外泌體調控Notch 信號通路活化機制的研究進展

葛鑫宇，唐昊

中國人民解放軍海軍軍醫大學第一附屬醫院創傷骨科，上海200433

外泌體是一種由細胞內釋放到細胞外微環境的膜性囊泡，幾乎所有類型的細胞都能分泌外泌體。外泌體能夠攜帶蛋白質、脂質、核酸等生物活性物質，可作為信息傳遞的載體，參與細胞間信息傳遞，從而參與人體多種生理和病理過程。外泌體的功能主要取決于其蛋白質和核酸的組成。有研究表明，外泌體通過活化多種信號通路，如Hedgehog、Wnt、Notch 等信號通路，從而參與細胞增殖與分化、組織損傷修復、免疫細胞活性調節、病毒感染后應答等生物學過程［1-2］。Notch 信號通路是一個在進化過程中高度保守的信號通路，主要由Notch 受體、配體以及負責胞內信號傳導的效應器分子三部分組成。Notch信號通路在細胞增殖、分化以及惡性轉化等過程中具有關鍵性作用［3］。外泌體可通過調控Nocth信號通路的受體、配體以及細胞內效應器分子，參與多種細胞的生物學過程［4］。本文結合文獻就外泌體調控Notch 信號通路活化機制的研究進展作一綜述。

1 Notch信號通路概述

1.1 Notch 信號通路組成 Notch 信號通路是一個在進化過程中高度保守的信號通路，在脊椎動物和非脊椎動物中普遍存在。Notch 基因最早于1917 年由MORGAN 及其同事在突變的果蠅中發現，該基因負責編碼跨膜受體蛋白家族。Notch 信號通路是由Notch 受體、Notch 配體以及負責胞內信號傳導的效應器分子三部分組成。哺乳動物的Notch 受體有4種，分別為Notch1、Notch2、Notch3 和Notch4，定位于細胞膜上，可與Notch 配體結合。Notch 配體有5種，分別為Delta-like1（Dll1）、Delta-like3（Dll3）、Deltalike4（Dll4）、Jagged1 和Jagged2，能夠與細胞膜表面的Notch 受體結合。胞內效應器分子以CSL 最為重要。CSL 與Notch 受體的胞內段（NICD）結合可激活靶基因的轉錄，而CSL控制靶基因轉錄的關鍵環節。此外，Numb、Deltex1、Deltex2、Deltex3 等調節因子亦可作為效應器分子，參與調控Notch信號傳遞。

Notch 信號通路活化有兩條途徑：經典的Notch信號傳導途徑和非經典的CSL非依賴途徑。經典的Notch 信號傳導途徑又稱CBF-1/RBP-Jκ 依賴途徑，在信號通路活化過程中，細胞膜上的Notch 受體與來自細胞外的Notch 配體結合，在各種酶的裂解作用下，NICD 釋放入胞內并進入細胞核，與CSL 蛋白、MAML結合形成轉錄激活物NICD-CSL-MAML，該轉錄激活物與位于基因增強子元件中的Notch 調控元件結合，導致Notch 的靶基因Hes、Hey 表達，而Hes、Hey 等bHLH 家族轉錄因子能夠促進其下游基因的表達［4］。CSL 非依賴途徑與經典的Notch 信號傳導途徑不同，Notch 受體不是在與Notch 配體結合后被激活，而是在與E3 泛素連接酶Deltex 結合后被激活。Notch 受體被Deltex 激活后，通過內吞作用進入細胞內。Notch 受體在細胞內的多泡體中進行S3 裂解，NICD 釋放至細胞質并進入細胞核，與CSL蛋白、MAML 結合形成轉錄激活物，之后的激活過程與經典的Notch信號傳導途徑相同［5］。

