基于微流控芯片的復方木雞顆粒抗肝腫瘤的“譜-物-效”關系

秦 妍，包永睿，王 帥，李天嬌，張秀君，孟憲生，潘海鷗

(1. 遼寧中醫藥大學藥學院；2. 遼寧省中藥多維分析專業創新技術中心，遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600；3. 丹東藥業集團有限公司, 遼寧 丹東 118303；4. 遼寧中醫藥大學外國語學院，遼寧 沈陽 110000)

復方木雞顆粒源自于滿族民間驗方“木雞湯”，部頒標準《中藥成方制劑》第十六冊中記載，其具有抑制甲胎蛋白升高的作用。主要用于治療慢性乙型病毒性肝炎、肝纖維化、肝硬化以及肝癌。木雞湯此前由云芝、核桃楸皮兩味藥材組成，后經多年實踐應用，在此基礎上增添扶正祛邪的山豆根以及補益肝腎的菟絲子兩味藥材[1]。目前，復方木雞顆粒文獻中圍繞物質基礎的研究較少，主要集中在作用機制以及成分解析[2-5]方面，其中多數成果為本實驗室研究所得。本實驗在前期工作基礎之上，針對復方木雞顆粒抗肝癌藥效物質基礎不明確的問題展開了譜效學研究[6]，通過建立數學模型賦予VIP值，確定與藥效呈現正相關的色譜峰。在此基礎上，基于網絡藥理學對正相關成分進行“成分-靶點-通路”預測。故將“譜-效”分析的結果與“物”進行關聯，建立“譜-物-效”分析方法，為其合理的機制闡述提供數據支撐，同時也為更好地控制其藥品質量提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 儀器LSP04-1A型精密注射泵(保定蘭格公司)；HPDC-32G-2型等離子清洗機(美國Harrick Plasma公司)；JKG-2A型光刻機(上海學澤光學機械有限公司)；SC-1B型勻膠機(北京創世威納科技有限公司)；Agilent 1260液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；Agilent 1290 Infinity II型超高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；Agilent 6550型質譜聯用儀(美國安捷倫科技有限公司)；Nikon ECLIPSE TI倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 試劑與藥品復方木雞顆粒(批號：210103)來源于遼寧丹東藥業集團有限公司；細胞凋亡與壞死檢測試劑盒(Hoechst33342與碘化丙啶PI)購自碧云天生物技術研究所；細胞增殖與毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit8，貨號：MA0218)購自Meilunbio公司；乙腈(色譜純，批號：20210512)購自于德國Merck公司；甲酸(色譜純，批號：20210408)購自天津科密歐化學試劑有限公司；胎牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶均購自于美國Gibco公司；青霉素/鏈霉素溶液購自于Meilunbio公司。

1.3 凋亡特征芯片的設計與制作實驗所需芯片設計為PDMS-玻璃的雙層微流控芯片，從上到下依次為流體通道層以及玻璃基片層，流體通道層包括流體通道區以及多個細胞腔組成的細胞培養區，每列培養腔設置5個復孔。

1.4 芯片和孔板中生長狀態比較取處于對數生長期的HepG2細胞，消化后制成濃度為5×108個· L-1的單細胞懸液，使用1 mL無菌微量注射器吸取適量細胞懸液，注入芯片細胞培養腔內，使懸液順利進入腔內并均勻鋪滿管路，置于培養箱中進行孵育6 h，待其完全貼壁后，使用精密注射泵將培養液注入至培養通道中，流速設置為0.2 μL· min-1。每24 h拍照1次，通過IPP軟件對細胞圖像進行計數分析，取3個復孔平均值，繪制HepG2細胞芯片內生長曲線；將細胞密度調整為5×108個·L-1的單細胞懸液接種于96孔板中，每孔接種100 μL，并設置調零組。使用CCK-8法測定細胞在450 nm處的OD值，繪制HepG2細胞孔板內生長曲線。

1.5 復方木雞顆粒不同提取方式下藥液的制備提取溶劑為水(S1)、95%乙醇(S2)、氯仿(S3)、乙酸乙酯(S4)、正丁醇(S5)、甲醇(S6)、丙酮(S7)；稱取復方木雞顆粒50 g，S2 ～ S7分別加入10倍體積的提取溶劑回流提取1 h，抽濾后回收溶劑揮干，即得。精密稱取上述提取物2.00 g，置于10 mL容量瓶中，制成200 g·L-1的儲備液，過0.2 μm PTFE膜后轉移至樣品瓶中。S1稱取復方木雞顆粒2.00 g，同上述方法直接制備，供HPLC及UPLC-Q-TOF-MS分析使用；另外，采用培養液稀釋為濃度為10 g·L-1的儲備液，供微流控芯片藥效試驗使用。

