FKBP38可調控多巴胺能神經元的凋亡

劉 靜，謝彩婷，封文斌，趙文卓，李芳紅，吳曉麗，趙子建

(廣東工業大學生物醫藥學院，廣東 廣州 510006)

帕金森病(Parkinson’s disease PD)又稱為震顫麻痹，是一種影響患者活動能力的中樞神經系統慢性疾病，起病隱襲，進展緩慢[1]。其主要病理特征是中腦黑質致密部多巴胺能神經元損傷，神經元內出現以α-突觸核蛋白(α-synuclein)為關鍵成分的路易小體(Lewy body)，進而引起神經元變性、凋亡，導致腦部多巴胺水平降低[2]。文獻研究表明，減少多巴胺神經元凋亡可一定程度改善PD的癥狀。目前臨床上用于治療PD的藥物(司來吉蘭和美多巴)均是通過提高多巴胺水平，從而減少神經元凋亡。然而，這些藥物只能改善PD癥狀，并不能阻止病情的進展，也無法治愈疾病[1-3]。因此，尋找新的靶點，在PD發病早期進行基因修飾，抑制神經元凋亡，進而改善PD癥狀，是極為迫切的事情。

FK506結合蛋白38 (FKBP38)是FKBP家族蛋白之一，特征在于其相應的 mRNA 在人腦組織中顯著表達[4]，包含FK506結合域并表現出肽基脯氨酰異構酶活性[5-6]。在小鼠胚胎發育過程中，FKBP38可通過拮抗Shh通路延緩神經管的關閉[7-8]。并且FKBP38的丟失還會導致后神經管細胞凋亡增加和發育異常[9]。此外，還有研究表明FKBP38通過其C端跨膜結構域錨定在線粒體外膜上，招募并幫助抗凋亡蛋白Bcl-2來抑制細胞凋亡[10-11]。這提示FKBP38可能是一種重要的細胞凋亡抑制劑[12]。但是，尚未有研究報道FKBP38在帕金森病中對多巴胺能神經元的作用。

因此，本文旨在探討在PD體內外模型中FKBP38蛋白表達情況，并選用神經毒素誘導的PD體外模型，研究過表達和敲減FKBP38后，對多巴胺能神經元凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 8周齡♂的C57BL/6小鼠30只，體質量(20～25) g，購買于廣東省醫學實驗動物中心(廣東佛山，編號：44007200085200)。小鼠每籠5只，飼養溫度(21～25) ℃，12 h晝夜交替，自由飲水攝食，每周更換3～4次墊料，動物在開展實驗前先適應性喂養1周。

1.1.2細胞和慢病毒 MN9D(小鼠中腦多巴胺神經元)細胞購自廣州吉尼歐公司。FKBP38慢病毒載體購自廣州賽業公司，慢病毒載體為LV-EFS>mFKbP8-PGK>Puro 和LV-CMV>eGFP/T2A/Puro(以下分別簡寫為OV-FKBP38及OV-NC)，LV-U6>mFKbP8[shRNA#2]-PGK>Puro和LV-U6 >Scramble-shRNA-PGK>EGFP/T2A/Puro(以下分別簡寫為sh-NC及sh-FKBP38)，該慢病毒中含有FKBP38全長cDNA，所有結構都經DNA測序驗證，轉染效果經免疫印跡(Western blot)驗證。

1.1.3試劑 RPMI1640(Lot：PM150110A)購自武漢普諾賽公司；胎牛血清購自于美國Gibco公司；胰酶(Lot：2120649)購買于美國Gibco公司；CCK-8(cell counting kit-8，批號：G909FA003)購自上海生物工程有限公司；DMSO購自于美國sigma aldrich公司；FKBP38抗體購自R&D 公司；α-synuclein、Tom20和Bax抗體購自美國CST公司；Bcl-2抗體購自英國Abcam公司；TH抗體購買于美國Gibco公司；魚藤酮和MPTP購自中國阿拉丁公司；MPP+購買于美國Sigma公司。

1.1.4儀器 二氧化碳培養箱CLM-170B-8-NF型(ESCO，新加坡)；二級生物安全柜AC2-4S1型(ESCO，新加坡)；EPED-2TF純水儀(中國)；DYY-6C電泳儀(中國)；多管架自動平衡離心機TDZ5-WS型(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；流式細胞儀(DXP AthenaTM，美國)；Leica倒置顯微鏡(Leica，德國)；酶標儀CMAXPLUS+ (美國)；化學發光凝膠成像系統ChemiDoc+XRS(Bio-Rad，美國)。

1.2 方法

1.2.1小鼠分組及給藥 小鼠隨機分為2組，每組 15 只：對照組、模型組。以腹腔注射的方式給予模型組小鼠 10 mg·kg-1的MPTP，給予對照組小鼠相同體積的PBS。3 d注射1次，連續注射7次，在末次注射后的d 2進行脫頸椎處死小鼠，立即取腦，冰上操作，剝離紋狀體和黑質，液氮速凍，后轉至-80 ℃保存備用。

