新型磷酸二酯酶5抑制劑CPD1對單側輸尿管梗阻引起的腎間質纖維化小鼠治療作用

劉傲璐，任 倩，封文斌，李 斌，陳心慧，李思蓉，趙子建，穆云萍，李芳紅

(1.廣東工業大學生物醫藥學院，廣東 廣州 510006，2.南方醫科大學，南方醫院腎內科，器官衰竭防治國家重點實驗室，國家腎臟病臨床醫學研究中心，廣東 廣州 510515)

腎間質纖維化是各種慢性腎臟疾病發展到末期的共同病理結果，常伴有腎小管萎縮和細胞外基質ECM(纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原)沉積、肌成纖維細胞數量增加、毛細血管閉塞、大量炎癥細胞浸潤，其纖維化程度與腎功能衰竭程度密切相關[1]。全世界70歲以上的成年人中，有一半患有慢性腎病，占總人口的10%[2]。目前還沒有減緩腎纖維化的靶向治療方法，很大一部分慢性腎病患者最終發展為終末期腎功能衰竭，只能依賴透析或腎移植維持生命。隨著全世界腎衰竭發生率的不斷上升，慢性腎病已成為一個重大的公共衛生問題，預防或延緩導致終末期腎衰竭的腎功能不全是慢性腎病藥物研發的最重要目標。因此，開發有效的治療藥物對于阻止疾病惡化至關重要。單側輸尿管梗阻(unilateral ureteric obstruction，UUO)模型是目前研究最廣泛的腎間質纖維化動物實驗模型，該模型造模時間短，重復性好，可很好的模擬臨床上輸尿管梗阻性疾病以及腎纖維化的過程[3]。

磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDEs)抑制劑是一種抑制PDEs活性的藥物，廣泛應用于勃起功能障礙、肺動脈高壓、心衰、哮喘等疾病中[4]。越來越多的研究顯示，PDE5抑制劑他達拉非[5]、西地那非、伐地那非[6]具有改善腎纖維化的作用。而傳統的PDE5抑制劑選擇性低、水溶性差、半衰期短(西地那非)，導致生物利用度低、副作用強，因此，本課題組在中國專利(CN102020645A)[7]公開的西地那非類似物WYQ基礎上，對其結構繼續進行優化改造，通過成鹽和共晶篩選，最終選出優良晶型CPD1(Fig 1)，其水溶性及腸溶性得到大幅提升，降低了藥物治療劑量，從而提升生物利用度[8]。本課題組前期研究已經證實，CPD1可通過抑制肺動脈高壓模型大鼠的肺動脈平滑肌細胞中鈣通道功能治療肺動脈高壓[9]，因此，本研究繼續探索了CPD1在腎臟疾病中發揮的作用。

Fig 1 The structural formula of CPD1

本研究使用UUO小鼠模型，觀察新型PDE5抑制劑CPD1對腎纖維化病理學組織結構的改善，膠原纖維的沉積以及纖維化標志蛋白和腎損傷分子表達水平的影響。初步驗證CPD1對腎間質纖維化的治療作用，為進一步探討CPD1作用于腎間質纖維化的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 ♂ C57BL/6 J小鼠(8周齡)，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(43072711100365523)，飼養于廣東藥科大學實驗動物中心，SYXK(粵)2017-0125。本實驗方案嚴格遵循廣東藥科大學動物倫理委員會(編號：gdpulacspf2017027)制定的動物護理方針。

