RNA去甲基化酶FTO抑制劑對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞功能的影響

吳潤(rùn)秋，田 聰，張 旭，于如同，

(徐州醫(yī)科大學(xué) 1.第一臨床學(xué)院，2.附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 徐州 221002)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是惡性程度最高的原發(fā)性腦腫瘤，但盡管采用手術(shù)、放療和化療等綜合療法，其中位生存期仍小于15個(gè)月，5年生存率低于6%[1-2]。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是目前GBM化療的一線藥物，能使DNA甲基化導(dǎo)致DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)失效，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡[3]。在GBM中存在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞(glioblastoma stem cells，GSC)亞群，GSC具有高度致瘤、自我更新和多向分化能力。GSC被認(rèn)為是促使GBM發(fā)生、發(fā)展、侵襲、抗治療和惡性復(fù)發(fā)的驅(qū)動(dòng)力，對(duì)各種殺傷腫瘤細(xì)胞的理化因素不敏感。這提示抑制GSC的自我更新能力和多向分化，能夠減慢腫瘤的進(jìn)展[4-6]。因此，根除GSC有助于消除GBM的形成與復(fù)發(fā)，對(duì)靶向GBM的治療非常重要。

N6-甲基酰胺(m6A)是真核生物mRNA和非編碼RNA中含量最豐富的內(nèi)部修飾，對(duì)RNA上m6A修飾的精確調(diào)控在各種生物和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7-8]。m6A去甲基化酶(the fat mass and obesity-associated gene，F(xiàn)TO)在調(diào)控GBM惡性增殖及維持GSC干性中具有重要作用[4，9]。FB23-2是FTO的選擇性抑制劑，能發(fā)揮出良好的抗白血病作用，還可抑制白血病干細(xì)胞的自我更新能力[10]。

本研究分析了m6A去甲基化酶FTO抑制劑FB23-2對(duì)GSC活性和自我更新能力等功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞GSC1和GSC2從膠質(zhì)瘤組織中分離獲得，U251及U87細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。FB23-2(成都華田生物技術(shù)有限公司)，TMZ(上海陶術(shù)生物科技有限公司，T1178)，均溶于DMSO配成50 mmol·L-1母液；層黏蛋白(美國(guó)Corning公司，354232)，BCA試劑盒(上海碧云天生物科技公司，P0010)，細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(CCK-8試劑盒，VICMED公司，VC5001L)，EdU試劑盒(廣州銳博生物科技有限公司，C10310-1)，EGF和bFGF(美國(guó)PeproTech公司，96-AF-100-15-100，96-100-18B-100)，Accutase、B27和Neurobasal培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司，A11105-01，GB17504-044，21103-049)，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司，556547)。

1.2 主要儀器多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，電泳槽、電泳儀及ChemiDocTM觸摸成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司)，倒置顯微鏡(IX53)及熒光倒置顯微鏡(IX71+DP721)(日本Olympus公司)，F(xiàn)acs Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞接種到含有20 μg·L-1EGF、20 μg·L-1bFGF、2% B27的Neurobasal培養(yǎng)液中，置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待GSC長(zhǎng)成懸浮球狀態(tài)，選取生長(zhǎng)合適的GSC用于各類實(shí)驗(yàn)。

1.3.2免疫熒光 提前用5×104μg·L-1的層黏蛋白包被的爬片放置在24孔板內(nèi)，將干細(xì)胞接種在24孔板內(nèi)，待細(xì)胞黏附在爬片后，多聚甲醛固定45 min，0.1% Triton X-100通透20 min，1% BSA封閉2 h，一抗孵育過(guò)夜，PBS洗2遍，熒光二抗避光孵育2 h，PBS洗2遍，DAPI染15 min，洗2遍后取出爬片，熒光顯微鏡下拍攝照片。

1.3.3Western blot 使用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種6孔板內(nèi)，約106個(gè)細(xì)胞，待普通細(xì)胞貼壁后收取細(xì)胞蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，配平濃度，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，3% BSA室溫封閉2 h，一抗4 ℃搖床過(guò)夜孵育，1× TBST洗3遍，每遍10 min，二抗室溫孵育2 h，1× TBST洗3遍，然后顯影。