根據R型因子分析及R型聚類分析結果，結合全區地質、地球化學特征以及研究區現有礦化線索，將分析的20種元素進行劃分，確定組合異常5個分別為Cr，Ni，Co組合，La，Nb，Th，U，Y組合，Ag，Cd，Cu，Pb，Zn組合，W，Sn，Mo，Bi組合及Au，As，Sb組合。

1.2.2細胞培養及藥物處理 MN9D細胞用添加10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，于37 ℃、5%二氧化碳細胞培養箱中進行常規培養，每隔1天進行換液，2～3 d進行傳代，待細胞密度為85%左右，根據不同條件進行刺激。魚藤酮及MPP+采用完全培養基溶解，刺激細胞時采取全換液的方式進行。

1.2.3細胞分組及感染 將MN9D細胞分為FKBP38過表達組(OV-FKBP38)及對照組(OV-NC)、敲減FKBP38組(sh-FKBP38)及對照組(sh-NC)，將細胞鋪板接種于6孔板，每孔接種細胞數2×105個，放置于培養箱常規培養。待細胞密度長于30%～50%時進行感染慢病毒實驗，收集細胞提蛋白進行Western blot檢驗慢病毒感染效率。

1.2.4CCK-8法檢測細胞增殖活性 將生長狀態良好的MN9D細胞及轉染慢病毒成功后的細胞制備成單細胞懸液并鋪板接種于96孔板，每孔100 μL細胞懸液，每孔接種細胞數2×104個，放置于培養箱常規培養。實驗分組為不同濃度(8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0)μmol·L-1的魚藤酮處理MN9D組，及同濃度魚藤酮分別處理OV-NC、OV-FKBP38、sh-NC、sh-FKBP38組。過夜培養待細胞貼壁后，吸出原培養基，更換為提前配好不同濃度魚藤酮藥物的培養基；繼續放置培養箱培養不同時間后，向每孔添加10 μL CCK-8溶液，貼壁加入以免產生氣泡，避光孵育，1～2 h后取出，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(A值)。

1.2.5Western blot檢測蛋白水平 在10 cm細胞培養皿中加入200 μL RIPA裂解液，裂解液含(RIPA、PMSF、蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑)，用無菌細胞刮緩慢刮下，置于冰上裂解10 min，超聲破碎1～2次，每次30 s，4 ℃離心機12 000 r·min-1離心20 min后,取上清于另一干凈Ep管中，蛋白定量 BCA 法檢測待測樣品濃度。待測樣品與5×上樣緩沖液稀釋混合，金屬浴10 min。取同等質量蛋白樣品在質量分數10%或12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行電泳，恒壓轉膜至PVDF膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h或4 ℃過夜封閉。分別加一抗α-syn(1 ∶1 000)、FKBP38(1 ∶500)、Bax(1 ∶1 000)、TH(1 ∶1 000)、Tom20(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶2000) 、 β-actin(1 ∶5 000),4 ℃孵育過夜。過夜孵育后TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，再次TBST洗膜3次，ECL發光成像儀曝光。并應用ImageJ軟件對目標蛋白和內參蛋白灰度值進行分析，相對表達量=目的蛋白灰度值/內參灰度值。

2 結果

2.1 PD體內模型中FKBP38表達情況如Fig 1所示，通過Western blot檢測MPTP誘導的PD體內模型。結果顯示，在小鼠腦紋狀體和黑質區域，α-synuclein蛋白的表達量水平明顯升高(P<0.01)，TH表達量水平明顯下降(P<0.01)(Fig 1A)。而在MPTP誘導的PD小鼠腦紋狀體區域中FKBP38表達水平明顯下降(P<0.01)，在黑質區域中FKBP38表達量無明顯變化(Fig 1B)，說明在MPTP誘導的PD體內模型中FKBP38在紋狀體中特異性下調，提示FKBP38與PD模型中的特異性蛋白(α-synuclein和TH)存在相關性。

Fig 1 Expression of FKBP38 protein in striatum and substantia nigra of PD model

Fig 2 Expression of FKBP38 in PD cell model A：α-synuclein/TH expression in PD cells; B：Tom20/FKBP38 expression in PD cells. *P<0.05,**P<0.01 vs control

2.3 穩定過表達FKBP38的MN9D細胞株的建立如Fig 3所示，利用攜帶FKBP38的慢病毒感染MN9D細胞。隨后，我們利用Western blot檢測FKBP38 的表達水平。與MN9D組相比，OV-NC組和sh-NC組的FKBP38表達量均沒有明顯變化，說明選擇的載體合適。與OV-NC組相比，OV-FKBP38組的FKBP38表達量明顯上升(P<0.05)，說明FKBP38過表達細胞構建成功。與sh-NC組相比，sh-FKBP38組的FKBP38表達量明顯下降(P<0.05)，說明FKBP38敲減細胞構建成功。

