酸性鞘磷脂酶對非酒精性脂肪肝病的作用及PPARα-PGC-1α通路的影響

方偉進，樊志強，龔 慧，劉瑞嬌，宋立瑩，王春江，劉世坤

(中南大學湘雅三醫院 1.藥學部、2.臨床藥理中心，湖南 長沙 410013)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease ，NAFLD)在成年人群中的發病率達30%，在肥胖和糖尿病人群中達70%～80%[1]。NAFLD的病理過程可從初期的肝內脂肪堆積延續至非酒精性脂肪性肝炎，此時，可觀察到明顯的肝細胞炎癥和死亡，進而肝纖維化、肝硬化及肝細胞癌，其中肝纖維化在決定患者預后方面起重要作用。

肝臟是體內合成脂質的重要組織，不管是血漿中非酯化的游離脂肪酸，還是從頭合成的脂肪酸均可在肝臟中用于脂質合成。肝內過量的脂質堆積開啟了NAFLD進程。各種病理和生理因素導致肝臟脂肪酸氧化或脂質輸出能力較低，或合成能力增強，均造成脂質在肝臟中過度堆積，進而誘導肝細胞氧化應激和炎癥等。過氧化物酶體增殖體受體α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα)是調控脂質代謝的重要轉錄因子，它和其輔激活因子PGC-1α共同參與脂肪酸攝取、轉運、β氧化、脂質合成、酮體生成和脂蛋白與膽固醇代謝等過程。大量研究報道，NAFLD小鼠肝臟中PPARα及其下游靶基因肉毒堿棕櫚酰轉移酶(carnitine palmitoyltransferase1，CPT1)、脂肪酸結合蛋白(fatty acid-binding protein，FABP1)等蛋白表達和活性明顯降低[2]，激動PPARα可減少氧化應激以及白細胞介素-6 (interleukin- 6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α)等炎癥因子釋放，甚至增加脂質自噬(lipophagy)以減少肝臟脂肪堆積，改善NAFLD[3]。PGC-1α也可以通過調控ROS生成，激活PPARα和PPARγ，以保護肝臟免受缺血/再灌注損傷[4]。最新研究發現，溶酶體可調控PPARα，并在脂質代謝以及NAFLD發生發展中起調控作用[5]。使用PPARα激動劑非諾貝特促進溶酶體生物合成調控因子轉錄因子EB(TFEB)表達，誘導自噬，減少肝臟脂肪堆積[6]。在AML12肝細胞使用溶酶體抑制劑或敲除TFEB可明顯抑制過氧化物酶體的合成，特別是抑制PPARα及其輔激活因子PGC-1α的蛋白表達，其下游靶點酰基輔酶A氧化酶1(acox1) 和Cpt1a的基因轉錄和蛋白表達也明顯降低[7]。但溶酶體調控PPARα介導NAFLD的具體機制尚不清楚。

酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase，ASMase)是一種廣泛存在的細胞溶酶體酶，可水解細胞膜的鞘磷脂(sphingomyelin，SM)生成磷酸膽堿和神經酰胺，形成富含神經酰胺的脂筏介導信號轉導。大量研究已證實，ASMase參與血栓形成、細胞死亡、血管鈣化平滑肌增殖等多種病理過程，并與NAFLD[8]、糖尿病、心肌梗死等密切相關，但ASMase介導NAFLD的機制尚不清楚。因此，本研究擬在動物實驗中觀察ASMase是否通過調控PPARα相關通路以促進NAFLD發生發展，這對明確NAFLD發病機制及治療靶點具體有重要意義。

1 材料與方法

1.1 動物構建基于C57BL/6背景的ASMaseKO小鼠，許可證號：SCXK(蘇)2018-0003。為了擴大種群將獲得的ASMaseKO小鼠與購自中南大學實驗動物中心的野生型(wild type，WT)，許可證號：SCXK(湘)2019-0004小鼠進行雜交，獲得封閉群，經基因測序后，雜合子(ASMase+/-)以及WT小鼠用于制備本實驗NAFLD模型。保障飼料和飲水供應，飼養溫度恒定為25 ℃，相對濕度為50%左右，實驗過程中關于動物的使用符合中南大學動物倫理委員會的相關規定。