1.2 Notch 信號通路的生物學功能 Notch 信號通路能夠參與細胞增殖、分化以及上皮間質轉化等生物學過程，而這些生物學過程是腫瘤發生的關鍵環節。因此，Notch信號通路在腫瘤發生過程中扮演重要角色。在細胞癌變過程中，Notch信號通路組成的調控網絡能夠以Notch1、Notch2、Notch3受體和Jagged1配體為靶點，參與調控腫瘤干細胞（CSCs）功能［6］。如在膠質母細胞瘤中，Notch1 受體能夠介導非腫瘤細胞去分化為腫瘤干細胞，從而增強腫瘤細胞的增殖和遷移能力［7］。在腫瘤發生過程中，由于Notch 信號通路異常表達，增殖能力較低的正常細胞去分化變為增殖能力較強的腫瘤細胞。但白血病是一種較為特殊的腫瘤，其腫瘤細胞是由增殖能力較強的造血干細胞異常分化而來。各型白血病的發生亦與Notch 信號通路有著密切聯系。在急性T 淋巴細胞白血病中，Notch1 受體異常活化具有關鍵性調節作用，能夠促進異常T 淋巴細胞增殖。而在急性B 淋巴細胞白血病中，Notch3、Notch4 受體和Jagged1、Jagged2、Dll1 配體均存在異常活化。在急性髓細胞白血病中，Notch2 受體異常活化能夠導致造血干細胞異常活化。外泌體能夠通過Notch 信號通路調控造血干細胞異常分化。因此，Notch信號通路異常會抑制正常造血干細胞產生，導致白血病發生［8］。

在免疫系統炎癥反應中，巨噬細胞發揮重要作用，而Notch 信號通路則是控制巨噬細胞生物學功能的關鍵調節器。Notch 信號通路激活后能夠使巨噬細胞向M1 型分化，從而釋放細胞因子和趨化因子，加重炎癥反應［9］。在感染性疾病中，被病原體感染細胞的Notch 信號通路調控因子表達增加，感染細胞釋放的外泌體進入細胞外液，通過多種方式作用于巨噬細胞，使巨噬細胞的Notch1、Notch2、Notch3 受體以及Dll1、Dll4 配體表達增加，從而促進巨噬細胞向M1型分化，繼而增強炎癥反應。

除了參與炎癥反應外，Notch信號通路還能參與心臟發育。Notch 信號通路異常可導致先天性心臟病發生。在心臟和主動脈發育過程中，Notch3 受體和Jagged1配體激活可促進血管平滑肌形成，為主動脈壁的正常發育提供了條件；Notch1 受體可參與主動脈瓣形成，故Notch1 受體缺失會導致主動脈瓣疾病；Notch2、Notch4 受體與右心室流出道形成有關，Notch2、Notch4 受體異常會導致法洛四聯癥發生［10］。因此，通過干預Notch 信號通路促進心肌細胞修復是一種可行的方法。除了調控大血管生成外，Notch信號通路還能調控中小血管和微血管生成。腫瘤血管生成、損傷后新生血管生成以及血管分支調控均由Notch 信號通路控制［11］。血管生成主要受血管內皮生長因子（VEGF）調控，血管內皮細胞在VEGF、Notch 信號通路作用下激活并發生增殖和遷移。VEGF 能夠促進血管內皮細胞中Dll4配體表達，Dll4配體可作用于相鄰的內皮細胞，導致VEGF 受體表達下調，形成負反饋機制，防止血管過度增殖。因此，Notch信號通路可通過直接或間接作用調控血管生成［12］。

此外，Notch信號通路還能參與皮膚生成與損傷修復。Notch1、Notch2 受體在表皮中均有表達。在皮膚中Notch 信號通路被激活后，Notch1 受體表達增強，促使表皮細胞增殖和分化能力增強。此外，Notch 信號通路還能調控皮膚成纖維細胞增殖和分化，在皮膚傷口愈合以及皮膚病發病過程中發揮重要作用［3］。

2 外泌體調控Notch信號通路活化的機制

2.1 外泌體對Notch 受體的調控 外泌體調控靶細胞的Notch 受體時，外泌體自身攜帶的信號分子可直接作用于靶細胞。外泌體對Notch 受體的調控方式主要有兩種。第一種方式為外泌體直接作用于靶細胞膜上的Notch 受體，通過影響Notch 受體激活調控靶細胞的生物學功能。如CD8+T 細胞外泌體中NADPH 氧化酶2減少，對臨近細胞的Notch4受體抑制作用降低，可促進血管內皮細胞RAB5A、RAB11A 表達并抑制RAB7A 表達，從而引起巨細胞動脈炎。因此，抑制Notch4 受體可糾正免疫缺陷并保護動脈免受炎癥損傷［13］。第二種方式為外泌體中的miRNA、lncRNA、蛋白等分子作用于靶細胞，從而調控靶細胞Notch 受體的轉錄與合成，這種信號傳導方式具有信號級聯放大效應，因信號傳導效率較高，易于檢測，是目前研究較多的調控方式。