Fig 3 FKBP38 lentiviral transfection of MN9D cells

2.4 魚藤酮抑制MN9D細胞活力如Fig 4所示，CCK-8檢測不同濃度 (8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0)μmol·L-1的魚藤酮處理MN9D細胞8 h后，結果顯示，顯著抑制細胞增殖(Fig 4A)(P<0.01)，4 μmol·L-1濃度時，細胞活力下降到對照組的49.52%，且用魚藤酮(4 μmol·L-1)處理MN9D細胞不同時間，發現隨著處理時間的增加，細胞活力降低加劇(Fig 4B)(P<0.01)處理8 h時，細胞活力為對照組50.08%。因此，選用魚藤酮(4 μmol·L-1)處理MN9D細胞8 h進行后續研究。

Fig 4 Effect of rotenone on viability of MN9D cells

2.5 FKBP38對PD細胞活力下降的影響如Fig 5所示，魚藤酮處理MN9D細胞8 h后，與sh-NC組模型組相比，sh-FKBP38組模型組的細胞活力明顯下降(Fig 5A)(P<0.01)，表明FKBP38敲減后加劇PD細胞活力下降。而與OV-NC組模型組相比，OV- FKBP38組模型組的細胞活力明顯增強(Fig 5B)(P<0.01)，表明過表達FKBP38可以明顯改善PD細胞活力下降。

Fig 5 Effect of FKBP38 on decreased viability

2.6 FKBP38對PD細胞凋亡的影響如Fig 6所示，Western blot 檢測結果顯示，與對照組相比，模型組經魚藤酮處理MN9D細胞8 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯下調(P<0.05)，凋亡蛋白Bax的表達沒有差異，但Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)，表明魚藤酮引起了多巴胺能神經元的凋亡。與OV-NC組模型組相比，OV-FKBP38組模型組的Bcl-2蛋白表達上升(P<0.01)，Bax的表達量沒有差異，Bcl-2/Bax比值上升(P<0.01)，說明過表達FKBP38可以明顯改善魚藤酮引起的多巴胺能神經元凋亡。與sh-NC組模型組相比，sh-FKBP38組模型組的Bcl-2和Bax的表達量均無明顯差異，表明敲減FKBP38無明顯加劇魚藤酮引起的多巴胺能神經元凋亡。

Fig 6 Effect of FKBP38 over expression on expression of Bcl-2，Bax protein in PD

3 討論

帕金森病是一種進展非常緩慢的疾病，發病因素復雜，且不同患者病情輕重也存在很大的差異[13]。多巴胺是一種神經遞質，將信息從一個神經細胞傳至另一個神經細胞，保證神經的傳導性，由多巴胺能神經元合成并儲存在囊泡中，而后通過胞裂外排的方式由神經元釋放，多巴胺能神經元的病變會導致帕金森病。這也是臨床上導致PD的主要病理特征，減少神經元凋亡對緩解PD進程有重要作用[14]。目前，關于帕金森病治療手段只能延緩但無法阻止疾病的進展[15]?；蛑委熓桥两鹕≈委煹男屡d領域，由于其發病機制復雜，其中線粒體功能障礙在帕金森病發生中具有重要作用[16-17]。因此以線粒體相關基因為靶點尋找新的治療方法具有重要意義。同時，應深入研究線粒體功能障礙分子機制，明確線粒體相關基因對帕金森病的影響。

為研究FKBP38對神經毒素誘導的帕金森病的影響，本課題組檢測在PD體內外模型中FKBP38表達水平，實驗結果發現，在PD體內模型中，與正常組相比模型組小鼠腦紋狀體區域中FKBP38表達水平明顯降低。同樣，在PD細胞模型中，與正常組相比FKBP38表達水平明顯特異性降低。猜測高表達FKBP38可能會延緩多巴胺神經元凋亡從而緩解PD進程。為進一步探究FKBP38對帕金森病的影響，我們在體外實驗中通過使用FKBP38慢病毒轉染MN9D細胞來檢測其表型變化。實驗結果顯示，魚藤酮可明顯降低MN9D細胞活力，并通過降低Bcl-2的表達量引起MN9D細胞凋亡。而過表達FKBP38后能明顯改善魚藤酮引起的細胞活力下降，表明過表達FKBP38可明顯提高PD細胞活力。過表達FKBP38后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量明顯升高，Bcl-2/Bax比值明顯升高，表明過表達FKBP38改善魚藤酮引起的多巴胺能神經元凋亡可能是通過線粒體內源途徑 Bcl-2/Bax 通路誘導的。說明過表達FKBP38在帕金森病的發展過程中發揮著抑制多巴胺能神經元凋亡的作用。這與先前研究中FKBP38錨定在線粒體外膜招募Bcl-2從而抑制凋亡作用相一致[11]。

綜上所述，FKBP38表達在魚藤酮誘導的PD細胞模型被特異性下調，敲減FKBP38加劇魚藤酮誘導的細胞損傷，通過過表達FKBP38能夠明顯恢復魚藤酮誘導的細胞活力下降，并抑制魚藤酮引起的細胞凋亡。提示FKBP38與多巴胺神經元凋亡相關，有望成為治療或者減緩帕金森病進程的重要靶點。