一氧化氮和茶多酚對肥城桃抗氧化系統的調控作用

肖興榮，丁芮，宮淑琪，朱樹華

(山東農業大學化學與材料科學學院，山東泰安 271018)

抗氧化系統具有保護細胞膜以及各種細胞器免受活性氧損傷的功能[1]，在水果采后貯藏品質保持中發揮著重要作用。

具有活性的一氧化氮(NO)在延長果實的貯藏壽命和保持果實品質方面有積極的作用[2]，可提高果實采后的質量，延長新鮮果品如桃、香蕉等[3,4]的保質期。能抑制呼吸躍變型果實乙烯的產生，降低活性氧的積累，參與果實成熟并顯著降低果實在貯藏期間水分的流失[5]。可通過減少活性氧的積累來保護植物細胞免受氧化應激的影響[6]。

茶多酚為多酚類物質，在茶葉中含量約15%～30%，具有良好的抗氧化能力，既能抑制自由基的產生，還能有效清除細胞內過量的自由基[7,8]，且無毒，對人體安全，是天然的食品抗氧化劑[9,10]，可用于各種食品的貯藏保鮮[11,12]。茶多酚有較強和較廣的抗菌、抑菌性能[13]，除能清除自由基外，還可以激活自由基清除體系，抑制脂膜的過氧化反應，絡合誘導氧化的金屬離子來抑制自由基的產生，或激活細胞內抗氧化防御系統[14]。能抑制多酚氧化酶的活性，延緩水果的褐變[15]。

目前，NO可以提高采后果實抗氧化酶活性降低活性氧的累積，抑制乙烯的產生，減少水分流失，保持采后果實品質。茶多酚可以提高抗氧化系統的活性來抑制自由基的產生并消除自由基。因此一氧化氮和茶多酚都可以通過促進果實抗氧化系統延長果實的貯藏時間并保持果實品質。筆者研究并比較了NO和茶多酚處理對桃果實貯藏期間抗氧化系統的調控作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與儀器

萊山蜜(Purnuspersicacv. Laishanmi)于2020年9月采自山東省肥城市，果實生長良好，無病蟲害，無機械損傷。試驗儀器：紫外可見掃描分光光度計UV-2450型(日本島津公司)；電子分析天平BS210S型(德國Sartorius公司)；pH計S-3D型(上海精科電器公司)；水浴鍋HH-2型(國華電器有限公司)；組織粉碎機All basic S25型(IKA公司)；高速離心機GL-20G-Ⅱ型(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 試驗設計與方法

試驗設3個NO濃度(5、15、30 μmol/L)處理[16]，2個茶多酚濃度(14.2、42.6 mmol/L)處理[17]，對照為蒸餾水處理。

每個處理選取36個桃果實，分別用上述濃度溶液浸泡0.5 h，置于25 ℃下貯藏待測相關指標，每2 d取樣測定1次，至10 d。

1.3 指標測定

1.3.1 丙二醛(MDA)含量 稱取測待桃果肉10 g，研磨勻漿后，加入25 mL磷酸緩沖液(pH 7.8)浸提10 min，取1 mL樣品浸提液，加入7.5 mL Tris-HCl(pH 7.5)、1 mL 0.6 %硫代巴比妥酸(TBA)溶液，混勻，沸水浴15 min后冷卻至室溫，經15 000 g離心15 min，取上清液于比色皿中，分別測定450 nm、532 nm和600 nm的吸光度，計算：

MDA含量=6.45(A532-A600)-0.56A450，單位表示為μmol/g FW(鮮重)。

1.3.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性 稱取待測桃果肉10 g，加25 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)勻漿，在4 ℃以15 000 g離心15 min，取上清液備用。取3 mL 50 mmol/L磷酸反應液(pH 7.8，含13 mmol/L甲硫氨酸、63 μmol/L氮藍四唑(NBT)、1.3 μmol/L核黃素和10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，在暗處加入30 μL酶液，25 ℃下用4 000 lx熒光燈管照光，出現顏色變化后，測定560 nm的吸光度。以未加酶液的反應體系為空白對照，以單位時間內抑制NBT光還原率達50 %的酶量為1個酶活性單位(U)。