1.1.2試劑 CPD1(ET32637-37-P1)委托天津藥明康德新藥開發有限公司合成，CPD1經COA分析測定純度達99%。青霉素、二甲苯、無水乙醇購自美國sigma aldrich公司。SDS、甘氨酸、吐溫20、30%Acrylamide、1.0 mol·L-1Tris-HCl(pH 6.8)、1.5 mol·L-1Tris-HCL(pH8.8)、40×TBST粉劑均購自上海生工生物技術有限公司。HE染色試劑盒(C0105)，Sirius Red試劑盒(Solarbio，G1470)，SP試劑盒(中杉金橋，SP-9001)，DAB(中杉金橋，ZLI-9017)，RIPA裂解液(碧云天P0013B)、磷酸酶蛋白酶抑制劑(碧云天P1051)、PMSF(碧云天ST506)。一抗：α-SMA(CST 19245)、FN(ab 2413)、Collagen-I(CST 91144)、Kim-1(R&D AF1817)、α-tubulin(sigma T5168)，二抗(JAX 111-035-003)。脫脂奶粉，BSA(上海生工)。

1.1.3儀器 分析天平(BP221S，德國Sartorius)，倒置顯微鏡(Leica德國)，ChemiDoc+XRS化學發光凝膠成像系統(Bio-Rad)，移液器(Eppendorf)，烘箱(DH6-9143B5-Ⅲ，上海新苗)，石蠟包埋機(MPS/P1，德國SLEE)，低溫離心機(美國Thermo)，-80 ℃冰箱(中國美菱)，純水儀(EPED-2TF)。

1.2 方法

1.2.1UUO小鼠模型的構建 將體質量為20～22 g的雄性C57BL/6 J小鼠隨機分為3組，每組6只，分別為假手術組、單側輸尿管結扎組(UUO模型組)、單側輸尿管結扎CPD1干預組(UUO+CPD1(5 mg·kg-1))。手術前稱重，用1.25%三溴乙醇腹腔注射麻醉小鼠，剔除小鼠左側腹部毛發，75%酒精常規消毒后，將小鼠右側臥固定于手術臺上。于腹部左側斜切約0.5 cm皮膚切口，逐層剪開腹壁，彎鑷撥開脂肪暴露并游離左側腎臟和輸尿管，用5-0細線將輸尿管兩點結扎后從中間剪斷。結扎成功后用抗生素清洗腹腔、逐層縫合、涂抹碘伏，并將小鼠置于恒溫墊上待其蘇醒。假手術組經過同樣的操作步驟僅游離輸尿管，不結扎。治療組：將CPD1溶于生理鹽水，于造模2 h后予以藥物灌胃治療，每天1次，持續7 d，假手術組和模型組予以同體積生理鹽水直至模型結束。

1.2.2標本收集 實驗結束時將小鼠安樂死，摘取小鼠患側腎臟，快速投入冰PBS中清洗表明血漬，摘取的腎臟沿冠狀面切開，一部分置于4%多聚甲醛固定液中固定，另一部分組織凍于液氮中保存進行后續Western blot檢測。

1.2.3腎臟HE、Sirius Red染色 腎臟組織固定24 h，常規脫水、石蠟包埋，切成厚3 μm切片，進行HE和Sirius Red染色，觀察腎臟病理形態學改變和腎臟膠原纖維的沉積。

1.2.4腎臟免疫組化染色 切片常規脫蠟至蒸餾水，PBST洗3次，抗原修復，加入金橋SP-9001試劑1阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育10 min。用山羊血清室溫封閉1 h。孵育一抗α-SMA(1 ∶100)/FN(1 ∶100) 4 ℃過夜。d 2 PBST洗3次后，滴加生物素標記山羊抗兔IgG聚合物，室溫孵育15 min，PBST洗3次。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min，PBST洗3次。DAB顯色，蘇木精復染3 min，分化、反藍、脫水、透明、封片。

1.2.5腎臟Western blot檢測 取適量腎臟組織于加入磷酸酶和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，充分研磨后，4 ℃，12 000×g，離心20 min，取上清得組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性后于 -80 ℃ 保存。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣30～40 μg總蛋白，電泳，轉膜，5%牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃過夜孵育：α-SMA(1 ∶1 000)、FN(1 ∶1 000)、collagen-I(1 ∶1 000)、Kim-1(1 ∶1 000)、α-tubulin(1 ∶5 000)，室溫孵育二抗(1 ∶5 000)1 h。點化學發光試劑曝光顯影，采用Image Lab軟件進行半定量分析。

