黃芩苷通過TLR4/MyD88/NF-κB通路抑制鏈脲佐菌素誘導的阿爾茨海默病大鼠模型神經炎癥反應

于文靜，楊 苗，賀春香，金怡杰，李 澤，李 平，鄧思思，成紹武，宋禎彥

(湖南中醫藥大學 中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208)

阿爾茨海默病(AD)是一種以進行性認知功能障礙、記憶功能減退、生活能力下降并伴有精神行為異常為主的神經退行性疾病。我國現有約1 000萬癡呆患者，隨著中國及全世界老齡化水平的增加，AD對全世界的經濟負擔將持續加重，據統計，到2030年將達到2.54萬億美元，到2050年將達到9.12萬億美元[1]。腦內的慢性炎癥是AD的重要標志，小膠質細胞作為腦內重要的免疫細胞被活化及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等促炎細胞因子被大量釋放，使神經細胞凋亡或死亡，最終導致AD相關的行為[2]。TLR4大量表達于小膠質細胞上，通過髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88，MyD88)銜接誘導核因子-κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)磷酸化和促炎細胞因子產生[3]。

目前證據表明，傳統的非甾體類抗炎藥雖然能在一定程度上減輕炎癥，延緩AD的進展，降低認知功能的損害，但是其胃腸道并發癥等副作用限制了長期作為臨床藥物使用的可能性，副作用小、性能更安全的天然產品作為AD患者的臨床長期用藥是更好的選擇，大量研究證明，天然產品對于緩解AD腦內神經炎癥發揮著重要作用[4]。黃芩作為傳統中藥之一，有清熱燥濕、瀉火解毒之效，研究表明，黃芩及莖葉具有抗神經炎癥、抗氧化應激、緩解興奮性神經毒性及抑制神經細胞凋亡的作用，可能對AD的治療有效。黃芩苷是從黃芩中提取出來的一種黃酮類化合物，已被證明具有抗炎和神經保護作用[5]。課題組前期研究表明，黃芩苷可以通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減輕脂多糖/干擾素γ誘導的BV2細胞的炎癥反應[6]，但是，黃芩苷是否對動物模型有作用還尚不明確。本實驗采用大鼠側腦室注射STZ構建AD大鼠模型，從TLR4/MyD88/NF-κB信號通路探討黃芩苷對AD大鼠腦內炎癥反應的作用及神經保護機制。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級SD ♂大鼠50只，體質量(150±20)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2019-0004，大鼠飼養在湖南中醫藥大學動物實驗中心SPF級動物屏障系統中，分籠喂養(每籠3只)，使用標準動物飼料和水喂養，恒溫(25±2)℃，室內明暗周期設置為12 h一循環，實驗過程均符合動物倫理學要求(LLBH202105100001)。

1.2 藥物與試劑黃芩苷(110715，中國食品藥品檢定研究院)；STZ、米諾環素、山羊抗兔二抗(S0130、H1928056、AP132P，美國Sigma-Aldrich)；β-actin、IL-1β、IL-6、TNF-α引物由上海生工生物工程有限公司合成；TRIzol Reagent(15596018，美國Thermo Fisher Scientific)；逆轉錄試劑盒(0521751，蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司)；SYBR Green預混液(MQ00401，上海莫納生物)；NF-κB p65/RelA和phospho-NF-κB p65/RelA-s276抗體(A2547和AP0123，武漢ABclonal)；β-actin(AF7018，中國Affinity Biosciences)；TLR4抗體(D220102，生工生物工程(上海)股份有限公司)；MyD88抗體(AH10163311，北京Bioss公司)；Histone H3抗體(#4499，Cell Signaling Technology)；Iba1抗體(011-27991，日本WAKO和光純藥株式會社)；細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒和PMSF(100 mmol·L-1)(P0027和ST506，碧云天生物科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(cw2333s，北京康為世紀生物科技有限公司)；BCA試劑盒(A00445，杭州聯科生物科技股份有限公司)；TritonX-100和抗熒光衰減封片劑(含DAPI)(T8200和S2110，北京索萊寶)；Donkey anti-Goat IgG(H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody、Alexa Fluor 647(A32849，美國Invitrogen)；通用二步法檢測試劑盒(小鼠/兔增強聚合物法檢測系統)(PV-9000，北京中杉金橋)。

1.3 儀器石蠟切片機(Thermo Fisher，美國)；AI+共聚焦激光顯微鏡(Nikon，日本)；TissueFAXS Plus全景組織掃描成像系統(Tissue Gnostics GmbH，奧地利)；SorvallTMLegendTMMicro 17R微量離心機(Thermo Fisher，美國)；Cytation3型多功能酶標儀(Bio-Tek，美國)；T100TMThermal Cycler型實時熒光定量聚合酶鏈式反應擴增儀、Mini-PROTEAN Tetra型電泳槽、Mini Trans-Blot型轉印槽、Gel Doc XR+凝膠成像系統(Bio-Rad，美國)。