1.3.3 過氧化氫酶(CAT)活性 取10 g果肉，研磨勻漿后，加入25 mL磷酸緩沖液(pH 7.8)浸提，15 000 g離心15 min。取0.2 mL上清液，加入3 mL磷酸緩沖液、0.1 mL的1 %過氧化氫溶液，立即搖勻，并轉入比色皿中，測定240 nm的吸光度變化。從加入H2O2起計時，每15 s讀數1次。以未加酶液的反應體系為空白對照，以單位時間內抑制NBT光還原率達50 %的酶量為1個酶活性單位(U)。

1.3.4 過氧化物酶(POD)活性 采用聯苯胺法測定POD活性[18]。取10 g果肉，研磨勻漿后，加入25 mL磷酸緩沖液(pH 7.8)浸提10 min，15 000 g離心15 min。取上清液(粗酶液)1 mL，加入2 mL聯苯胺乙酸-乙酸鈉溶液30 ℃水浴5 min。加入1 mL 0.3 % H2O2，立即搖勻，并轉入比色皿中，測定580 nm的吸光度變化。從加入H2O2起計時，每15 s讀數1次。以單位時間單位質量內吸變化度變化0.01為一個酶活單位(U)，單位表示為U/mg FW。

1.3.5 賴氨酰氧化酶(LOX)活性 參照吳敏[19]等的方法測定。取10 g果肉，加入25 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)，在4 ℃勻漿，15 000 g離心15 min，取上清液作為酶粗提液。取0.2 mL粗酶液，加入25 μL 50 mmol/L亞油酸鈉，2.775 mL 100 mmol/L乙酸緩沖液(pH 5.5)，30 ℃反應，測定234 nm吸光度變化。加酶液15 s后開始計時，記錄1 min內在234 nm下吸光度的變化，以1 min內吸光度升高的數值定義為1個酶活單位(U)，LOX活性以U/g FW表示。

1.4 統計分析

各指標測定重復三次，采用SPSS軟件進行顯著性分析，差異有統計學意義(P<0.05)，單因素方差分析和Tukey檢驗。

2 結果與分析

2.1 NO和茶多酚處理對肥城桃MDA含量的影響

如表1，3個濃度NO處理的肥城桃在貯藏10 d期間，MDA含量整體呈上升趨勢。對照也是上升趨勢。貯藏至6 d時，處理的小于對照，說明NO處理抑制了果實MDA的產生。貯藏8～10 d時，反而處理的大于對照的。

表1 NO和茶多酚處理對肥城桃MDA含量的影響 μmol/g FW

茶多酚2個濃度(14.2、42.6 mmol/L)處理的桃果實貯藏10 d期間，除貯藏2 d時處理的大于對照的，貯藏4～10 d時，處理的小于對照的，說明茶多酚抑制了果實MDA的產生。

但NO 3個濃度處理之間、茶多酚2個濃度處理之間、NO與茶多酚處理之間分別對果實中MDA的抑制作用，互有顯著性差異，但未體現出規律。從貯藏10 d時的效果看，NO處理的MDA值大，效果差，茶多酚處理的MDA值小，效果好。

2.2 NO和茶多酚處理對肥城桃SOD活性的影響

如表2，NO處理的肥城桃貯藏的10 d中，SOD活性呈先升后降趨勢，但都顯著高于對照。說明NO處理有提高桃果中SOD活性的作用。

表2 NO和茶多酚處理對肥城桃SOD活性的影響 U/g FW

茶多酚處理的桃果實在貯藏的10 d中，SOD活性的變化規律同NO，也說明茶多酚處理有提高桃果中SOD活性的作用。

但3個NO濃度處理之間、2個茶多酚濃度處理之間，分別對果實中SOD的活性增強作用，互有顯著性差異，未體現出規律。

2.3 NO和茶多酚處理對肥城桃CAT活性的影響

如表3，NO處理的肥城桃在貯藏的10 d期間，CAT活性是先上升最后降低趨勢，對照的變化規律亦然，且處理的都顯著高于對照的。貯藏8 d時，以5 μmol/L處理果實的CAT活性(212.84 U/g FW)最高，是對照(64.76 U/g FW)的330%。表明NO處理比對照增加了CAT活性。

