丹參酮ⅡA通過調節線粒體轉位蛋白誘導HepG2細胞凋亡

張 誼，歐玉龍，王惠霞，黃曉佳

(1. 南通大學附屬丹陽醫院江蘇省丹陽市人民醫院，江蘇 丹陽 212300；2. 常州大學生物醫學工程與健康科學研究院，江蘇 常州 213164)

原發性肝細胞癌(hepatic cell carcinoma, HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率都非常高。HCC的發病是由多種因素及多個步驟共同演變而來的繁雜過程，同時也受到內外環境的雙重影響，但其病因及確切的分子機制尚未清楚[1]。臨床上常采用手術切除、化療、放療等手段進行腫瘤治療，但由于耐藥和不良反應，大部分HCC治療藥物效果不佳，因此，尋找更有效的抗HCC藥物迫在眉睫[2]。

丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA, Tan ⅡA)是中草藥丹參的主要有效活性成分之一，具有多方面的藥理活性，如Tan ⅡA對多種腫瘤細胞具有明顯的細胞毒性作用，能夠抑制腫瘤細胞的增殖活力，誘導細胞凋亡，其機制可能與抑制細胞內相關DNA合成、阻滯細胞周期過渡、激活凋亡基因以及上調原癌基因的表達水平等有關[3-4]。近年來[5-6]，丹參酮調控線粒體功能也屢有報道，認為丹參酮ⅡA可引起細胞線粒體膜透性轉運孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)開放，釋放大量活性氧，降低跨膜電位，從而誘導細胞凋亡。

MPTP是與線粒體凋亡途徑有關的重要結構，由線粒體外膜的電壓依從性陰離子通道、內膜的腺苷酸轉運蛋白以及轉位分子蛋白(translocator protein, TSPO)等共同構成[7]。TSPO調節離子通道的開放，在線粒體凋亡過程中起著關鍵作用[8]。但目前有關轉位蛋白TSPO及線粒體途徑在Tan ⅡA誘導肝癌細胞凋亡中的研究較少，本實驗選用人肝癌細胞HepG2作為實驗對象，觀察Tan ⅡA對腫瘤細胞HepG2的作用及相關線粒體凋亡途徑的調控，探討其可能存在的作用機制，為肝癌的預防和治療提供新的分子靶標和實驗支持，為未來臨床應用提供理論依據和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料人肝癌細胞HepG2(中國科學院上海細胞庫)；Tan ⅡA(質量分數 ≥ 98%)(中國藥品生物制品檢定所，批號110766-200619)；DMEM培養基、胰蛋白酶(美國Gibco公司，貨號12100046、25200-056)；新生牛血清(杭州四季青，貨號22011-8612/22011-8615)；熒光素酶-ATP檢測試劑盒(南通碧云天，貨號S0026)；JC-1試劑盒(美國BD公司，貨號551302)；Annexin V PE/7-氨基-放線菌素D細胞凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號CA1030)；噻唑藍MTT(美國Amresco公司，貨號0793)；兔抗TSPO多克隆抗體(美國CST公司，貨號70358S)；兔抗線粒體內細胞色素C(mitochondrial cytochrome C, Cyto C)、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3, caspase-3)、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-9(cysteinyl aspartate specific proteinase-9, caspase-9)多克隆抗體(美國Abcam公司，貨號ab133504、ab32351、ab32539)；鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)單克隆抗體(美國Santa Cruz公司，貨號sc-47724)；超敏顯影液ECL(美國Millipore公司，貨號WBKlS0100)。其余未注明試劑均為國產分析純。

1.2 儀器超凈臺(蘇州凈化設備總廠)；CO2細胞培養箱(上海Heal Force公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；超純水機(成都超純科技有限公司)；電子分析天平(德國賽多利斯公司)；酶標儀、電泳儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(南京麥高德生物科技公司)；冷凍離心機(美國Thermo Fisher 公司)；熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；超聲波粉碎機(新芝生物科技公司)；流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3 方法

1.3.1細胞培養及藥物處理 將HepG2細胞培養于含10%新生牛血清、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的高糖DMEM中，然后置于含5% CO2和95%空氣的培養箱中，待單層細胞生長至80%后傳代。實驗用細胞均處于指數生長期。

