用100 nmol·L-1LRG和33.3 mmol·L-1葡萄糖共同處理細胞48 h)。

1.4 鬼筆環肽染色細胞接種于24孔板，待細胞生長至50%時，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS清洗2次，0.5% Triton X-100透化處理5 min，PBS清洗2次，加入終濃度為200 nmol·L-1的鬼筆環肽染料，室溫避光孵育30 min，DAPI染核5 min，熒光顯微鏡觀察心肌細胞骨架微絲，拍照。每組隨機選取50個細胞，ImageJ測定細胞表面積。

1.5 NKA活性測定細胞接種于6孔板，待細胞生長至80%～90%時，收集各組細胞至離心管中，制備細胞勻漿，20 000×g離心30 min，棄上清液，分離肌膜成分，按照試劑盒說明書檢測細胞膜NKA活性。

1.6 MDC染色細胞接種于24孔板，待細胞生長至50%時，棄去培養基，Wash buffer清洗2次，每孔加入MDC染液100 μL，室溫避光孵育45 min，棄去染液，Wash buffer清洗2次，熒光顯微鏡觀察自噬囊泡，計數并拍照，計算陽性細胞比例。

1.7 Real time PCRTRIzol提取心肌細胞總RNA，用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。NKA α1引物，F：5′-GCTGTCGTCATCATAACTGGC-3′，R：5′-GCTCATCTTCTCTCCATTTCG-3′；NKA α2引物，F：5′-TCATCGGCATCATCGTAGC-3′，R：5′-CGTCAGGCACACAGTAACAGT-3′；GAPDH引物，F：5′-TGAACGGGAAGCTCACTG-3′，R：5′-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3′。在實時熒光定量PCR儀上進行擴增反應，2-ΔΔCt法分析NKA α1、NKA α2 mRNA相對表達量。

1.8 Western blot提取各組細胞總蛋白，BCA法定量后進行SDS-PAGE電泳，將目的蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入特異性一抗(ANP 1 ∶600，β-MHC 1 ∶600，NKA α1 1 ∶1 000，NKA α2 1 ∶1 000，Beclin-1 1 ∶500，LC3 1 ∶1 000，p62 1 ∶1 000，Sirt1 1 ∶1 000，AMPK 1 ∶1 000，p-AMPK 1 ∶1 000，mTOR 1 ∶1 000，p-mTOR 1 ∶1 000)，4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的IgG(1 ∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h，ECL顯影劑顯色后用ImageJ進行灰度分析。

2 結果

2.1 LRG對高糖誘導的心肌細胞肥大的影響鬼筆環肽染色顯示(Fig 1A)：與CON組相比，HG組細胞表面積明顯增加(P<0.01)，不同劑量LRG干預后細胞表面積較HG組明顯降低(P<0.01)，而自噬抑制劑3-MA可部分拮抗LRG的作用(P<0.01)。Western blot顯示(Fig 1B)：與CON組相比，HG組ANP、β-MHC蛋白表達明顯增加(P<0.01)，不同劑量LRG干預后ANP、β-MHC蛋白表達較HG組明顯降低(P<0.01)，而自噬抑制劑3-MA可部分拮抗LRG的作用(P<0.01)。

Fig 1 Effects of LRG on HG-induced cardiomyocyte hypertrophy

2.2 LRG對高糖誘導的心肌細胞NKA活性和NKA α亞基表達的影響NKA活性測定顯示(Fig 2A)：與CON組相比，HG組NKA活性明顯降低(P<0.01)，不同劑量LRG干預后NKA活性較HG組明顯增加(P<0.05或P<0.01)，而自噬抑制劑3-MA可部分拮抗LRG的作用(P<0.01)。文獻報道，NKA最小功能單位為αβ異源二聚體，其中α亞基是NKA的催化亞基，包括α1～α4四種亞型，嚙齒類動物心肌僅表達NKA α1、α2，本研究進一步檢測NKA α1、α2表達情況。Real time PCR和Western blot顯示(Fig 2B-C)：各組NKA α2 mRNA和蛋白表達變化趨勢與NKA活性測定結果一致，而NKA α1 mRNA和蛋白表達相比無統計學差異(P>0.05)。

2.3 LRG對高糖誘導的心肌細胞自噬的影響MDC染色顯示(Fig 3A)：與CON組相比，HG組自噬囊泡數量明顯降低(P<0.01)，不同劑量LRG干預后自噬囊泡數量較HG組明顯增加(P<0.01)，而自噬抑制劑3-MA可部分拮抗LRG的作用(P<0.01)。Western blot顯示(Fig 3B)：與CON組相比，HG組Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達明顯降低，p62蛋白表達明顯增加(P<0.01)，不同劑量LRG干預后，Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達較HG組明顯增加，p62蛋白表達較HG組明顯降低(P<0.05或P<0.01)，而自噬抑制劑3-MA可部分拮抗LRG的作用(P<0.01)。

