左旋紫草素抑制NF-κB信號通路保護LPS/D-GalN誘導的小鼠急性肝損傷

侯金秋，鄒 楠，袁今奇，杜夢鴿，張 薇，秦冬梅

(1.石河子大學藥學院/新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002；2.石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆 石河子 832002；3.新疆全安藥業股份有限公司，新疆 庫爾勒 841011)

急性肝損傷(acute liver failure,ALF)是一種致死性臨床綜合征，其病理特征是廣泛的肝細胞壞死、劇烈的氧化應激和持續的炎癥反應[1]，引起急性肝損傷的因素較多，其中爆發性肝臟炎癥是引起肝臟急性衰竭的主要原因[2]。研究表明[3]，在ALF發病進程中，全身炎癥反應的嚴重失調是導致大多數患者死亡的主要原因。炎癥反應的特征是巨噬細胞的積累和激活[4]，在ALF的早期階段，大量的肝巨噬細胞被激活，通過過度產生促炎細胞因子和介質進一步導致炎癥的傳播和持續[5]，從而加重疾病進程。因此，巨噬細胞的活化和ALF的發展密切相關。

革蘭陰性細菌外壁層中的成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是一種內毒素，可以誘導激活巨噬細胞活化并與巨噬細胞表面的TLR4受體結合[6]，從而進一步激活該受體介導的下游MAPK/NF-κB信號通路，使得NF-κB信號通路中的IKK激酶激活，從而導致IκB蛋白磷酸化，磷酸化的IκB蛋白泛素化降解，使得NF-κB二聚體釋放后轉移到細胞核中，其中MAPK是NF-κB的上游激動劑，參與調控NF-κB通路的激活[7]，NF-κB p65的激活可以進一步促進巨噬細胞分泌細胞炎癥因子，從而加重炎癥反應，NF-κB p65主要參與炎癥和免疫反應的調節。同時研究發現，LPS是肝損傷發病機制中的關鍵因素，而D-氨基半乳糖(一種特定肝毒素)D-GalN和LPS聯合使用時又能加強LPS的急性毒性，因此，使用D-GalN結合LPS可以成功誘導動物肝損傷模型，該模型也與人類肝炎模型非常相似[8]。目前，ALF死亡率高，迫切需要找到有效的藥物來改善急性肝損傷和避免嚴重并發癥的產生，研究巨噬細胞引起的炎癥反應可能是一種治療ALF很有前途的治療策略。

L-SK是從紫草科植物紫草萘醌類成分中提取分離得到的單體化合物，其具有較好的藥理作用，包括抗菌、抗炎、抗腫瘤[9-10]等作用，本課題組在前期研究發現L-SK對于ConA誘導的小鼠免疫性肝損傷具有較好的保護作用[11]，同時初步判斷其有一定的抗炎作用，但對于L-SK的具體抗炎機制尚未闡明。前期研究考察的是免疫性肝損傷，本文探討的是急性肝損傷，同時本文細胞與動物實驗均采用LPS誘導，對于詮釋在炎癥相關肝損傷更具說服力，因此本研究主要探究左旋紫草素紫草抗炎保肝作用機制。

本研究擬通過建立誘導RAW264.7巨噬細胞炎癥模型以及LPS/D-GalN誘導的急性肝損傷模型，從炎癥角度進一步闡明L-SK的抗炎保肝作用機制，為其進一步開發提供實驗依據。

1 試劑與儀器

1.1 實驗動物80只SPF級♂ C57BL/6小鼠(20～22) g，均購自新疆維吾爾自治區實驗動物研究中心，生產許可證號：SCXK(新)2016-0001，使用許可證號：SYXK(新)2016-0001，該動物實驗在新疆醫科大學動物實驗中心進行，按照國家實驗室動物飼養管理規范飼養，并經石河子大學醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會審核批準(批準號為：A2018-047-01)。