1.2 主要試劑和儀器兔抗鼠ASMase(#3687)、PGC-1α(#2178)、CPT1A (#97361)和GAPDH(#5174)多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology (CST)公司；兔抗鼠PPARα(#ab215270)多克隆抗體購自美國Abcam公司；谷氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT，#C009-3-1)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST，C010-3-1)，血清和肝臟組織中甘油三酯(TG，#A110-2-1)、總膽固醇(TC，#A111-2-1)、低密度脂蛋白(LDL-C，#A113-22-1)和高密度脂蛋白(HDL-C，#A112-2-1)等血脂相關試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液(#P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(#P0012S)、超敏ECL化學發光試劑盒(#P0018FM)，MnSOD活性檢測試劑盒(WST-8法，#S0103)，脂質氧化(MDA，#S0131S)檢測試劑盒及ATP檢測試劑盒(#S0026)均購自碧云天生物技術研究所；其余試劑均為國產分析純。OneTouch血糖儀購自強生(中國)醫療器材有限公司；Operetta高內涵成像系統購自美國Perkin Elmer公司；BIO-RAD 164-5050電泳儀、IMark酶標儀購自美國BIO-RAD公司；Axio生物顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1NAFLD模型制備及分組 從方法2.1動物中選取封閉群6～8周齡雄性雜合子和WT小鼠，共分為4組，分別是野生型正常飲食對照組(WT+Chow，n=3)：給予正?；A飼料飼養12周；野生型高脂飲食組(WT+HFD，n=3)：給予高脂飼料(豬油10%，蛋黃粉10%，膽固醇1%，膽酸鹽0.125%，基礎飼料79%，購自廣東省實驗動物中心)飼養12周；ASMase雜合子正常飲食組(ASMase+/-+Chow，n=6)：給予正?；A飼料飼養12周；ASMase雜合子高脂飲食組(ASMase+/-+HFD，n=6)：給予高脂飼料飼養12周；每周稱量體重，實驗結束后收集血清和肝臟組織進行生化測定以及病理檢測。

1.3.2肝功能以及血脂水平測定 根據已發表文獻[9]中的方法進行實驗。反映肝功能的指標ALT、AST和各組小鼠血脂含量包括總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)的測定均參照試劑盒的方法進行。采用固醇氧化酶-過氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法(CHOD-PAP法)檢測TC，采用甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法(GPO-PAP法)檢測TG，采用磷鎢酸鎂沉淀法(PTA-Mg2+)和聚乙烯硫酸沉淀法(PVS法)檢測LDL，直接法-選擇抑制法檢測HDL-C。

1.3.3肝臟脂質含量測定 取各組小鼠肝臟30 mg，依照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書檢測肝臟中TG、TC的含量。

1.3.4肝臟組織SOD活性和MDA含量測定 各組樣本經相應處理后，依據碧云天生物技術研究所提供的試劑盒檢測說明書檢測超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量。

1.3.5油紅染色、蘇木精-伊紅染色(HE)、Masson染色和天狼星紅染色 根據已發表文獻中的[9]方法進行實驗。從甲醛固定液中取出肝臟，先依次放入70%～95%等不同濃度梯度的乙醇中脫水，經二甲笨透明30 min后開始浸蠟、包埋，最后進行厚度3 μm切片。切片經脫蠟至水后，分別進行肝臟組織的油紅染色、HE染色、Masson染色和天狼星紅染色。肝臟病理組織學改變參照《非酒精性脂肪性肝病與相關代謝紊亂診療共識(第二版)》中推薦的美國國立衛生院NASH臨床研究網病理工作組指南常規進行的NAFLD活動度積分(NAS)評定和肝纖維化評分，其中脂肪變性(0～3分)、肝小葉炎癥(0～3分)，氣球樣變性(0～2分)，NAS 總分0～8分。同時采用ImageJ軟件計算油紅染色面積。

1.3.6ASMase活性測定 根據已發表文獻[10]中的方法進行實驗。采用AmplexTMRed Sphingomyelinase(Thermo Fisher Scientific，美國)試劑盒檢測ASMase活性；每組稱取50 mg肝組織，加入1 mL含50 mmol·L-1乙酸鈉(pH 5.0)的裂解液后進行勻漿，4 ℃，12 000 r·min-1離心30 min，留上清；各取100 μL上清液至96孔板中，以裂解液作為陰性對照，以0.4 kU·L-1鞘磷脂酶溶液作陽性對照。每孔加入10 μL 5 mmol·L-1的鞘磷脂溶液，37 ℃孵育1 h。按說明書制備并加入每孔100 μL工作液，避光孵育30 min后，用酶標儀在530-560 nm內激發，在590 nm處發射波長檢測熒光值。