表3 NO和茶多酚處理對肥城桃CAT活性的影響 U/g FW

茶多酚處理的肥城桃CAT活性變化：14.2 mmol/L處理的一直升高，貯藏10 d時達到峰值(196.78 U/g FW)，是對照的388%。42.6 mmol/L處理的CAT活性是先上升最后降低趨勢，且處理的都顯著高于對照的，表明茶多酚處理比對照增加了CAT活性。

2.4 NO和茶多酚處理對肥城桃POD活性的影響

如表4，NO處理的肥城桃貯藏的10 d期間，5 μmol/L NO處理桃果的POD活性一直呈上升趨勢，貯藏10 d時至峰值(5.68 U/mg FW)，是對照(4.38 U/mg FW)的130 %。而15、30 μmol /L NO 2個濃度處理果實的POD活性呈先上升后下降趨勢。NO 3個濃度處理果實的POD活性在貯藏至10 d時均顯著低于對照。

表4 NO和茶多酚處理對肥城桃POD活性的影響 U/mg FW

茶多酚2個濃度處理桃果貯藏10 d期間，POD活性均呈先升后降趨勢，對照亦然。貯藏至6 d時，14.2 mmol/L處理的桃果的POD活性達到峰值(5.89 U/mg FW)，是對照(5.60 U/mg FW)的105 %。

2.5 NO和茶多酚對桃果實LOX活性的影響

如表5，NO處理的肥城桃貯藏10 d期間，LOX活性呈先升后降趨勢。貯藏6 d時，5 μmol/L NO處理的桃果實LOX活性達峰值(4.89 U/mg FW)，是對照(3.65 U/mg FW)的134 %。

表5 NO和茶多酚處理對肥城桃LOX活性的影響 U/g FW

茶多酚處理的肥城桃貯藏10 d期間，LOX活性也呈先升后降趨勢。貯藏至6 d時，14.2 mmol/L茶多酚處理桃果的LOX活性達峰值(3.87 U/mg FW)，是對照(3.70 U/mg FW)的105 %，是42.6 mmol/L茶多酚處理(3.55 U/mg FW)的109 %。

3 小結與討論

目前桃果實貯藏保鮮中常用低溫貯藏保鮮技術和氣調貯藏保鮮技術。低溫冷藏使桃果實的失水率增高,易發生皺縮現象,貯藏效果差,貯藏期短[20]。氣調貯藏可以減少乙烯對果蔬的刺激，減少果蔬體內物質消耗，降低腐爛率等，成為研究的熱潮[21]。NO廣泛存在于生物體中，不僅影響著生物的生長發育等一系列生理過程，而且在信號轉導過程中發揮著關鍵作用[22]，NO處理具有效果明顯、省時省力、節約成本等優點[23]，但目前NO作用的分子機制存在著太多的未知數[24]。茶多酚作為一種自然提取物，副作用小，原料豐富，并且具有良好的活性，然而茶多酚本身不具備較好的穩定性，容易氧化，在保鮮過程中產生的自由基和氧化物不斷蓄積，達到一定數量后會抵消其本身的活性[25]。

本研究證明，NO處理比對照不處理能降低貯藏期肥城桃的MDA含量，貯藏前6 d抑制桃果POD活性，貯藏0～4 d期間抑制LOX活性，明顯提高貯藏后期SOD活性，延長了貯藏時間。茶多酚的高效抗氧化活性，能明顯減緩細胞膜脂質的過氧化程度，抑制桃果貯藏期MDA的產生，提高SOD的活性和后期CAT的活性，抑制POD和LOX的活性。維持桃果實細胞膜的完整性，延緩果實的衰老，有利于果實的貯藏[26-28]。整體看，30 μmol/L NO處理和14.2 mmol/L茶多酚處理效果為好。綜合NO和茶多酚對桃果實抗氧化系統的影響情況，以及考慮試驗造價和操作過程，NO處理比茶多酚處理的應用更具優勢。