1.2 藥品與試劑左旋紫草素(110769)購自上海源葉公司；小鼠巨噬細胞株(RAW264.7)(新疆自治區藥物研究所惠贈)；胎牛血清(FBS)(1828728)、胰酶(2193232)、DMEM Basic培養基(C11995500BT)均購自Gibco；HIFIScript cDNA Synthesis Kit(批號：CW2569M)購自康為世紀；QPCR引物購自生工生物公司；MTT試劑盒(20181224)；脂多糖(620V0324)、青霉素-鏈霉素雙抗(10000 u)購自Solarbio公司；TRNzol Universal Reagent試劑(80802)購自Ambion公司；ECL超敏發光液(202003)購自北京普利萊基因技術有限公司；INOS(10120S)、p-ERK1/2(4070T)、p-p38(4511T)、p-JNK(4668T)抗體均購自CST公司，COX-2(BS90326)購自Bioworld；ERK1/2(AM076)、p38(AM065)、JNK(AJ518)、p-p65(042919190703)、p65(031219190718)、p-IKKα/β(111518190703)、IKKα(102318190718)、IKKβ(111617190718)、GAPDH(070320200902)抗體均購自碧云天，山羊抗兔lgG/la辣根酶標記(214120813)購自中杉金橋；D-氨基半乳糖(011421210405)購自Bioworld；水飛薊賓(H20040299)購自天津天士力圣特制藥，MDA(批號20210616)、SOD(批號20210607)、AST(批號20210122)、ALT(批號20210123)、AKP(批號20210115)均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器臺式離心機(上海安亭科學儀器廠，TDL-50型)；旋渦混勻器(江蘇海門其林醫用儀器廠，TS-8型)；電子天平(上海精密科學儀器有限公司，FA210B)；分析天平(德國Sartorius賽多利斯，BP211D型)；全波長掃描多功能讀數儀(賽默飛世爾科技有限公司，3001 型)；PCR熒光定量儀(美國羅氏，LightCycler 480)；核酸蛋白檢測儀(美國QUAWELL公司，Q5000型)；凝膠成像系統(美國UVP公司，EC3600型)；梯度基因擴增儀(北京大龍，TC1000-G)；超凈工作臺(型號：BCM1300，蘇潔醫療器械有限公司)，CO2恒溫培養箱(型號：3111型，賽默飛世爾科技有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組及處理將80只♂ C57BL/6隨機分為5組，每組16只，分別為正常組、模型組、L-SK高劑量組(8 mg·kg-1)、L-SK低劑量組(2 mg·kg-1)、陽性藥物組(水飛薊賓60 mg·kg-1)，正常對照組、模型組小鼠每天同一時間灌胃生理鹽水0.2 mL/只，L-SK高劑量組、低劑量組、陽性對照藥1 d1次，連續灌胃14 d。末次給藥2 h后，除正常對照組外，其余各組腹腔注射LPS(10 μg·kg-1)和D-GalN(700 mg·kg-1)，正常對照組腹腔注射等量生理鹽水，使小鼠形成急性肝損傷模型。禁食不禁水，觀察小鼠狀態，6 h后處死一半小鼠進行采血，解剖取其肝臟、脾臟組織，另一半小鼠用于檢測生存率。

2.2 肝脾指數的測定每只實驗小鼠處死前進行稱重，取出肝臟和脾臟組織，用生理鹽水洗凈后濾紙擦干，分別稱重，記錄重量。肝脾指數按照以下公式進行計算： 肝指數/%=肝臟體質量/小鼠體質量×100，脾指數/%=脾臟體質量/小鼠體質量×100%。

2.3 動物相關指標檢測造模6 h結束后將小鼠稱質量，然后進行眼眶取血，置冰上30 min，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，分裝血清置于4 ℃冰箱備用檢測。取小鼠肝臟組織0.1 g，用4 ℃冷生理鹽水洗凈，加10倍量冰冷生理鹽水，冰水浴下進行勻漿，然后置于4 ℃冷凍離心機中，以3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，存于4 ℃下保存待測。取分裝好的血清進行AST、ALT以及AKP酶活性檢測，具體操作步驟按照說明書進行；將肝組織勻漿進行蛋白定量后，按照試劑盒說明書檢測肝組織勻漿中的NO含量、丙二醛(MDA)含量和總超氧化物歧化酶(SOD)活性。