2 結果

2.1 CPD1對UUO模型小鼠腎臟組織結構損傷的影響HE染色觀察CPD1治療對UUO小鼠患側腎臟組織結構損傷情況的影響。結果顯示：假手術組(sham)小鼠腎臟組織結構基本正常無病變，腎小管飽滿；UUO模型組小鼠組織中腎小管擴張，腎小管上皮細胞可見疏松、腫脹和空泡變性，腎小球基底膜增厚，腎臟間質炎性細胞浸潤明顯，腎間質寬度增加，纖維化明顯；與UUO模型組相比，UUO+CPD1治療組中腎小管空泡變性較少，病變程度明顯減輕(Fig 2)。提示CPD1可有效改善輸尿管梗阻引起的腎臟組織結構損傷。

Fig 2 CPD1 alleviated UUO-mediated renal pathological injuryHE staining of kidney tissue sections. Scale bar，200 μm (A) and 100 μm (B).

2.2 CPD1對UUO模型小鼠腎臟腎間質膠原纖維沉積的影響利用Sirius Red染色觀察CPD1對UUO小鼠腎臟組織膠原纖維沉積情況的影響。結果顯示：sham組小鼠患側腎臟組織結構完整，基本無紅色陽性著色，膠原陽性染色區域主要位于系膜區、腎小管間質的毛細血管周圍；UUO模型組腎臟間質及小管處可見明顯的天狼星紅陽性區域，表明有大量膠原沉積；與模型組相比，UUO+CPD1治療組中小管間質膠原沉積明顯減少(Fig 3)，表明CPD1干預可明顯減少輸尿管梗阻引起的腎間質膠原纖維沉積，延緩腎纖維化的進展。

Fig 3 CPD1 alleviated UUO-mediated renal collagen depositionSirius Red staining of kidney tissue sections. Scale bar=50 μm.

2.3 CPD1對UUO小鼠腎臟組織纖維化標志蛋白表達的影響為了進一步探究CPD1對纖維化標志蛋白表達的作用，利用免疫組化染色(IHC)和Western blot方法檢測了小鼠腎臟組織中α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、纖維連接蛋白(fibronectin，FN)、Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ)和腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，Kim-1)的分布情況及表達水平。IHC結果顯示：與sham組相比，UUO模型組腎臟間質處可見大量α-SMA(Fig 4)和FN(Fig 5)著色陽性區域；UUO+CPD1治療組中陽性著色面積明顯低于模型組(P<0.05)。Western blot結果顯示：經CPD1干預后，纖維化蛋白標志分子FN、collagen-I、α-SMA的表達水平明顯性降低，該結果與免疫組化染色結果一致。UUO+CPD1治療組中腎損傷分子Kim-1的表達也明顯低于模型組(P<0.05)(Fig 6)，提示CPD1明顯降低UUO小鼠患側腎臟組織中纖維化標志蛋白的表達，減輕輸尿管梗阻引起的腎損傷，有效延緩疾病進展。

Fig 4 Effect of CPD1 on α-SMA expression in UUO mouse kidney by IHCScale bar，200 μm (A) and 100 μm (B). Statistical analysis. **P<0.01 vs sham; #P<0.05 vs UUO (C).

Fig 5 Effect of CPD1 on Fn expression in UUO mouse kidney by IHCScale bar，200 μm (A) and 100 μm (B). Statistical analysis. **P<0.01 vs sham;#P<0.05 vs UUO (C).