2.4 阻斷Sirt1/AMPK/mTOR信號通路逆轉LRG對高糖誘導的心肌細胞肥大的抑制作用鬼筆環肽染色顯示(Fig 4A)：與CON組相比，HG組細胞表面積明顯增加(P<0.01)，高劑量LRG干預后細胞表面積較HG組明顯降低(P<0.01)，而Sirt1抑制劑EX 527、AMPK抑制劑CC可部分拮抗LRG的作用(P<0.01)。同時，Western blot也證實(Fig 4B)：Sirt1抑制劑EX 527、AMPK抑制劑CC可減弱高劑量LRG下調ANP、β-MHC蛋白表達的作用(P<0.01)。

Fig 2 Effects of LRG on NKA activity and NKA αexpression in HG-induced H9c2 cells

Fig 3 Effects of LRG on autophagy in HG-induced H9c2 cells

Fig 4 Inhibition of Sirt1 or AMPK reversed LRG-mediated cardioprotective effect in HG-exposed H9c2 cells

2.5 阻斷Sirt1/AMPK/mTOR信號通路逆轉LRG對高糖誘導的心肌細胞NKA活性和NKA α2亞基表達的上調作用NKA活性測定顯示(Fig 5A)：與CON組相比，HG組NKA活性明顯降低(P<0.01)，高劑量LRG干預后NKA活性較HG組明顯增加(P<0.01)，而Sirt1抑制劑EX 527、AMPK抑制劑CC可部分拮抗LRG的作用(P<0.01)。同時,Real time PCR和Western blot也證實(Fig 5B-C)：Sirt1抑制劑EX 527、AMPK抑制劑CC可減弱高劑量LRG上調NKA α2 mRNA和蛋白表達的作用(P<0.01)。

Fig 5 Inhibition of Sirt1 or AMPK reversed LRG-mediated increase of NKA activity and up-regulation of NKA α2 in HG-exposed H9c2 cells

2.6 阻斷Sirt1/AMPK/mTOR信號通路逆轉LRG對高糖誘導的心肌細胞自噬的上調作用MDC染色顯示(Fig 6A)：與CON組相比，HG組自噬囊泡數量明顯降低(P<0.01)，高劑量LRG干預后自噬囊泡數量較HG組明顯增加(P<0.01)，而Sirt1抑制劑EX 527、AMPK抑制劑CC可部分拮抗LRG的作用(P<0.01)。同時Western blot也證實(Fig 6B)：Sirt1抑制劑EX 527、AMPK抑制劑CC可減弱高劑量LRG上調Sirt1、p-AMPK/AMPK、Beclin-1蛋白表達及下調p-mTOR/mTOR蛋白表達的作用(P<0.01)。

Fig 6 Inhibition of Sirt1 or AMPK reversed LRG-mediated activation of Sirt1/AMPK/mTOR signaling and autophagy in HG-exposed H9c2 cells

3 討論

2型糖尿病是以血糖異常升高為特征的慢性代謝性疾病，持續的高血糖被認為是導致DCM、糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變等慢性并發癥的獨立危險因素。LRG是一種新型胰高血糖素樣肽1類似物，因其良好的降糖效果被廣泛應用于2型糖尿病的臨床治療中，且對多種心血管疾病具有顯著保護作用，如高血壓、動脈粥樣硬化、心力衰竭等。但LRG對糖尿病心肌肥厚的作用及機制報道尚少。既往研究發現，高濃度葡萄糖刺激下H9c2心肌細胞，具有與原代培養的胎鼠心肌細胞相似的肥厚性反應，表現為肥大標志基因(ANP、β-MHC、CTGF等)mRNA表達快速上調。本研究中，我們采用33.3 mmol·L-1葡萄糖作用于H9c2細胞48 h，觀察到細胞表面積顯著增加，同時ANP、β-MHC蛋白表達顯著上調，證實糖尿病心肌肥厚模型構建成功；LRG干預能夠抑制心肌細胞肥大，提示LRG可能成為治療該病的有效藥物。