1.6 復方木雞顆粒提取物指紋圖譜的測定及體外藥效學評價

1.6.1HPLC色譜條件 Agilent Poroshell SB C18(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)色譜柱，流動相為乙腈(A)-0.04%甲酸水(B)進行梯度洗脫(0-13 min，1%-6% A；13-19 min，6%-8% A；19-32 min，8%-13% A；32-34 min，13%-13% A；34-44 min，13%-17% A；44-52 min，17%-21% A；52-86 min，21%-41% A)，流速0.6 mL· min-1，柱溫30 ℃，UV檢測器254 nm，進樣量5 μL。

1.6.2體外藥效學評價 取人肝癌細胞HepG2，常規培養于含10%的胎牛血清的DMEM培養液中，取對數生長期細胞接種于芯片中。待細胞貼壁后，以0.2 μL· mL-1的流速經蠕動泵給藥刺激24 h，使用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)染液對細胞進行雙染，使用Nikon ECLIPSE TI倒置顯微鏡對芯片細胞進行拍照，檢測S1～S7不同提取方式下藥效的差異。

1.7 灰色關聯分析灰色關聯分析法是中藥譜效關系中常用的方法之一，其主要途徑是通過計算指紋圖譜共有特征峰與藥效之間的關聯度大小，來以此確定特征峰對藥效的貢獻值[7]。本研究采用灰色關聯度分析軟件(Grey Modeling_V3.0)進行分析，以細胞凋亡壞死率作為參考序列，不同提取方式下指紋圖譜共有峰峰面積作為比較序列[8]。采用灰色關聯分析法，先將原始數據進行均值化處理，在獲得絕對差序列以及關聯系數。

1.8 UPLC-Q-TOF-MS成分解析色譜條件：Agilent Poroshell SB C18(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)色譜柱；流動相：乙腈(A)-0.04%甲酸水(B)；流速：0.6 mL· min-1；柱溫：30 ℃；梯度洗脫程序：0-3 min，1%-6% A；3-4.5 min，6%-8% A；4.5-8 min，8%-13% A；8-9 min，13%-13% A；9-12 min，13%-17% A；12-15 min，17%-21% A；15-23 min，21%-41% A。

質譜條件：采用Dual AJS ESI離子源，正/負離子模式檢測，掃描范圍：m/z 100-1 500。干燥氣體流速為13 L· min-1，干燥氣體溫度為225 ℃，正離子模式下毛細管電壓為 3 500 V，負離子模式下毛細管電壓為-4 000 V，霧化器壓力為40 psig，碎裂電壓為125 V，OCT IRF Vpp為750 V，二級質譜碰撞電壓為20 eV。

1.9 譜-物-效”關系研究中物質基礎成分篩選將關聯系數>0.8的單體成分峰面積作為變量X，獲取的不同提取方式下復方木雞顆粒的藥效數據作為變量Y，導入SIMCA 14.1軟件中，經UVN標準化后，進行偏最小二乘法回歸(PLSR)分析。

1.10 “活性成分-靶點-通路”網絡構建通過TCMSP(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm)、Uniprot(https：//www.uniprot.org)數據庫獲得上述7個成分的89個靶點以及KEGG(https：//David-d.ncifcrf.gov/home.jsp)富集的88條通路，運用Cytoscape3.7.1軟件構建“成分-靶點-通路”網絡。同時，采用STRING(https：//string-db.org)數據庫獲取核心靶蛋白，將其導入Cytoscape3.7.1運用CytoNCA插件對核心蛋白進行篩選。

Fig 1 Schematic diagram of microfluidic chip

2 結果

2.1 芯片的設計與制作本實驗所需芯片包括3個入口以及3個廢液口，每列細胞腔下方設置有100 μm的彎曲管道，以防止液體倒流；其長度為5 cm，寬度為4 cm，厚度為3 mm，每個腔室為橢圓形，規格是1.0 mm×1.2 mm。