1.3.4CCK-8實(shí)驗(yàn) 將GSC接種于96孔板，每孔6 000 個(gè)細(xì)胞，加入不同濃度的FB23-2/TMZ處理72 h后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，混勻后避光孵育30～60 min，然后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的吸光值(OD)。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白對(duì)照OD)/(對(duì)照組OD-空白對(duì)照OD)×100%。

1.3.5神經(jīng)球形成實(shí)驗(yàn) 取直徑大概200 μm的細(xì)胞球的GSC，用Accutase常規(guī)消化GSC，在96孔板中以1 000個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)接種，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均重復(fù)3個(gè)孔，將不同濃度的FB23-2加入實(shí)驗(yàn)組，混勻培養(yǎng)，每3 d添加50 μL新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至7～10 d，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6EdU參入實(shí)驗(yàn) 將干細(xì)胞接種于用5×104μg·L-1的層黏蛋白包被的96孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的FB23-2。培養(yǎng)72 h后，用EdU培養(yǎng)基(50 μmol·L-1)孵育2 h，再使用4%多聚甲醛的PBS固定30 min，PBS清洗后，用0.5%的Triton X-100處理10 min。PBS清洗后，用1×Apollo?反應(yīng)液避光孵育30 min，DAPI染色15 min。PBS清洗3次，最后1次液體留在孔內(nèi)，在熒光顯微鏡下拍照。

1.3.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取直徑大概200 μm的細(xì)胞球，用Accutase常規(guī)消化，在6孔板中以每孔約1×105個(gè)細(xì)胞接種，將0.1% DMSO加入對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的FB23-2藥物，混勻培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，用冰PBS洗滌細(xì)胞兩次，用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)并用流式細(xì)胞軟件分析細(xì)胞凋亡比例。

2 結(jié)果

2.1 GSC鑒定及FTO的表達(dá)量檢測(cè)CD133和Nestin是鑒定GSC的分子標(biāo)志物。如Fig 1A所示，GSC1和GSC2均穩(wěn)定表達(dá)CD133和Nestin兩種干細(xì)胞標(biāo)記物。同時(shí)，我們檢測(cè)了FTO在不同細(xì)胞株內(nèi)的表達(dá)情況，F(xiàn)ig 1B顯示，F(xiàn)TO在不同細(xì)胞株表達(dá)量不同，相對(duì)于U251和U87細(xì)胞，在GSC細(xì)胞內(nèi)表達(dá)更高。說(shuō)明FTO在GSC中表達(dá)較高，可能是潛在的治療靶點(diǎn)。

Fig 1 GSC identification and FTO expression in cells

2.2 FTO抑制劑FB23-2對(duì)GSC活性的影響為評(píng)估FTO抑制劑FB23-2對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞活性的影響，我們使用CCK-8法檢測(cè)不同濃度FB23-2及TMZ處理后GSC1、GSC2的細(xì)胞活性，如Fig 2結(jié)果顯示，GSC對(duì)TMZ的敏感性不同，GSC1明顯耐藥，而GSC2較為敏感；而FB23-2能夠有效抑制兩種GSC的活性，且呈濃度依賴性抑制，其IC50分別為7.11 μmol·L-1和4.63 μmol·L-1。

Fig 2 The inhibitory effect of FB23-2 on GSC activity

2.3 FB23-2可抑制GSC克隆形成能力FB23-2/TMZ(4、8 μmol·L-1)處理GSC 7 d后，倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)球的形成情況。如Fig 3顯示，與對(duì)照組相比，TMZ對(duì)GSC1成球能力的抑制不明顯，但能抑制GSC2神經(jīng)球的大小和數(shù)量；而FB23-2處理組的兩種GSC神經(jīng)球的大小和數(shù)量較對(duì)照組明顯減少。這表明FB23-2能明顯抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞神經(jīng)球形成能力。

Fig 3 The effect of FB23-2/TMZ on GSC neural sphere formation detected by sphere formation assay(10×)

2.4 FB23-2能夠有效抑制GSC的自我更新能力為進(jìn)一步評(píng)估FB23-2對(duì)GSC自我更新的影響，我們采取體外有限稀釋實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)GSC的自我更新能力。在2、4、8 μmol·L-1濃度的FB23-2處理7 d后，如Fig 4顯示，F(xiàn)B23-2處理組的細(xì)胞自我更新能力較對(duì)照組顯著降低，且呈濃度依賴性。