外泌體調控Notch 信號通路時，通常是外泌體中的蛋白作用于靶細胞，從而調控靶細胞的功能。如天冬氨酸β 羥化酶（ASPH）在正常組織中沉默表達，僅在腫瘤組織中表達，其功能是產生和維持腫瘤的惡性表型。乳腺癌細胞的外泌體中含有ASPH，而ASPH 可作用于臨近的腫瘤細胞和間質細胞，直接影響Notch1 受體與Jagged1 配體結合，同時影響ADAM10 和ADAM17 結 合，隨 后 激 活Notch 信 號 通路，使致癌外泌體的合成與分泌增加，從而促進腫瘤轉移［14］。在促進腫瘤轉移的蛋白中，CD44v6的作用與ASPH 相似。有研究報道，胰腺癌細胞的外泌體中含有CD44v6，CD44v6 通過促進Notch1 受體轉錄，激活Notch 信號通路，增加致癌外泌體的合成與分泌。因此，CD44v6 亦具有促進腫瘤轉移的作用［15］。另外，乳腺癌基質細胞的外泌體可通過負責信號轉導與轉錄激活的STAT1作用于乳腺癌細胞的Notch3受體，能夠增強腫瘤細胞的化療抵抗，間接促進腫瘤細胞的增殖能力［16］。外泌體中的蛋白在信號調控中具有關鍵作用，因而干預外泌體中蛋白的表達亦可影響靶細胞Notch 受體的表達。有研究發現，使用二十二碳六烯酸干預血管平滑肌細胞后，血管平滑肌細胞的外泌體中MMP-2、MMP-9 活性顯著降低，導致血管內皮細胞Notch3 受體表達增加，從而使血管內皮細胞的增殖和分化能力增強。相反，當主動脈內皮細胞受到TGF-β1刺激時，主動脈內皮細胞外泌體中的血管內皮細胞生長因子受體2（VEGFR2）信號減少，VEGFR2 信號減少使得血管內皮細胞中Notch1 受體表達下調，從而使血管內皮細胞增殖和分化能力降低［17］。

外泌體中的各種RNA 亦可作為信號分子影響靶細胞的功能。lncRNA 雖然不能編碼蛋白質，但在表觀遺傳、細胞周期和細胞分化等生物學過程中具有重要作用。如高分化膀胱癌細胞外泌體中的LINC00960、LINC02470可通過上調低分化膀胱癌細胞中的Notch1、Notch4受體表達，并誘導上皮間質轉化，使膀胱癌的惡性程度增加［18］。影響靶基因mRNA 轉錄的miRNA 同樣可通過外泌體作用于靶細胞，調控Notch 受體的轉錄。如橫紋肌肉瘤細胞外泌體中的miRNA，通過影響相鄰細胞的Notch1 受體表達，介導腫瘤細胞的增殖與惡性轉化［19］。而在心血管系統中，心肌梗死后心肌細胞外泌體中的miR-1956 可激活Notch1 受體，使得脂肪間充質干細胞分泌VEGF，從而促進冠狀動脈側支血管生成［20］。在造血系統中，造血干細胞外泌體中的miR-126 可通過抑制Notch1 受體促進小鼠胚胎干細胞的體外造血分化［21］。另有研究發現，HIV 感染者血漿分離的 外 泌 體 中miR-10a-5p、miR-21-5p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-146a-5p、miR-423-5p 表達顯著增加，并預測這六種miRNA 可通過Notch1受體影響免疫細胞的分化［22］。由于外泌體對Notch 信號通路的受體、配體及胞內效應器分子均具有調控作用，外泌體中的miRNA 成分可作為診斷和預測疾病的功能性生物標志物［12］。除lncRNA 和miRNA 外，具有轉錄和加工功能的srpRNA 亦能參與外泌體對Notch信號通路的調控。RN7SL1這種srpRNA可與乳腺癌細胞及其腫瘤間質細胞表面的Nocth1 受體結合，使腫瘤細胞及其間質細胞內原癌基因myc 表達增加，而myc表達增加能夠促進RN7SL1表達。因此，腫瘤細胞及其間質細胞外泌體中的RN7SL1 表達增加，這些外泌體再作用于腫瘤細胞及其間質細胞，形成正反饋效應，從而增強了乳腺癌的侵襲性［23］。