2 方法

2.1 STZ側腦室注射構建AD大鼠模型將21.6 mg STZ溶于300 μL檸檬酸緩沖液中配置成72 μg·μL-1的注射液。SD大鼠禁食12 h后造模，麻醉給予3%戊巴比妥鈉，大鼠頭部固定于腦固定裝置，以《大鼠腦立體定位圖譜》的第六版作為參照，以前囟為基準，距離前囟向后0.8 mm；距顱骨正中線左右各1.5 mm；距顱骨表面進針3.7 mm，往除假手術組外大鼠雙側側腦室各注5 μL STZ(2.4 mg·kg-1)[7]，假手術組注射5 μL生理鹽水，控制速度1 μL·min-1，結束后留針5 min。緩慢出針，傷口及時止血并涂碘伏，最后對傷口手術縫合，將動物放回飼養籠觀察，等待自然蘇醒。

2.2 分組與黃芩苷干預適應性飼養1周后，將50只大鼠隨機分為假手術組、模型組、黃芩苷干預低劑量組(60 mg-1·kg-1·d-1)、高劑量組(120 mg-1·kg-1·d-1)[2]、米諾環素組(36 mg-1·kg-1·d-1)[8]5組。造模2 d后,進行藥物干預治療14 d，每天給藥分為2次，固定時間在早晨9點和晚6點，藥物干預組按上述劑量灌胃，其余兩組以等體積生理鹽水灌胃。

2.3 Morris水迷宮實驗藥物干預14 d后，進行水迷宮實驗，用Smart 3.0軟件記錄大鼠的行動軌跡及時間路程數據。(1)定位航行實驗：實驗前5 d，每天固定時間，從4個象限分別將大鼠放進水池中，頭面向筒壁，軟件設置大鼠尋找平臺時間(逃避潛伏期)為1 min。若1 min內爬上平臺且停留>2 s，測試結束，記錄所需時間；若未爬上平臺，則逃避潛伏期記錄時間60 s，然后需由實驗者將大鼠引導至平臺，停留10 s左右進行學習記憶。(2)空間探索實驗：實驗d 6取出平臺，再從4個象限位置將大鼠放入水池，記錄60 s內大鼠穿梭原平臺區域的次數及在第一象限即平臺象限停留的時間。

2.4 取材及保存行為學測試結束，麻醉大鼠給予3%戊巴比妥鈉，固定大鼠四肢暴露腹部，消毒并打開腹腔，注射器吸取提前預冷生理鹽水，左心室進針，剪右心耳行心臟灌注，至內臟發白，斷頭取腦。提前準備冰盒放置取出的腦組織，分離左腦保存固定在4%多聚甲醛中，右腦海馬放入凍存管置于液氮中速凍，后放入-80 ℃冰箱保存。

2.5 免疫熒光檢測NF-κB核轉移情況和小膠質細胞活化情況石蠟切片，于65 ℃烘烤1 h，脫蠟后，3% H2O2滅活10 min后，使用0.3% Triton X-100(PBS配制)透膜5 min，然后5%正常驢血清封閉1 h，分別使用NF-κB p65(1 ∶200)、Iba1(1 ∶50)4 ℃孵育過夜，次日熒光二抗Alexa Fluor 647(紅色，1 ∶500)避光室溫1.5 h，PBS洗3次，每次10 min，最后滴加抗熒光淬滅劑(含DAPI)，加蓋蓋玻片，使用全景組織掃描成像系統分析。

2.6 PCR法檢測細胞表型標志物和炎性因子表達取一半海馬組織，加入1 mL TRIzol研磨，加入氯仿200 μL，離心取上清加入500 μL異丙醇，離心棄上清加75%乙醇1 mL，離心晾干乙醇，加DEPC水50 μL溶解RNA，測定RNA濃度，計算調整RNA量為每20 μL體系1 μg，逆轉錄成cDNA，采用SYBR染料法使用Bio-Red CFX96 real-time PCR儀進行擴增檢測。PCR擴增體系為20 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL；程序：95 ℃ 5 min，1循環；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，40循環；采用2-ΔΔCt法分析各目的基因的mRNA相對表達水平，引物序列見Tab 1。