2.4 肝臟組織HE染色取小鼠肝臟組織，置4%多聚甲醛中固定,用石蠟包埋組織進行切片，常規HE染色觀察組織病理學變化。

2.5 細胞處理將RAW264.7細胞分為正常對照組：在37 ℃、5% CO2培養條件下，用含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養基中培養細胞RAW 264.7細胞；脂多糖組：細胞培養24 h后，加入終濃度為1 mg·L-1LPS繼續培養0.5、6、24 h；L-SK組：細胞培養24 h后，先加入50、100、200 μmol·L-1的L-SK溶液預處理30 min，然后加入終濃度為1 mg·L-1LPS繼續培養0.5、6 、24 h。

2.6 細胞活性檢測取對數生長期的RAW264.7細胞，按照1×105接種于96孔培養板中孵育過夜，棄去培養液，除空白對照組外，其余孔加入含不同濃度L-SK的培養基培養細胞24 h后棄去培養基，加入含10% MTT溶液的新鮮培養基于每孔200 μL，孵育4 h后棄去MTT試劑，每孔加入110 μL DMSO溶解液裂解細胞，于搖床上搖晃10 min后，在波長490 nm處測量吸光度A(λ)490值，按下列公式計算細胞存活率。

存活率/%=(A藥物組值/A對照組值)×100%

2.7 NO實驗細胞處理中加入終濃度為1 mg·L-1LPS培養24 h后，取100 μL細胞培養上清液與100 μL的Griess 試劑混合。5 min內于550 nm波長處使用酶標儀測量每孔的吸光度(A)值，通過標曲計算各組NO含量。

2.8 實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測細胞處理中加入終濃度為1 mg·L-1LPS培養6 h后，按照TRIzol法提取細胞總RNA后，測定RNA濃度，按照反轉錄試劑盒HIFIScript cDNA Synthesis Kit將RNA反轉為cDNA，按說明書于熒光定量PCR儀上檢測各組的INOS、COX-2、IL-6、IL-1β、TNF-α以及IFN-β的mRNA表達，反應條件為95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；57 ℃，15 s；72 ℃，15 s,擴增45個循環，最終72 ℃延長10 min，該實驗數據采用的定量數據分析方法是2-ΔΔCT法，各組引物序列如下[12]：INOS上游：5′- CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAG-3′，下游：5′- GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3′，COX-2上游：5′-CACTACATCCTGACCCACTT-3′，下游：5′-ATGCTCCTGCTTGAGTATGT-3′GAPDH上游：5′-AGGAGAGTGTTTCCTCGTCC-3′，下游：5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTCG-3′；IL-6上游：5′- CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3′，下游：5′-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3′；IL-1β上游：5′-TGCAGAGTTCCCCAACTGGTACA-3′，下游：5′- GTGCTGCCTAATGTCCCCTTG-3′；TNF-α上游：5′-TCAGCCTCTTCTCATTCCTG-3′，下游：5′-TGAAGAGAACCTGGGAGTAG-3′；IFN-β上游：5′- CTGCGTTCCTGCTGTGCTTC-3′，下游：5′- CGCCCTGTAGGTGAGGTTGAT-3′。