1.3.7Western blot檢測肝臟組織蛋白表達 采用Western blot 檢測各組小鼠肝臟中蛋白表達情況；取小鼠肝臟組織各30 mg，剪碎，加入9倍體積RIPA裂解液，冰上機械勻漿，4 ℃離心12 000 r·min-1，10 min，取上清測蛋白含量；每個樣本取30 μg蛋白，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，電轉至聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4 °C搖晃過夜，加辣根過氧化酶(HRP)標記二抗室溫孵育2 h，最后進行ECL化學發光法顯色，經凝膠成像系統(Chemi DocTMXRS+system，Bio-RAD)掃描后進行圖像數據分析。

2 結果

2.1 ASMase+/-小鼠肝臟中ASMase活性明顯降低ASMase雜合子(ASMase+/-)小鼠的基因測序結果及野生型對照如Fig 1A所示。為進一步觀察高脂飲食的作用，檢測了各組小鼠ASMase蛋白表達及活性的變化情況，結果如Fig 1B～D所示，高脂飼養12周明顯增加野生型小鼠肝臟中ASMase蛋白表達和活性(Fig 1B,C，P<0.01)。有趣的是，ASMase+/-+Chow組小鼠肝臟ASMase蛋白表達較WT+Chow組明顯增加(P=0.023)；ASMase+/-+HFD組小鼠肝臟蛋白表達較WT+HFD組小鼠明顯降低(P<0.01)。在活性變化方面，ASMase+/-+HFD和ASMase+/-+Chow組小鼠肝臟ASMase活性分別較WT+HFD和WT+Chow組明顯降低(Fig 1B，P<0.01)，這提示ASMase雜合子在正常飲食狀態下，肝臟中存在反饋機制增加ASMase蛋白表達，這種反饋機制在脂代謝紊亂時的影響降低，但是無論正常飲食或高脂飲食下，ASMase雜合子均降低肝臟中ASMase活性。

Tab 1 NAS score of mouse liver

2.2 ASMase對高脂飼養小鼠脂質代謝的影響肝臟內過度的脂質堆積是NAFLD的重要病理特征，也是導致疾病進展的重要病因。本研究觀察了高脂飼養以及ASMase雜合子對小鼠肝臟脂肪堆積以及全身脂質代謝的影響。結果如Fig 2所示，與WT+Chow比較，WT+HFD組小鼠血清中TG水平無明顯增加(Fig 2A)，但肝臟中TG含量明顯增加(Fig 2B，P<0.01)；ASMase+/-小鼠無論在正?；蚋咧曫B狀態下，對血清TG水平均無明顯影響；但明顯降低肝臟中TG含量(Fig 2B，P<0.01)。與TG不同的是，與WT+Chow比較，WT+HFD組小鼠血清TC水平明顯增加(Fig 2C，P<0.01)，但肝臟中TC水平無明顯變化。ASMase+/-小鼠對高脂狀態下升高的血清TC水平無影響。

為了確證上述結果，進一步采用油紅染色觀察了肝臟形態，發現高脂飼養小鼠肝臟中脂滴明顯增多，ASMase+/-小鼠呈現減少的脂滴數量(Fig 2G)。此外，本研究還觀察了血清中氧化還原相關指標，如SOD活性、MDA含量和GPx含量等，發現各組差異均無顯著性(Fig 2H～J)。以上結果提示高脂飼養12周可導致肝臟中甘油三酯堆積，首先誘發的是高膽固醇血癥；抑制ASMase活性一定程度降低高脂飼養誘導的肝臟脂肪堆積。

2.3 ASMase對高脂飼養小鼠肝功能及肝臟形態的影響肝功能異常和肝臟纖維化是中期NAFLD的重要病理表現，也是進行藥物干預的重要病理階段。因此，本部分實驗觀察了高脂飼養12周以及ASMase雜合子對小鼠肝功能和形態的影響。結果如Fig 3所示，與WT+Chow組比較，WT+HFD組小鼠ALT水平明顯升高(Fig 3A，P<0.05)，AST水平無明顯變化(Fig 3B)。相似地，與ASMase+/-+Chow組比較，ASMase+/-+HFD組小鼠ALT水平明顯升高(Fig 3A，P<0.05)，AST水平無明顯變化(Fig 3B)；這一結果提示，抑制ASMase活性不能降低高脂飼養12周誘導升高的谷丙轉氨酶。