1.3.2MTT比色法檢測細胞存活率 將細胞按5×107L-1密度接種于96孔板中，加入不同濃度的Tan ⅡA，使其終濃度分別為2.5、5、10 μmol·L-1，對照組中加入相應體積的溶劑。

藥物處理結束后，在每孔中加入MTT(終濃度為0.5 g·L-1)，37 ℃下反應4 h，棄去培養液，在每孔加入100 μL DMSO，待完全溶解后，于490 nm處測定各孔吸光度。按公式：細胞增殖抑制率/%=(1-處理組OD值/對照組OD值)×100%，計算抑制率。

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1.3.3細胞形態學檢測 用終濃度為2.5、5、10 μmol·L-1的Tan ⅡA處理HepG2細胞24 h后，將培養皿置于普通光學倒置顯微鏡下，記錄細胞形態和變化并拍照。

1.3.4 細胞凋亡檢測藥物作用24 h后，加入Hoechst 33342染色液于室溫下反應5 min，用熒光酶標儀檢測熒光強度，在倒置顯微鏡下觀察細胞的核變化，并計算細胞核凋亡小體的數量。

同時，將細胞離心重懸于100 μL的緩沖液中，分別加入5 μL Annexin-V-PE和7-氨基-放線菌素D熒光染料，避光孵育15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.5熒光素酶發光法檢測ATP的生成 加入ATP裂解液進行細胞裂解，收集細胞裂解液，置于冷凍離心機中離心10 min，取上清液，加入100 μL/孔的ATP檢測試劑，常溫下反應2～3 min后放于化學發光酶標儀上檢測細胞熒光強度，同時測定各組ATP濃度和蛋白含量，計算每毫克蛋白中ATP的量。

1.3.6Clark氧電極法檢測細胞耗氧率 將細胞懸液收集于離心管中，在37 ℃記錄每組細胞的耗氧率[nmol · (min · mL)-1]的變化。根據各組細胞耗氧率和細胞密度分別計算細胞耗氧率[nmol O2· (min · 104細胞)-1]。

1.3.7JC-1染色檢測線粒體膜電位 以每孔4×103個密度將細胞接種于24 孔培養板中，藥物處理24 h結束后，加入2.5 mg·L-1的JC-1染色工作液，37 ℃負載探針40 min，PBS洗滌2次后，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照，同時用熒光酶標儀檢測和記錄線粒膜電位的變化。

1.3.8細胞內TSPO的表達定位檢測 將HepG2細胞接種于放置玻璃片的培養皿中，用冰甲醇固定細胞，0.3% Triton X-100透化，羊血清封閉半小時后，滴加抗TSPO抗體(1 ∶300)，4 ℃搖床反應過夜；后加入Cy3標記的二抗(1 ∶600)常溫下避光反應1 h，加入Hoechst 33258染液于室溫下染色10 min，置熒光顯微鏡下觀察。

1.3.9細胞TSPO、Cyto C、caspase-3、caspase-9蛋白的表達檢測 HepG2細胞經不同濃度Tan ⅡA處理24 h后，收集細胞，提取總蛋白并測定蛋白濃度。各組按比例以30 μg總蛋白上樣，電泳分離后轉膜，脫脂奶粉封閉后加入TSPO(1 ∶1 000)、Cyto C(1 ∶1 000)、caspase-3(1 ∶1 000)、caspase-9(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶7 000)抗體，于4 ℃反應過夜。PBS洗滌后，將膜和對應的二抗(1 ∶5 000)在常溫下孵育1 h，洗滌后加入顯影劑并在凝膠成像系統下進行拍照，以Image J軟件分析各條帶灰度值。以GAPDH條帶灰度值作參照，進行半定量分析。

2 結果

2.1 Tan ⅡA對HepG2細胞形態及增殖的影響如Fig 1A所示，對照組中HepG2細胞形態完整且飽滿，2.5 μmol·L-1的Tan ⅡA處理24 h后，HepG2細胞數量減少，并開始出現死亡；而10 μmol·L-1Tan ⅡA處理過的HepG2細胞形態發生明顯變化，細胞胞體皺縮成圓形，細胞數量明顯減少。