2.7 Western blot法檢測TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關蛋白的表達另一半海馬組織破碎儀破碎后取一部分加入RIPA裂解液(內含磷酸蛋白酶抑制劑)，離心，上清即為海馬細胞總蛋白；另一部分按照胞核與胞質蛋白抽提試劑盒說明書分別提取出細胞核和細胞質蛋白。使用BCA試劑盒于酶標儀上測定各部分蛋白濃度，標曲R2>0.99，計算并配置濃度為2 g·L-1的上樣緩沖液，-20 ℃保存。電泳80 V，30 min；100 V，90 min；200 mA濕轉90 min至0.45 μm或0.22 μm的PVDF膜；5%脫脂牛奶或5% BSA(磷酸蛋白)(TBST配制)室溫搖床封閉1 h后孵育一抗(TLR4 1 ∶1 000、MyD88 1 ∶1 000、phospho-NF-κB p65 1 ∶1 000、NF-κB p65 1 ∶1 000、β-actin 1 ∶10 000、Histone H3 1 ∶8 000)4 ℃過夜；次日二抗(1 ∶8 000)37 ℃恒溫1 h，凝膠成像系統顯影成像；全細胞以β-actin作為參照，胞核以Histone H3為參照，使用ImageJ軟件對條帶進行分析。

2.8 統計學方法使用SPSS 26.0軟件進行數據的統計分析，計量資料均以均數±標準差表示，采用單因素方差分析(One Way ANOVA)及t檢驗；統計圖使用Prism Graphpad 8.0軟件制作。

3 結果

3.1 黃芩苷對AD大鼠模型學習記憶能力的影響大鼠雙側側腦室注射STZ誘導AD大鼠模型，造模后連續14 d給予不同濃度黃芩苷(60 mg-1·kg-1·d-1，120 mg-1·kg-1·d-1)和米諾環素組(36 mg-1·kg-1·d-1)灌胃治療。Morris水迷宮結果顯示，與假手術組相比，AD大鼠學習記憶能力有一定程度下降，尋找平臺時間增加(P<0.01)；與模型組相比，黃芩苷低(P<0.05)、高劑量和米諾環素(P<0.01)治療后能明顯減少AD大鼠尋找平臺時間，行動目標明確。在空間探索實驗中，與假手術組相比，AD大鼠第一象限停留的時間減少(P<0.01)，且救生平臺穿梭的次數明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，黃芩苷低(P<0.05)、高劑量(P<0.01)和米諾環素(P<0.05)治療后AD大鼠穿梭平臺次數和第一象限停留時間增加(Fig 1)。

Fig 1 Effect of baicalin on learning and memory of AD

3.2 黃芩苷對AD大鼠模型海馬區小膠質細胞活化的影響通過免疫熒光結果顯示，假手術組小膠質細胞少有活化，模型組中小膠質細胞活化數量較假手術組明顯增多(P<0.01)，且呈現聚集性，多分布在海馬CA2和CA3區；與模型組比較，在不同劑量的黃芩苷和米諾環素干預后均能抑制小膠質細胞活化(P<0.01)(Fig 2)。

Fig 2 Effect of baicalin on microglia activation in hippocampus of AD

3.3 黃芩苷對AD大鼠模型海馬區炎癥因子表達的影響采用qPCR檢測各組大鼠海馬區炎癥因子的mRNA表達水平，與假手術組比較，模型組的TNF-α、IL-6的表達升高(P<0.05)，IL-1β的表達明顯上升(P<0.01)，差異有統計學意義；與模型組比較，黃芩苷低、高劑量和米諾環素處理能有效抑制TNF-α、IL-6(P<0.05)、IL-1β(P<0.01)的表達，差異有統計學意義(Fig 3)。

Fig 3 Effect of baicalin on TNF-α，IL-6 and IL-1β mRNA expression in hippocampus of AD

3.4 黃芩苷對AD大鼠模型海馬區TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的影響TLR4/MyD88/NF-κB信號通路調控促炎因子的產生，是經典的炎癥通路。通過Western blot法檢測各組大鼠海馬區TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65的蛋白表達情況，提取各組大鼠海馬區全蛋白，與假手術組相比，模型組TLR4、MyD88的蛋白表達量(P<0.01)及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值明顯上升(P<0.05)。不同濃度的黃芩苷及米諾環素處理能有效抑制TLR4、MyD88的表達量，減少NF-κB p65活化(P<0.01)，差異有統計學意義。

提取各組大鼠海馬區胞質和胞核蛋白，通過Western blot法檢測NF-κB蛋白表達情況，結果見Fig 4。與假手術組相比，模型組NF-κB p65胞核/胞質比增加(P<0.05)，說明NF-κB p65入核增加，差異有統計學意義。不同濃度黃芩苷處理可降低NF-κB p65胞核/胞質比，減少NF-κB p65入核，米諾環素處理后與黃芩苷高劑量組干預結果一致(P<0.01)(Fig 4)。

Fig 4 Effect of baicalin on TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway in hippocampus of AD