隨后觀察了肝臟形態變化。HE染色結果顯示，WT+Chow小鼠肝細胞結構完整，肝小葉清晰，未見病理性組織變化，Masson和天狼星紅染色結果未顯示肝纖維化；WT+HFD小鼠肝細胞出現明顯的脂肪變性，空泡樣變明顯，Masson和天狼星紅染色結果顯示肝纖維化；ASMase+/-小鼠表現出較輕的肝臟脂肪變性，縮小肝內脂肪堆積導致的空泡體積，但使數量增多；肝纖維化程度減輕。根據以上指標進一步完成NAS評分發現，與WT+Chow組比較，WT+HFD組小鼠NAS評分明顯升高；ASMase+/-+HFD組小鼠肝臟的NAS評分較WT+HFD明顯降低。綜合以上結果，表明ASMase雜合子雖不能有效降低高脂飼養12周導致的肝酶升高，但一定程度減輕了高脂飼養導致的肝臟脂肪變性及結構損傷。

2.4 ASMase對NAFLD小鼠肝臟溶酶體的作用及對PPARα通路的影響CPT1是位于線粒體內膜的介導脂肪酸進入線粒體進行β氧化的限速酶，其表達上調可促進脂肪分解氧化，本研究檢測了各組小鼠肝臟中CPT1蛋白表達情況，結果如Fig 4所示，與WT+Chow組比較，WT+HFD組小鼠肝臟組織中CPT1蛋白表達無明顯變化(Fig 4A)；ASMase+/-小鼠，無論是正常飼養還是高脂飲食飼養狀態下，均可明顯增加CPT1蛋白表達，表明ASMase抑制了CPT1介導的脂肪酸由胞質向線粒體轉移以及后續的β氧化。為驗證這一過程是否影響線粒體生物合成，本研究進一步觀察了調控線粒體生物合成的重要因子PGC-1α表達變化，發現ASMase+/-小鼠肝臟中PGC-1α的蛋白表達明顯上調(Fig 4A，4C)。PGC-1α除了促進線粒體生物合成外，還是PPARα的輔激活因子，PPARα在脂肪酸攝取、轉運以及氧化代謝等過程中發揮重要作用，實驗結果顯示，高脂飼養12周對小鼠肝臟PPARα蛋白表達無明顯影響；而ASMase雜合子明顯提高PPARα蛋白表達(Fig 4A，4D)。以上結果提示，ASMase抑制脂肪酸氧化，并與線粒體功能以及PPARα-PGC-1α通路有關。

3 討論

本研究制備了高脂飼養的NAFLD小鼠模型，并在此基礎上觀察ASMase對NAFLD的作用。結果發現，高脂飼養12周小鼠出現肝功能異常、肝臟脂肪過度堆積、甚至肝纖維化；與此同時，小鼠肝臟ASMase蛋白表達和活性明顯增加，表明ASMase參與NAFLD的發生發展。ASMase雜合子小鼠雖然未明顯改善肝功能，但可減少脂肪在肝臟中堆積，并一定程度減輕肝纖維化，這一過程與改善線粒體攝取脂肪以及激活PPARα-PGC-1α通路有關。

本研究發現，高脂飼養12周使小鼠出現高膽固醇血癥，此時血清中甘油三酯水平無明顯變化。與此不同的是，高脂不僅導致小鼠肝臟中過度的膽固醇堆積，而且導致過度的肝臟甘油三酯堆積，這一發現與最近的一項研究結果相似，Heida等[11]發現，持續激活NF-κB明顯增加肝臟組織中脂肪的從頭合成(如棕櫚酸C16 ∶1、油酸C18 ∶1，是合成TG的重要脂肪酸)和膽固醇的生物合成，但反映在血清指標上，膽固醇的合成增加不僅導致肝臟中膽固醇堆積，還導致血清中膽固醇水平明顯升高，但脂質的從頭合成增加并未提升血清中甘油三酯水平。還有研究發現，在血清TG正常、高膽固醇血癥的母系小鼠子代更易患NAFLD及糖尿病[12]，并且這種易感性可能在發育早期就被誘導，這些研究提示了高膽固醇血癥與NAFLD之間的重要關系，但具體的分子機制還需更深入的研究。