Notch 受體作為Notch 信號通路的核心部分，其調控機制多樣，不僅受外泌體中各種蛋白的影響，同時也受外泌體中多種RNA 的調控。外泌體調控Notch 受體時信號傳導是按照外泌體-Notch 受體-胞內效應器分子這一流程進行的，在干預Notch 信號通路的研究中，對受體的干預是最常見且最有效的。在未來的研究中，基于Notch 受體對Notch 信號通路進行調控可能在靶向治療方面具有廣闊的應用前景。

2.2 外泌體對Notch 配體的調控 Notch 配體是Notch 受體結合的信號分子。外泌體對Notch 配體的調控有兩種方式。第一種調控方式：外泌體中含有Notch 配體，外泌體作用于靶細胞，Notch 配體直接作用于靶細胞的Notch 受體。在腫瘤進展過程中，腫瘤細胞通過增加周邊細胞的可塑性、運動性和侵襲性，從而促進腫瘤細胞擴散，這一過程可通過腫瘤細胞外泌體中的Notch 配體實現。有研究認為，乳腺癌間質細胞分泌的外泌體能夠抑制乳腺癌細胞上皮間質轉化，增強乳腺癌細胞抗凋亡能力并降低其對化療藥物的敏感性，這可能與乳腺癌細胞中Dll4 配體高表達有關［16］。在結直腸癌細胞中，Jagged2 配體表達增加，腫瘤細胞釋放富含Jagged2配體的外泌體，以旁分泌的方式作用于臨近細胞，可促進結直腸癌細胞的遷移［24］。Notch 信號通路的配體亦可參與上皮細胞的轉化調控，在皮膚細胞增殖過程中具有重要作用。胎兒真皮間充質干細胞外泌體中Jagged1 配體表達增加，外泌體中的Jagged1 配體激活了成纖維細胞的運動和分泌功能，從而加快傷口愈合［25］。第二種調控方式：外泌體的miRNA、lncRNA、蛋白等分子作用于靶細胞，調控靶細胞Notch 配體的轉錄與合成，由于Nocth 配體在細胞內合成后需要與其他細胞的Notch 受體結合才能發揮作用，因此這種方式信號級聯放大效應更加明顯。上皮細胞的上皮間質轉化過程受Notch 信號通路的調控，在多種細胞中均有體現。Notch信號通路激活后，細胞黏附性降低、活動性增強，有利于細胞增殖。在穩定過表達HIF-1α 的骨髓間充質干細胞外泌體中，高表達的HIF-1α使血管內皮細胞的Jagged1配體含量增加，Jagged1通過激活Notch信號通路，促進了血管內皮細胞增殖，加速了血管生成［26］。起源于上皮組織的惡性腫瘤，同樣與Notch 信號通路有著密切的聯系。有研究認為，腫瘤細胞外泌體中的Dll4配體可轉移至血管內皮細胞，導致Notch 信號通路被抑制，正常血管生成被抑制，腫瘤血管生成得到增強，從而促進腫瘤進展。黑色素瘤細胞起源于皮膚表皮，其活性同樣受到Notch 信號通路的調控。黑色素瘤B16F0 細胞分泌的外泌體可通過miR-711、miR-1187 和miR-466 等miRNA 作用于靶細胞，促進與Notch 信號通路相關的配體表達，如Jagged1、Dll1，從而增強腫瘤的浸潤性［27］。

外泌體調控Notch 配體時信號傳導是按照外泌體-Notch 配體-Notch 受體-胞內效應器分子這一流程進行的，外泌體對Notch 配體的調控是基于完整的Notch 信號傳導途徑，而Notch 配體是Notch 信號通路的最上游環節，故對Notch 配體進行調控時級聯放大效應更明顯。