3.5 黃芩苷對AD大鼠模型海馬區NF-κB核轉移的影響免疫熒光結果顯示，假手術組組織中NF-κB p65主要位于胞質，而在模型組中NF-κB p65出現散點狀入核的細胞數量增多，在不同劑量的黃芩苷或米諾環素干預下，一定程度上抑制NF-κB p65進入細胞核，與Western blot結果一致(Fig 5)。

Fig 5 Effect of baicalin on intracellular nuclear transfer of NF-κB p65 in hippocampus of AD rats

4 討論

AD是以進行性認知功能障礙和記憶功能減退為主的神經退行性疾病，多種證據表明腦內炎癥是AD的重要病理學特征。STZ是一種亞硝基脲衍生物，會優先破壞胰島β細胞，通常用作糖尿病實驗動物模型。研究表明，側腦室注射低劑量STZ可引起腦胰島素信號穩態的破壞及腦內葡萄糖代謝障礙但不會誘發全身性糖尿病，這與散發型阿爾茨海默病(SAD)的病理學變化類似，其主要病理改變包括突觸功能障礙、tau過度磷酸化、神經炎癥、大腦中Aβ沉積、氧化應激和胰島素抵抗等引起腦內神經元損失，最終導致學習記憶能力進行性缺失及認知行為改變[9]，目前已成為較為成熟的AD動物模型。相較于APP/PS1小鼠，從基因層面促進Aβ生成模擬AD發病過程，本模型模擬的是在AD發病類型中占比約為90%的SAD，更具有代表性。STZ側腦室注射的AD模型已被證明腦內TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子升高[10]及NF-κB的上調[11]，說明神經炎癥在此AD模型中是關鍵性病理特征。本研究探索了黃芩苷對STZ側腦室注射損傷的AD大鼠模型的腦內炎癥的抗神經炎癥作用，發現黃芩苷可以對AD大鼠起到神經保護作用，在水迷宮實驗中，模型組大鼠找到平臺的時間明顯較正常組、藥物組及陽性對照組延長，說明STZ側腦室注射損傷了大鼠的學習記憶能力，而給與黃芩苷的AD大鼠的逃避潛伏期則明顯縮短，提示黃芩苷對AD大鼠模型具有一定的保護作用。

黃芩性味苦寒，入肺、胃、膽、大腸經，有清熱燥濕、瀉火解毒之效，用于治療各種炎性疾病。黃芩苷是黃芩的有效成分，有抗菌抗病毒、抗過敏、鎮痛消炎、抗腫瘤、保護肝損傷、改善糖尿病腎病、腦損傷修護等功效，同時也具有很好的神經保護作用[5]。黃芩苷可以改善AD小鼠模型的突觸可塑性及線粒體功能[12]，促進AD大鼠神經干細胞增殖和分化[13]、抗氧化應激及細胞凋亡[14]，尤其是在抗炎及神經保護方面的作用尤為突出[2]，這也與中藥黃芩本身的功效相適應。TLR4表達于中樞神經系統神經元、小膠質細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞和血管內皮細胞上，可被多種病原體和細胞因子激活[3]。多項研究表明，TLR4與先天免疫激活密切相關，可參與中樞神經系統損傷時的免疫調節，在炎癥調節中起重要作用[15]，MyD88作為TLR4接頭分子有依賴性和非依賴性兩種，其依賴途徑介導NF-κB的活化和細胞因子的產生，在AD的發生發展中起著關鍵作用[16]。正常狀態下，NF-κB p65 和NF-κB p50結合在一起，其抑制蛋白IκB也結合在其上，此時NF-κB無活性。IκB的激酶IKK可以促進其磷酸化，磷酸化后的IκB會被泛素化降解，NF-κB脫離出來入核，激活下游基因的轉錄，可以上調編碼各種促炎蛋白或酶的基因[17]，如升高TNF-α、IL-1β、IL-6等的表達。在本實驗中，黃芩苷可以降低AD大鼠腦中的TLR4、MyD88的表達，減少NF-κB p65的磷酸化和抑制NF-κB入核，從而下調TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達。提示黃芩苷改善STZ誘導的AD大鼠認知功能障礙可能與調控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路抑制神經炎癥密切相關。有趣的是，炎癥因子的表達與黃芩苷的干預無劑量依賴關系，研究表明，黃芩苷通過下調SIRT1/HMGB1通路，減少小膠質細胞相關的神經炎癥，并改善了LPS誘導的小鼠急性神經認知缺陷[18]，因此，我們推測黃芩苷抑制神經炎癥可能是多途徑共同參與的。

綜上所述，STZ側腦室注射導致大鼠學習記憶能力減退可能與腦內神經炎癥有關，黃芩苷灌胃可改善STZ誘導的大鼠認知障礙，其機制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，減輕AD腦內神經炎癥有關，本研究為黃芩苷用于AD的防治的后續研究提供了科學依據。