Fig 3 Effects of ASMase on liver function and fibrosis in high-fat fed mice

油紅染色結果也確證了肝內脂質過量堆積，從切片中可以看出高脂組小鼠肝臟中脂滴明顯增多，且脂滴較大，基本覆蓋了所有肝細胞，提示明顯的脂肪性肝炎表現。此時反映肝功能的指標ALT水平明顯上升，形態學檢測也顯示高脂導致小鼠肝細胞出現明顯的脂肪變性、空泡樣變，以及肝纖維化。ASMase雜合子明顯降低了高脂飼養時升高的肝臟組織中TG含量。ASMase是SM的水解酶，SM作為細胞膜重要的組成部分，可與膽固醇結合成微結構域介導生理狀態下的信號轉導，ASMase水解SM，可能影響組織細胞中膽固醇的形式或水平；但ASMase對血清中膽固醇水平沒有影響，Koka等[13]也發現，敲除ASMase抑制炎癥小體激活可明顯改善由高膽固醇血癥誘導的動脈內皮增生增厚，但不能改善高脂小鼠的高膽固醇血癥，與本研究結果相一致。ASMase雜合子未能明顯改善肝功能，但是一定程度減輕了肝纖維化，盡管仍嚴重于正常對照組。結合觀察到的ASMase雜合子減輕了高脂飼養導致的小鼠肝臟脂肪變性，縮小肝內脂肪堆積導致的空泡體積，但使數量增多，提示ASMase敲除小鼠肝臟中脂肪動員可能開始啟動。

Fig 4 Effects of ASMase on liver lysosomes and PPARα pathway in NAFLD mice

正常情況下，肝臟中用于合成脂肪的底物60%以上來自脂肪細胞分解產生入血的游離脂肪酸。在NAFLD過程中，過度的脂肪堆積同樣由這些分別來自血漿中非酯化脂肪酸以及肝臟從頭合成并儲存在脂肪酸池中的脂肪酸為底物。脂質的從頭合成(denovolipogenesis，DNL)是導致NAFLD脂肪變性的重要因素，這個過程受諸如SERBP1、LXRα和SCD1等多種轉錄因子的調控[14]。然而，在研究中發現，盡管在高脂模型中抑制了脂質的從頭合成，肝內脂肪堆積仍然發生[15]，表明肝內脂質堆積除了受肝臟脂質合成代謝的影響，也受分解代謝的影響。PPARα是調控小鼠肝臟脂肪分解代謝的重要因子，肝臟中PPARα的表達與NASH患者中肝脂肪變性的程度呈負相關。ATGL敲除小鼠通過減少PPARα的DNA結合活性，促進蛋氨酸-膽堿缺乏(MCD)飲食介導的肝臟脂肪變性[16]，提示PPARα對NAFLD的發生發展有調控作用。但是，本研究未在高脂飼養的小鼠肝臟中觀察到明顯降低的PPARα蛋白表達，然而這并不意味著得到了與之前研究相反的結果，最近有研究證實，PPARα作為過氧化物酶體增殖體受體，其表達和活性受過氧化物酶體微環境的直接影響，過氧化物酶體極性在高脂環境下受到損害，并隨NAFLD進展而不斷降低，此時，PPARα蛋白中有6個氨基酸位點因過量的ONOO-和H2O2而被硝基化和氧化修飾，導致其活性降低，其蛋白表達可能不變[17]。但無論如何，PPARα介導NAFLD的作用不容置疑。盡管未觀察到野生型小鼠高脂狀態下肝臟中PPARα蛋白表達的變化，但ASMase雜合子小鼠增加了正常飲食和高脂飼養狀態下PPARα的蛋白表達，其輔激活因子及下游靶點PGC-1α也明顯上調，表明ASMase對PPARα通路具有調控作用，而PPARα可以調控肝臟脂質代謝的中心環節，可以調控FAT/CD36介導的脂肪轉運以及脂肪酸結合蛋白(L-FABP)表達，還調控β氧化限速酶，如ACOX1的表達。此外，位于線粒體內外膜的CPT-I 和 CPT-II也受PPARα的調控[18]，CPT-I在肝臟中高表達，作為脂肪酸進入線粒體進行β氧化的關鍵酶，直接影響脂肪分解代謝，本實驗發現，ASMase雜合子小鼠在高脂狀態下CPT-I的蛋白表達明顯增加，表明抑制ASMase促進了肝臟組織脂肪分解。

綜上所述，ASMase促進肝脂肪變性和肝纖維化。抑制ASMase活性可減少脂肪在肝臟中堆積，并一定程度減輕肝纖維化，這一過程與改善線粒體攝取脂肪以及激活PPARα-PGC-1α通路有關。