2.9 Western blot檢測蛋白表達水平細胞處理中加入終濃度為1 mg·L-1LPS培養30 min后，進行蛋白定量后加上樣緩沖液，沸水煮沸20 min，即可用于Western blot蛋白檢測，常規進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉后放入一抗中4 ℃過夜孵育，d 2用TBST洗PVDF膜3次后放入二抗孵育1 h后，TBST洗膜3次用凝膠成像系統UVP采集蛋白條帶，用ImageJ軟件進行定量分析，計算各組目的條帶與內參GAPDH的比值，或磷酸化目的蛋白與非磷酸化蛋白的比值來反映目的蛋白的相對表達水平。一抗根據1∶1 000(ERK1/2)、1∶1 000(p-ERK1/2)、1∶1 000(JNK)、1∶1 000(p-JNK)、1∶1 000(p38)、1∶1 000(p-p38)、1∶1 000(INOS)、1∶1 000(COX2)、1∶1 000(p65)、1∶1 000(p-p65)、1∶1 000(p-IKKα/β)、1∶1 000(IKKα)、1∶1 000(p-IKKβ)、1∶2 000(GAPDH)以及1∶5 000(二抗)的稀釋比例進行孵育。

3 結果

3.1 L-SK緩解LPS/D-GalN所致的小鼠急性肝損傷注射完造模藥后觀察小鼠的狀態，結果表明，模型組的24 h生存率為0，L-SK給藥組明顯提高動物生存率，其中陽性藥組和L-SK高劑量組作用明顯(Fig 1A)。與正常組相比，模型組小鼠的肝臟、脾臟指數明顯增加(P<0.05或P<0.01)，說明造模成功。與模型組相比，L-SK低、高劑量組和陽性藥組的肝臟指數有所降低，但差異無顯著性(P>0.05)，而L-SK給藥組以及陽性藥組均明顯降低脾臟系數(P<0.01)(Fig 1B和1C)。小鼠血清轉氨酶及AKP酶的異常升高，說明肝臟實質受到損傷，肝臟細胞受損，本研究中，模型組小鼠血清中的AST、ALT及AKP酶均明顯增加(P<0.01)，其中L-SK各劑量組能明顯降低AST、ALT及AKP的活性(P<0.05或P<0.01)，陽性藥物組均能極明顯降低小鼠血清中的AST、ALT及AKP酶活性(P<0.01)(Fig 1D～F)。

Fig 1 Effect of L-SK on LPS/D-GalN-induced acute liver injury in

3.2 L-SK改善LPS/D-GalN所致急性肝損傷小鼠的肝功能研究發現NO含量可預測肝臟損傷程度，并且MDA含量升高和SOD酶活性降低均表明肝臟組織發生氧化損傷。本研究中LPS/D-GalN誘導的模型組小鼠肝臟組織上清中的NO和MDA含量均明顯增加(P<0.01)，SOD酶活性明顯降低(P<0.01)，與模型組相比，L-SK治療組均能明顯降低NO含量(P<0.01)和MDA含量(P<0.05)(Fig 2A和Fig 2B)，且呈一定的劑量依懶性，SOD酶的活性明顯升高(P<0.01)，陽性藥物組均能明顯降低小鼠肝組織上清中NO含量和升高SOD酶的活性(P<0.01)(Fig 2A和Fig 2C)。此實驗結果表明,L-SK通過影響氧化/抗氧化平衡從而對LPS/D-GalN所致急性肝損傷起到保護作用。

通過對小鼠肝臟組織進行HE染色后發現，正常組小鼠肝臟表面光滑、質地堅韌、色澤紅潤、鏡頭下觀察肝細胞大小均一，結構正常、排列有序、且細胞核位于肝細胞中央，炎癥細胞浸潤較少，模型組小鼠肝臟組織充血嚴重，表面粗糙，顏色發暗，為黑紅色，鏡下觀察肝組織結構異常，肝細胞排列紊亂，肝索異常，肝細胞明顯變性，胞質內充滿小氣泡且有明顯的紅染，炎性細胞浸潤明顯。L-SK低、高劑量組相較于模型組，其肝組織有所改善，尤其是高劑量組，肝細胞排列比較均勻，肝細胞胞質均勻且間隔變窄，炎性浸潤明顯減輕，陽性藥相對于模型組也具有明顯改善，其肝臟細胞的形態基本正常，炎性浸潤程度明顯減輕，細胞間隙也較窄，有輕微的腫脹(Fig 2D)。