Fig 4 Inhibition of GSC self-renewal by FB23-2 analyzed by limited dilution assay in vitro

2.5 FB23-2可抑制GSC的增殖為評(píng)估FB23-2對(duì)GSC增殖的影響，我們使用EdU 摻入增殖實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。如Fig 5所示，F(xiàn)B23-2(4、8 μmol·L-1)處理72 h后，熒光顯微觀察顯示，對(duì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，處理組分別為(70.59±13.74)%和(50.33±4.53)%。因此，F(xiàn)B23-2可以明顯抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖活性，而且呈劑量依賴性。

Fig 5 Inhibition of GSC proliferation by FB23-2 by EdU method (10×)

2.6 FB23-2誘導(dǎo)GSC的凋亡為評(píng)估GSC的凋亡是否受到FB23-2影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4、8 μmol·L-1處理72 h后的GSC。如Fig 6顯示，處理組細(xì)胞的凋亡率分別為(12.16±1.90)%、(16.77±1.17)%，這表明FB23-2可誘導(dǎo)GSC的凋亡。

3 討論

GBM是侵襲性最強(qiáng)的腦惡性腫瘤，但目前依然缺乏有效的治療措施[11-12]。目前認(rèn)為，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新和無(wú)限增殖與腫瘤治療的化療耐藥密切相關(guān)的因素之一，耐藥已經(jīng)成為目前腫瘤化療的難題[13-14]。因此，亟需新型小分子靶向藥物來(lái)提高GBM治療療效。在本研究中，我們證明FTO抑制劑FB23-2可調(diào)控GSC的細(xì)胞活性、成球、自我更新、增殖、以及凋亡功能。

m6A是真核生物中最豐富的內(nèi)部mRNA修飾，能夠影響各種生物過(guò)程，在控制胚胎干細(xì)胞多能性和分化中發(fā)揮重要的作用[15]。m6A甲基化與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，臨床數(shù)據(jù)分析顯示與預(yù)后和治療策略的制定也緊密相關(guān)[16]。m6A甲基化修飾主要是由一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物來(lái)催化，該復(fù)合物包含甲基轉(zhuǎn)移酶樣3(METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶樣14(METTL14)和Wilm腫瘤-1相關(guān)蛋白(WTAP)。METTL3或METTL14表達(dá)的敲除降低m6A mRNA水平，促進(jìn)GSC在體外的生長(zhǎng)和自我更新，促進(jìn)GSC在體內(nèi)形成腦腫瘤的能力，過(guò)表達(dá)METTL3或METTL14或抑制FTO能明顯抑制腫瘤進(jìn)展并延長(zhǎng)GSC移植小鼠的壽命[4，17]。

Fig 6 Effect of FB23-2 on GSC apoptosis analyzed by flow cytometry

FTO被鑒定為第一個(gè)使mRNA中的m6A氧化去甲基化的RNA去甲基化酶，參與各種疾病過(guò)程[17]。GSC有獨(dú)特的m6A RNA甲基化模式，以及對(duì)這種細(xì)胞狀態(tài)特異性甲基化模式的翻譯反應(yīng)有明顯的差異；FTO識(shí)別結(jié)合m6A靶標(biāo)后RNA甲基化峰值丟失，能提高其翻譯效率[18]。FTO抑制劑FB23-2可通過(guò) MYC、CEBPA、RARA和ASB2等FTO下游靶點(diǎn)，顯著抑制白血病干細(xì)胞的自我更新能力，表明FTO可能是白血病干細(xì)胞中一個(gè)潛在的分子靶點(diǎn)，以抑制白血病的發(fā)生[10]。本研究表明，抑制FTO能夠有效的抑制GSC的生長(zhǎng)、自我更新以及神經(jīng)球的形成，且有一定劑量依賴性。同時(shí)，F(xiàn)B23-2還能抑制GSC的細(xì)胞增殖，促進(jìn)GSC的細(xì)胞凋亡。

綜上，F(xiàn)B23-2作為FTO的特異性小分子靶向抑制劑，能夠有效的抑制GSC的生長(zhǎng)、自我更新、增殖及凋亡等功能。本研究為FB23-2治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，靶向FTO可能是清除膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的潛在策略。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在徐州醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)外科實(shí)驗(yàn)室完成，感謝各位老師的幫助。)