以終濃度為2.5、5、10 μmol·L-1的Tan ⅡA作用于HepG2細胞12 h、24 h和48 h后，如Fig 1B所示，2.5 μmol·L-1的Tan ⅡA即能引起細胞損傷，10 μmol·L-1的Tan ⅡA抑制率達到70.26%，說明Tan ⅡA可抑制HepG2細胞的增殖，并且具有時間-濃度梯度依賴性。經計算，不同濃度的Tan ⅡA作用HepG2細胞24 h，引起細胞損傷的的IC50為(5.8±1.83) μmol·L-1。

Fig 1 Treatment with Tan ⅡA induced cell death and morphological changes of HepG2 cells(n=5)

2.2 Tan ⅡA對HepG2細胞凋亡的影響Hoechst 33342是一種常用于檢測細胞凋亡的熒光染料。細胞膜在正常情況下常保持完整性，熒光染料極少能透過細胞膜，因此只能產生微弱的藍色熒光；而當細胞發生凋亡時，細胞膜的通透性會隨之增強，從而進入膜內里的熒光染料逐漸增多，因此凋亡細胞的熒光強度要比正常細胞明顯。如Fig 2A所示，不同濃度的Tan ⅡA處理細胞24 h后，對照組中的HepG2細胞核凋亡小體較少，呈現出相對較弱的藍色熒光，5 μmol·L-1的Tan ⅡA導致HepG2細胞的胞核皺縮碎裂，出現較多凋亡小體，藍色熒光加強；而10 μmol·L-1的Tan ⅡA則導致大量細胞出現凋亡，藍色熒光進一步增強。

Fig 2 Tan ⅡA induced cell apoptosis in HepG2 cells ( n=4)

以Tan ⅡA處理HepG2細胞24 h后，將細胞以Annexin V PE/7-氨基放線菌染色，經流式細胞儀檢測細胞凋亡率，結果如Fig 2C所示，對照組細胞凋亡率為(0.88±0.83)%，終濃度為2.5、5、10 μmol·L-1的Tan ⅡA處理后，細胞凋亡率分別為(5.34±2.38)%、(20.85±5.40)%和(47.04±3.11)%，表明Tan ⅡA可誘導HepG2細胞凋亡，且呈濃度依賴性。

2.3 Tan ⅡA對HepG2細胞ATP含量及耗氧率的影響熒光素-熒光素酶法檢測細胞中ATP的含量，結果如Fig 3A所示，與對照組相比，2.5～10μmol·L-1濃度Tan ⅡA能明顯降低HepG2細胞中的ATP水平；用Clark氧電極檢測各組HepG2細胞的耗氧率。結果如Fig 3B所示，與空白對照組相比，Tan ⅡA(5～10 μmol·L-1)作用于HepG2細胞24 h后，細胞耗氧率明顯降低，且隨著Tan ⅡA濃度的增加，HepG2細胞耗氧率不斷降低。

Fig 3 Tan ⅡA inhibited ATP production and decreased oxygen consumption rate in HepG2 cells (n=5)

2.4 Tan ⅡA對HepG2細胞線粒體膜電位的影響JC-1染色法檢測結果如Fig 4所示，對照組JC-1呈聚合體形式存在于細胞中，表明細胞的線粒體膜電位比較高。當不同終濃度的Tan ⅡA作用于HepG2細胞后，圖中JC-1的紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光隨JC-1的單體增多而逐漸增強，說明細胞線粒體膜電位的降低呈劑量依賴性；從定量結果中分析發現，各濃度Tan ⅡA處理后，細胞中線粒體膜電位也隨之下降，尤其10 μmol·L-1的Tan ⅡA處理后線粒體膜電位下降明顯。

Fig 4 Tan ⅡA decreased mitochondrial membrane potential in HepG2 cells(n=4)

2.5 Tan ⅡA對HepG2細胞TSPO表達的影響免疫熒光染色可準確檢測TSPO在細胞內的表達位置。如Fig 5所示，在正常細胞中，TSPO幾乎不表達；2.5～5 μmol ·L-1的Tan ⅡA處理HepG2細胞24 h后，細胞內TSPO出現表達；經10 μmol·L-1的Tan ⅡA處理后，細胞核內TSPO的表達明顯增加，表明Tan ⅡA可誘導HepG2細胞TSPO的表達，并且使TSPO進入細胞核內。