大量研究顯示，NKA是細胞排出Na+的唯一途徑，其活性降低造成細胞內Na+積聚，繼而通過促進Na+/Ca2+交換體(NCX)反向轉運模式導致細胞內Ca2+濃度增加。持續升高的細胞內Ca2+是誘導心肌細胞肥厚性生長的重要病理機制，并導致心功能障礙和心力衰竭進一步加重[8]。本研究表明，高糖處理后心肌細胞NKA活性、NKA α2 mRNA和蛋白表達降低；給予LRG干預后，NKA活性、NKA α2 mRNA和蛋白表達得以升高。可見，LRG對糖尿病心肌肥厚的治療機制與促進NKA活性恢復及上調NKA α2表達有關。同時，Real time-PCR和Western blot檢測到NKA α1 mRNA和蛋白表達在各組間均無統計學差異，說明糖尿病心肌肥厚發生發展并不涉及NKA α1變化。我們分析NKA α1、α2在心肌肥厚中的不同作用與其在心肌細胞膜的分布不同有關。多項研究表明，α1廣泛表達在表面肌膜，可將細胞內Na+維持在整體較低的水平，在調控離子穩態方面發揮“管家作用”；而α2與NCX、L型Ca2+通道均集中表達在橫小管，且α2對其內源性抑制劑強心苷的親和力較α1高4倍，因此局部Na+水平升高即可通過調控毗鄰的NCX和內質網Ca2+通道引起Ca2+的大量釋放，可見α2在調控心肌收縮力方面發揮關鍵作用[9-10]。已證實NKA α2表達下調是異丙腎上腺素導致的心肌細胞NKA活性降低和心肌肥厚的重要因素[11]。在心肌梗死小鼠模型中，特異性過表達NKA α2的轉基因小鼠心肌細胞Ca2+瞬變幅度較WT小鼠顯著降低，可逆轉心室重構，并阻止心功能惡化[12]。因此，LRG可能通過上調NKA α2表達增強NKA活性，從而逆轉高糖誘導的心肌肥厚。

目前，自噬在心肌肥厚中的作用仍存在爭議。有學者認為，增強自噬活性可能通過增加ATP合成、降解錯誤折疊的蛋白逆轉心肌肥厚，延緩心力衰竭進程。然而，過度自噬可能促進細胞凋亡加重心室重構，采用自噬抑制劑3-MA或siRNA干擾技術下調自噬相關基因表達后，心肌肥厚得以明顯減輕[13]。本研究結果顯示，高糖誘導心肌細胞自噬缺陷，LRG干預通過調控自噬相關基因表達增強自噬水平，提示LRG的心臟保護作用可能是通過調控自噬實現的。我們推測，自噬在心肌肥厚中發揮保護性作用還是有害作用與心室重構的不同階段、造模方法及涉及的信號通路有關。

Sirt1/AMPK通路在調控炎癥、凋亡、自噬、能量代謝及心臟保護性蛋白表達方面發揮重要作用。Li等[14]研究發現，Sirt1/AMPK通路活化后能夠發揮抗凋亡、抗氧化作用，減輕血管緊張素II(Ang II)誘導的心肌肥厚和心功能障礙。值得注意的是，過表達Sirt1或應用AMPK激動劑AICAR可逆轉晚期糖基化終產物誘導的心肌細胞NKA活性降低，提示Sirt1/AMPK通路可調控NKA活性[15]。本研究發現，給予特異性Sirt1抑制劑EX 527、AMPK抑制劑CC后，LRG對NKA活性、NKA α2 mRNA和蛋白表達的上調作用及心肌肥大的保護作用被阻斷了，同時伴有自噬囊泡數量減少及自噬標志基因Beclin-1表達下調，提示LRG可能通過激活Sirt1/AMPK/mTOR自噬信號促進NKA活性恢復，從而逆轉高糖誘導的心肌細胞肥大。然而，關于心肌細胞中自噬信號通路調控NKA分子機制的研究尚少。目前已有研究指出NKA和AMPK之間存在直接聯系。Xiong等[16]研究發現，靶向NKA胞外結構域的抗體DR-Ab通過上調NKA活性減輕Ang II誘導的心肌肥厚，該細胞保護作用涉及AMPK信號通路的活化。Pirkmajer等[17-18]在骨骼肌細胞、腎小管細胞中也證實，AMPK的持續活化促使NKA去磷酸化，從而抑制NKA的內吞并保護其免遭溶酶體降解。此外，糖尿病狀態下線粒體產生的自由基(ROS)可引起NKA結構改變和氧化損傷，從而影響線粒體氧化磷酸化并降低細胞內ATP的合成，這是導致NKA活性降低的重要因素。增強自噬活性能夠直接清除功能異常的線粒體和ROS，同時使細胞內ATP含量增加，從而促進NKA活性恢復。以上研究提示，自噬信號通路可能通過多種途徑調控NKA。

綜上，本研究表明，LRG能夠抑制高糖誘導的心肌細胞肥大，其機制可能與調控Sirt1/AMPK/mTOR自噬信號增強NKA活性有關。本研究證實了LRG的體外抗肥大作用，也為將自噬信號介導的NKA調控作為防治DCM的分子靶點提供了實驗依據。不足之處在于，本研究尚未開展在體實驗進一步驗證此結論。今后我們將利用DCM動物模型進行相關研究，旨在探索和完善LRG的心臟保護作用及機制。