2.2 芯片和孔板中生長狀態比較結果HepG2細胞在鼠尾膠原包被的芯片中完全伸展，形態良好；通過比較兩種培養方式，其細胞形態上并無明顯差異；通過Nikon ECLIPSE TI倒置顯微鏡觀察發現，芯片中細胞連接更為緊密，培養腔室內細胞生長環境較佳。同時能夠說明流動培養能夠及時清理細胞培養腔中細胞代謝物。始終為細胞提供新鮮的營養物質，充分為細胞生存提供良好的微環境。見Fig 2A和Fig 2B。

Fig 2 (A) Cell growth in chip; (B) Cell growth in pore plate

HepG2在芯片中24～168 h之間細胞數量持續增長，且在24～144 h內呈現對數增長，144～168 h增長速率相對緩慢；細胞在孔板中72 h內已經達到對數生長期，隨著培養時間的延長，孔板內細胞代謝物大量堆積，在144 h后細胞數量出現下降的趨勢；結果表明兩種培養方式的生長規律基本一致，但芯片培養方式更有利于細胞長期培養。見Fig 3A和Fig 3B。

Fig 3 (A) Cell growth curve in chip; (B) Cell growth curve in pore plate

Fig 4 (A) Efficacy of HepG2 cells in vitro; (B) Hoechst 33342/PI double staining fluorescence detection results (×100)

2.4 復方木雞顆粒不同提取方式指紋圖譜的建立取供試品溶液按“1.6.1”色譜條件進行檢測，得到7個不同提取方式下復方木雞顆粒的指紋圖譜。其中，S4作為全色譜峰。圖譜信息導入中藥指紋圖譜相似度評價軟件(2012版)。見Fig 5和Fig 6。

Fig 5 Full spectrum peak of Compound Muji Granules

Fig 6 Fingerprint of Compound Muji Granules under different extraction methods

Fig 7 Regression coefficient and VIP value analysis results

2.4.1相似度評價 利用中藥指紋圖譜相似度評價軟件(2012版)分析，7種不同提取方式下復方木雞顆粒指紋圖譜的相似度分別為S1：0.635，S2：0.988，S3：0.939，S4：0.957，S5：0.943，S6：0.864，S7：0.405。結果表明，除S1和S7外，其余樣品相似度在0.864～0.988，表明不同提取方式下峰面積以及峰數量存在明顯差異，即化學成分之間存在一定的差異性。

2.4.2方法學考察

2.4.2.1精密度試驗 取S1供試品粉末，以“1.5”項下方法制備供試品溶液，以“1.6.1”項下色譜條件重復進樣6次，以木犀草素為參照峰，計算各峰相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各峰相對保留時間RSD<0.35%，相對峰面積RSD<2.74%，表明該方法精密度良好。

2.4.2.2穩定性試驗 取S1供試品粉末，以“1.5”項下方法制備供試品溶液，以“1.6.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進行測定，以木犀草素為參照峰，計算各峰相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各峰相對保留時間RSD<0.26%，相對峰面積RSD<2.66%，表明室溫條件下樣品溶液在24 h內穩定。

2.4.2.3重復性試驗 取S1供試品粉末，以“1.5”項下方法制備6份供試品溶液，以“1.6.1”項下色譜條件分別進樣，以木犀草素為參照峰，計算各峰相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各峰相對保留時間RSD<0.42%，相對峰面積RSD<2.98%，表明該方法重復性良好。

2.5 灰色關聯度分析與UPLC-Q-TOF-MS解析將細胞凋亡壞死率作為母序列，72個色譜峰峰面積作為子序列，采用灰色關聯度軟件展開分析，由此得到，不同提取方式色譜峰與其凋亡壞死率的關聯系數。其中相關性系數>0.8的列表如Tab 1。

Tab 1 Grey correlation analysis of chemical components and pharmacodynamic indexes of Fufang Muji Granules by different extraction methods

對關聯性>0.8的色譜峰進行質譜解析，共確認了11種成分，見Tab 2。

Tab 2 Preliminary examination of effective components of Compound Muji Granules

2.6 復方木雞顆粒抗肝癌活性物質基礎將Tab 2中關聯系數>0.8的各成分峰面積作為變量X，獲取的不同提取方式下復方木雞顆粒的藥效數據作為變量Y，導入SIMCA 14.1軟件中，經UVN標準化后進行PLSR分析。其中PLSR成分數為2，模型P值為0.004 7。OPLS-DA模型中R2X=0.837，R2Y=0.726模型預測參數Q2=0.81，均>0.5，表明建立的模型有效穩定。具體VIP值見Fig 7。一般認為VIP值越大的變量其貢獻也越大，其中有7個色譜峰的VIP值 > 1，包括圖中48(木犀草素)、6(沒食子酸)、19(綠原酸)、59(槲皮素)、67(山柰酚)、65(柚皮素)、38(鞣花酸)與藥效指標呈較強的正相關(VIP>1)。