2.3 外泌體對Notch 胞內效應器分子的調控 外泌體除了通過Notch 受體和配體調控細胞活動外，還可通過干預Notch 信號的胞內效應器分子調控細胞活動。Notch 受體經過3 次裂解，胞內段進入細胞，在細胞核內與轉錄因子CSL及MAML結合，形成NICD-CSL-MAML 轉錄激活物復合體，激活Hes、Hey等bHLH 轉錄因子家族，從而發揮生物學效應。有研究發現，骨髓間充質干細胞分泌的外泌體中含有miR-142-3p，miR-142-3p 作用于結腸癌細胞可下調細胞內Notch 信號通路調節因子Numb，而Numb 作為抑癌基因，其表達缺失對腫瘤的發生、發展至關重要。Numb 表達下調可促進Notch 信號通路靶基因Hes1、p21、cyclin D3表達，增強結腸癌細胞的增殖能力［28］。外泌體不僅能作用于腫瘤細胞，提高腫瘤細胞的增殖能力，還可作用于正常細胞，抑制正常細胞的活動，增加腫瘤細胞的生存空間。骨肉瘤細胞的外泌體中存在Notch 激活因子，外泌體激活小鼠肌源性干細胞中的Hes1并抑制骨骼肌細胞生成，介導腫瘤惡病質中的骨骼肌萎縮［3］。而在感染性疾病中，被病毒感染細胞釋放的外泌體同樣可參與Notch信號通路的調控，從而參與病毒感染后的免疫應答。腫瘤細胞、正常上皮細胞受到Notch 信號通路的調控以正向調控為主，但被病原體感染的細胞常受到負向調控。幽門螺旋桿菌感染者血清中的外泌體可促進腸上皮細胞NLRP12表達，而NLRP12是一類T 細胞活化的負向調節分子，可調節病原體感染以及細胞損傷引起的炎癥反應，能夠抑制Notch 信號通路下游分子NICD、Hes1、Hes5、Hey1，降低趨化因子MCP-1、MIP-1α 表達，從而減輕炎癥反應［29］。日本腦炎病毒感染的小膠質細胞釋放的外泌體中含有let-7a/b，let-7a/b 可 與TLR7、NICD 相 互 作 用，TLR7 能夠介導抗病毒的免疫反應，NICD 可激活Hes、Hey等Notch信號通路的靶基因，二者共同促進小膠質細胞釋放TNF-α，從而增強炎癥反應［30］。不僅如此，神經系統中神經干細胞分泌的外泌體中含有miR-9，miR-9 可通過旁分泌作用于其他神經干細胞的Hes1 靶點，能夠促進神經干細胞分化，從而影響神經細胞變性后的修復過程。對于Notch信號通路的下游靶基因Hes1而言，神經干細胞分泌的外泌體中的miR-9是促進其表達的關鍵因素［31］。

外泌體調控Notch 胞內效應器分子時，外泌體攜帶的信號分子與靶細胞作用，直接干預靶細胞Notch信號的胞內效應器分子，不經過配體和受體的環節。外泌體對胞內信號傳導的調控常常不僅限于Notch 信號通路，也包含Notch 信號通路之外的分子，可能涉及到多種信號通路復雜的交互作用，而對Notch信號通路的調控僅是其多種機制中的一環，特異性稍低。特別是在感染性疾病中，外泌體對炎癥因子分泌的調節會同時涉及到NF-κB、JNK 及PI3KAkt等信號通路，其機制仍需進一步研究。

綜上所述，外泌體作為傳遞細胞間信號的介質，可通過Notch 受體、配體以及胞內效應器分子三個層面參與Notch 信號通路的調控。外泌體調控Notch 受體時信號傳導流程為外泌體-Notch 受體-胞內效應器分子，對Notch 受體的干預是最常見且最有效的。外泌體調控Notch 配體時信號傳導流程為外泌體-Notch 配體-Notch 受體-胞內效應器分子，對Notch 配體進行調控時級聯放大效應更明顯。外泌體調控胞內效應器分子時信號傳導流程為外泌體-胞內效應器分子，其機制較為復雜，涉及多種信號通路的協同作用。目前，外泌體對Notch 信號通路的調控機制尚未完全闡明，在不同環境、不同細胞中的作用是不完全相同的，值得繼續深入研究，從而為腫瘤治療、組織修復等提供新的思路。