Fig 2 Effects of L-SK on oxidative indices and liver tissue injury in

3.3 L-SK對RAW264.7細胞活性和釋放NO的影響細胞存活率實驗表明，細胞在0 μmol·L-1至200 μmol·L-1的范圍內，各劑量組對Raw264.7巨噬細胞無細胞毒性，無統計學意義(P>0.05)(Fig 3A)，濃度計量范圍參考本課題組前期研究[11]。NO結果顯示，與模型組比較，L-SK在50 μmol·L-1、100 μmol·L-1以及200 μmol·L-1均能夠明顯降低NO水平(P<0.01)，且呈現一定的濃度依賴性(Fig 3B)。

Fig 3 Effect of L-SK on NO

3.4 L-SK對RAW264.7細胞炎癥基因mRNA表達水平影響本研究進一步探究了L-SK在LPS刺激6 h后的炎癥相關基因的mRNA表達水平變化，在LPS刺激下，模型組的INOS、COX-2、IFN-β、IL-6、TNF-α及IL-1β的mRNA水平相較于空白對照組明顯升高(P<0.01)，與模型組比較，L-SK的高劑量組極明顯下調IFN-β和TNF-α的mRNA水平(P<0.01)，明顯下調INOS和COX-2的mRNA水平(P<0.05)，L-SK的中、高劑量組均能極明顯下調IL-6及IL-1β的mRNA水平(P<0.01)。這些結果表明，L-SK能夠通過抑制炎癥基因的表達發揮其抗炎作用(Fig 4)。

Fig 4 Effect of L-SK on expression of relevant

3.5 L-SK對RAW264.7細胞中的MAPK/NF-κB通路蛋白表達影響本實驗探究了L-SK對RAW264.7細胞MAPK/NF-κB通路中的INOS、COX-2、p38、ERK1/2、JNK、p65和IKKα/β蛋白表達。Western blot結果顯示，與空白組比較，模型組中的INOS、COX-2的蛋白水平明顯升高(P<0.01)，與模型組比較，L-SK高劑量組能夠極明顯下調INOS蛋白水平(P<0.01)(Fig 5A)，中、高劑量組能夠明顯下調COX-2的蛋白表達(P<0.01)(Fig 5B)；在MAPK信號通路中，與空白組比較，模型組的p-p38、p-ERK1/2的蛋白表達水平均極明顯上調(P<0.01)，但L-SK各劑量組與模型組比較差異均無顯著性(P>0.05)并且L-SK給藥后p-JNK蛋白表達水平明顯升高(Fig 5C)；在NF-κB信號通路中，模型組的p-p65和p-IKKα/β的蛋白表達水平相較于空白組均極明顯上調(P<0.01)，與模型組比較，L-SK的高劑量組能明顯下調的p-IKKα/β蛋白表達(P<0.01)，L-SK中、高劑量組均明顯下調p-p65蛋白水平(P<0.01)(Fig 5D)。Western blot結果表明L-SK發揮抗炎作用是通過下調NF-κB通路中INOS、COX-2、p-p65和p-IKKα/β的蛋白表達，對于MAPK信號通路蛋白無明顯抑制作用。

Fig 5 Effect of L-SK on LPS-induced protein expression in RAW264.7 cells

4 討論

急性肝損傷(ALF)是致命的臨床綜合征之一，其特點是肝功能迅速惡化導致肝性腦病，全身炎癥反應綜合征甚至多器官衰竭，從而對患者生命構成嚴重威脅[1]。常見的ALF造模方法較多，其中LPS聯合D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-GalN)是一種經典的ALF誘導方法[8]，D-GalN是一種強效的RNA合成抑制劑，可導致肝細胞出現不可逆的損傷以及巨噬細胞浸潤[13]。LPS是一種內毒素，可以引起免疫刺激的級聯反應，其中LPS誘導激活巨噬細胞產生炎癥反應，是經典的體外炎癥模型[6]，而D-GalN和LPS聯合使用時又能加強LPS的急性毒性。因此，本研究通過建立LPS刺激RAW264.7巨噬細胞的體外炎癥模型以及建立LPS/D-GalN誘導的小鼠體內急性肝損傷模型，探討L-SK抗炎保肝作用及其作用機制。