2.7 “活性成分-靶點-通路”的構建與分析“活性成分-靶點-通路”可視化網絡中共有184個節點，包括木犀草素、沒食子酸、綠原酸、槲皮素、山柰酚、柚皮素、鞣花酸7種成分、89個靶點蛋白、88條信號通路。通過CytoNCA分析節點度值較高的前20個靶基因，度值分值均大于10，間距中心度、緊密中心度、特征向量中心度均大于中位值，在網絡中篩選出與7種活性成分存在關聯的靶點有：ESR1、JUN、HSP90AA1、SMAD3、FOS、AKT1、NOS3、ACTB、CEBPB、ESR2以及SMAD2，提示這些基因可能是復方木雞顆粒治療肝腫瘤的核心靶點(Tab 3)。KEGG富集信號通路主要涉及炎癥、免疫等方面，如TNF信號通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、乙型肝炎信號通路(hepatits B)、NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)等。

Tab 3 The core targets screened by CytoNCA pluggable unit

3 討論

本研究對不同提取方式的復方木雞顆粒進行了HPLC分析，根據色譜峰的差異，選取S4作為全譜峰，共標定72個色譜峰。經“譜-效”分析的相關性結果可知，共有14個色譜峰的相關度>0.8，UPLC-Q-TOF-MS共解析14個色譜峰中的11個成分。同時對14個色譜峰進行偏最小二乘回歸分析，得到木犀草素、沒食子酸、綠原酸、槲皮素、山柰酚、柚皮素以及鞣花酸7個抗肝癌活性物質基礎。再對7個活性成分展開“成分-靶點-通路”網絡構建，預測其潛在靶標為ESR1、JUN、HSP90AA1、SMAD3、FOS、AKT1、NOS3、ACTB、CEBPB、ESR2以及SMAD2，進一步闡述復方木雞顆粒抗肝腫瘤的“譜-物-效”關系。

并且根據文獻研究報道，上述7種藥效物質單體均有抑制肝腫瘤的作用。木犀草素能促進肝癌細胞自噬，促進肝細胞凋亡[9]。沒食子酸誘導SMMC-7721細胞凋亡，同時升高p53 mRNA水平和p53蛋白表達[10]。綠原酸可以抑制肝腫瘤相關巨噬細胞M2極化，且影響JAK/STAT6信號通路[11]。槲皮素能較為顯著的抑制體內外HepG2肝癌細胞的增殖，并會導致其發生凋亡[12]。山柰酚對肝癌Huh7細胞生長有明顯的抑制作用，且提高了細胞caspase-3的活性，與誘導細胞的凋亡有關[13]。柚皮素增強抗人DR5單克隆抗體對HepG2的凋亡作用，其可能機制為柚皮素誘導HepG2細胞表面DR5受體表達上調所致[14]。鞣花酸通過抑制CtBP、Stathmin和COX-2的表達發揮抗肝癌的生物學作用[15]。靶點作為藥物治療疾病的最小單位，并非獨立個體存在，“成分-靶點-通路”網絡是一個相互作用的復雜網絡，通過多個通路同時發揮多重或協同作用。復方木雞顆粒成分眾多，因此，本文采用“譜-物-效”研究方法，對“譜-效”篩選出的物質基礎進行“成分-靶點-通路”藥理網絡構建，并且富集癌癥以及與細胞生長、凋亡、增殖相關的通路；FoxO signaling pathway、HIF-1 signaling pathway等與免疫相關通路；TNF signaling pathway、Hepatits B等與肝炎相關的通路。

故推測復方木雞顆粒通過多過程、多通路共同參與抗腫瘤作用。本文從整體揭示復方木雞顆粒對肝腫瘤的干預作用及潛在靶標，為后續深入研究復方木雞顆粒中不同活性成分調節肝腫瘤的作用機制以及抗肝腫瘤藥物的研發提供依據。