Fig 5 Tan ⅡA induced nucleic TSPO expression in HepG2 cells

2.6 Tan ⅡA對HepG2細胞TSPO、Cyto C、caspase-3、caspase-9蛋白表達的作用采用免疫印跡法檢測Tan ⅡA對HepG2細胞中TSPO、Cyto C、caspase-3、caspase-9的蛋白表達。如Fig 6所示，與對照組相比，HepG2細胞經不同濃度(2.5～10 μmol·L-1)Tan ⅡA處理后，細胞內TSPO、Cyto C、caspase-3以及caspase-9蛋白的表達水平隨Tan ⅡA劑量的增加而明顯上調。

Fig 6 Tan ⅡA induced expressions of TSPO, Cyto C, caspase-3, caspase-9 in HepG2 cells(n=4)

3 討論

中藥提取物Tan ⅡA是從丹參中提取的脂溶性菲醌類化合物，具有多種藥理學作用，如Tan ⅡA可保護肝臟損傷，抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡[9-10]。本研究結果顯示，Tan ⅡA(2.5～10 μmol·L-1)對HepG2細胞有增殖抑制作用，并呈時間-劑量依賴性。同時，Tan ⅡA作用于HepG2細胞24 h后，細胞形態縮小，細胞發生核皺縮，流式細胞儀檢測也表明Tan ⅡA可誘導細胞出現凋亡性死亡。

細胞凋亡是一種復雜的生化過程，主要經外源性和內源性兩種途徑發生，外源性途徑常由細胞表面的死亡引發，而內源性途徑則與線粒體相關。通常認為后者是細胞凋亡主要的途徑[11]。線粒體功能障礙引起細胞膜電位下降，繼而引發線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)開口，使Cyto C從線粒體釋放到胞質中，促使caspase-9 原型活化，啟動半胱氨酰天冬氨酸酶從而激活下游caspase-3[12]，最終導致核染色質的皺縮，基因組的片段化以及凋亡小體的產生。本實驗中，Tan ⅡA(2.5～10 μmol·L-1)作用于HepG2細胞24 h后，凋亡相關蛋白caspase-9與caspase-3的表達均上調，從而促使HepG2細胞發生早期凋亡。

同時，Tan ⅡA作用于HepG2細胞24 h后，胞質中Cyto C表達上調、細胞ATP產生減少、耗氧能力降低，以及線粒體膜電位下降，表明細胞線粒體功能受損。細胞線粒體膜電位是產生ATP的前提[13-14]，也是線粒體維持氧化磷酸化，保持功能正常所必需的。本實驗中，隨著Tan ⅡA濃度的增加，JC-1染色結果從紅色到綠色熒光的轉變，表明HepG2細胞膜電位下降，線粒體功能發生障礙，提示Tan ⅡA誘導HepG2細胞凋亡可能為藥物抑制了線粒體功能。

TSPO主要定位于線粒體的外膜，是mPTP的主體成分，具有多種生理功能，如參與mPTP的開放、細胞凋亡與增殖調控、甾體生成、免疫應答等，其聚集于細胞核內時可導致線粒體功能障礙[15-16]。研究表明，TSPO的蛋白表達和TSPO mRNA的轉錄在肝癌、前列腺癌、腎癌和腦癌中顯著增加，在結腸癌和肺癌中明顯下降[17]；而在小鼠乳腺腫瘤模型實驗中，TSPO配體PK-11195可抑制腫瘤細胞的增殖，侵襲和遷移[18]。本實驗中，Tan ⅡA抑制HepG2細胞增殖時，TSPO的蛋白表達提高，表明轉位蛋白TSPO可能參與Tan ⅡA誘導HepG2細胞凋亡過程。

綜上所述，本研究證明了Tan ⅡA可誘導HepG2細胞發生凋亡的同時，提高凋亡相關蛋白Cyto C、caspase-3、caspase-9的表達，減少細胞內ATP含量和細胞耗氧量，誘導線粒體膜電位下降，同時誘導TSPO蛋白表達，表明Tan ⅡA具有潛在的治療肝臟腫瘤的作用，其作用機制可能與誘導細胞線粒體轉位蛋白TSPO及線粒體功能障礙有關。