Fig 6 Effect of CPD1 on protein levels of of FN，collagen-I，α-SMA，Kim-1 in UUO mouse kidney by Western blot

3 討論

腎纖維化是創面愈合過程的病理延伸，以損傷、炎癥、肌成纖維細胞激活和遷移、基質沉積和重塑為特征，是所有慢性和進行性腎病的共同最終途徑，也是腎功能不全的主要決定因素[10]。在UUO模型中，梗阻造成的壓力使輸尿管擴張，壓力傳至腎小管導致小管上皮細胞受到機械性損傷，腎小球濾過率(GFR)降低。在UUO早期的1～2 h內腎血流量(RBF)增加，隨著阻塞時間的延長，RBF逐漸減少，使毛細血管收縮導致血供不足。當腎臟輕度損傷后，由肌成纖維細胞產生的細胞外基質最初可能有助于組織修復過程，隨后即被再吸收。然而，在CKD發生的慢性損傷中，細胞外基質蛋白持續不受抑制的過度沉積，致使毛細血管稀疏，減少了腎小管周圍的血流量，導致腎小管缺氧和腎單位脫落，最終破壞器官結構、導致腎功能衰竭。因此，抑制細胞外基質的沉積是改善腎纖維化的首要目標，我們的研究結果發現，CPD1可使腎臟組織結構得到改善，降低細胞外基質膠原的沉積。α-SMA是肌成纖維細胞的特異性標志蛋白，在生理狀態下主要表達于平滑肌組織和心肌組織中，腎臟中表達較低。而在病理條件下，發生上皮間質轉化(EMT)，使α-SMA的表達升高，因此α-SMA的表達水平反映了腎間質纖維化的進展。Fibronectin主要由腎小球系膜細胞分泌，分布在系膜區，在正常腎臟組織中表達較低，有研究發現，UUO模型中腎臟組織fibronectin的表達量與造模時間成正比，反映了纖維化的嚴重程度[11]。本研究結果顯示，UUO模型小鼠經CPD1干預后，α-SMA和細胞外基質蛋白fibronectin、collagen-I的表達均得到明顯抑制。Kim-1是一種磷脂酰絲氨酸受體，由受損的近端腎小管上皮細胞表達，在腎小管間質纖維化過程中起重要作用。在臨床研究中，Kim-1被作為腎小管損傷的早期診斷指標[12]。本研究發現，CPD1干預可有效降低Kim-1蛋白的表達，表明CPD1通過下調細胞外基質ECM沉積，減少Kim-1介導的腎損傷，抑制單側輸尿管梗阻誘導的腎間質纖維化進展，CPD1可能參與了腎小管上皮細胞的上皮-間質轉化以及對系膜細胞的激活抑制具有調控作用。

環磷酸鳥苷(cGMP)是重要的第二信使，在不同的器官和細胞類型中調節各種生理功能，如血管擴張、炎癥和凋亡。有研究報道，提高cGMP水平對包括腎臟在內的各種器官均顯示出有效的抗纖維化效果[13]。cGMP的細胞濃度是由其合成和降解之間的平衡決定的，磷酸二酯酶5(PDE5)是特異性催化cGMP水解的酶，可溶性鳥苷酸環化酶(sGC)刺激劑和PDE5抑制劑，均可使cGMP濃度增加[14]。PDE5抑制劑通過其下游信號轉導，在治療慢性腎病(CKD)患者的腎纖維化方面顯示出潛力[15]。本課題組自主研發的新型PDE5抑制劑CPD1克服了傳統的PDE5抑制劑水溶性和腸溶性差、對PDE5特異性不強(西地那非對PDE5特異性僅為PDE6的10倍，而WYQ有3 000倍)、副作用較大的缺點，有效提高了藥物生物利用度且具有更穩定的理化性質(中國發明專利申請號：201910505948.5)。本研究利用UUO模型，觀察了CPD1對腎纖維化小鼠的治療作用，從病理學以及分子層面進行驗證。

綜上所述，新型PDE5抑制劑CPD1改善腎纖維化的作用可能是通過降低纖維化相關蛋白的表達、減少Kim-1介導的腎損傷產生的，但其具體的作用分子機制還有待進一步探索，本研究對抗腎纖維化新藥的開發和臨床研究具有重要意義。