體內實驗采用LPS/D-GalN誘導的小鼠急性肝損傷模型，本研究中我們發現L-SK能明顯提高小鼠存活率，降低模型小鼠血清中的的AST、ALT、AKP酶活性，該實驗結果表明L-SK具有一定的保肝作用。我們研究還發現小鼠組織中的NO含量明顯降低，NO可與過氧化物結合生成過氧亞硝酸鹽化合物，是氧化損傷的主要自由基之一，可預測肝臟損傷程度[14]；同時發現小鼠組織中的MDA的含量明顯降低，SOD酶活性明顯提升，MDA可以間接反映氧化損傷的嚴重程度，SOD可以阻斷脂質過氧化反應的發生，維持機體代謝平衡，當機體發生氧化應激時，MDA含量升高，SOD活性降低，自由基的積累將使細胞膜的脂質發生過氧化作用進一步加重而引起膜裂變, 從而導致細胞損傷甚至死亡[15]，該實驗結果表明L-SK可以通過改善氧化損傷起到保肝作用，同時給藥組可不同程度恢復肝功能異常，減輕肝臟炎癥。以上結果均表明，L-SK對ALF具有一定的治療作用，通過改善組織的炎癥反應及氧化損傷從而延緩疾病的發展進程。

炎癥被認為是決定了ALF的發病進程的關鍵因素，而炎癥反應的特征是巨噬細胞的積累和激活[4]，因此巨噬細胞的激活與ALF有著密切聯系。LPS誘導活化巨噬細胞后導致誘導性一氧化氮合酶(iNOS)和環氧化酶(COX-2)表達增加，INOS誘導產生的NO又可以進一步促進細胞因子如IL-6、TNF-α和IL-1β的增加[16]，從而進一步加劇炎癥反應。體外模型中，L-SK給藥組能夠明顯抑制細胞NO含量以及炎癥因子mRNA水平，并且L-SK在基因和蛋白水平上均能抑制INOS和COX-2的表達，由此可知L-SK的抗炎作用與抑制炎癥因子表達和降低促炎癥酶活性有關。在LPS誘導的炎癥反應中，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和NF-κB(nuclear factor-κB)信號通路是兩條經典的通路，其中NF-κB起到關鍵作用[17]，是炎癥反應和抗炎的中心環節，MAPK參與調控NF-κB信號通路的激活，NF-κB通路的激活促使NF -κB p65與NF-κB p65 抑制劑(IκB)二聚體分離,并由胞質向胞核轉移[7]，MAPK和NF-κB的磷酸化均能夠促使炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β的釋放[18]，進一步加重炎癥反應。我們考察了L-SK對兩條信號通路的作用，結果發現，模型組細胞的MAPK及NF-κB信號通路均被激活，磷酸化的ERK1/2、JNK、p38、p65和IKKα/β蛋白表達明顯上調，L-SK給藥后MAPK信號通路相關蛋白與模型無變化，然而L-SK給藥組明顯抑制了磷酸化的p65和IKKα/β蛋白表達，因此我們得出結論，L-SK發揮抗炎作用是通過抑制NF-κB信號通路中的p65和IKKα/β蛋白的表達，對于MAPK信號通路幾乎無作用(Fig 6)。

Fig 6 Anti-inflammatory mechanism diagram

綜上所述，本文研究結果證明，L-SK主要是通過抗炎作用進行預防和保護由LPS/D-GalN誘導的小鼠急性肝損傷，其抗炎作用是抑制炎癥因子的表達以及相關蛋白表達，作用機制可能與降低COX-2、iNOS酶蛋白的表達，調控NF-κB信號通路相關，該研究為后續臨床開發用藥提供理論依據。