雜交大豆苗期對干旱脅迫的生理響應

楊玉花，雷 陽，白志元，陳 妍，張海平，張瑞軍

(1. 山西農業大學農業基因資源研究中心/農業部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室/雜糧種質資源發掘與遺傳改良山西省重點實驗室，太原 030031；2. 山西農業大學園藝學院，太原 030031)

【研究意義】大豆是全球最主要的農作物之一，同時也是人類食用植物油、大豆制品和動物飼料的主要來源之一。我國每年大豆需求量約1.1億t，但是國內自產大豆每年僅約1500萬t，缺口高達85%，對進口依賴程度極高，2020年我國大豆進口高達10 032.7萬t，創下歷史新高。面對當前全球愈發嚴重的新冠疫情，以及未來中美關系的不確定性，大豆產業已成為我國糧食安全戰略中最大的軟肋，隨時面臨“卡脖子”的風險。目前隨著全球對大豆消費的日益增長，大豆產量的提高將成為我們育種研究的重要目標。然而植物生長和發育嚴重受到外界環境氣候的影響，尤其干旱是影響全球植物地理分布并且在一定程度上限制農作物產量的主要環境因素之一。山西省地處黃土高原地區，是典型的大陸性季風氣候區[1]，常年受旱災影響，因此節水旱作是該省農業發展的戰略問題。面對我國對大豆的大量需求，我國政府通過高標準農田建設、現代種業提升工程等專項，加大對大豆主產區(東北和黃淮海地區)的支持力度。山西省作為大豆黃淮海主產區之一，應加大力度全力選育高產抗旱大豆品種。然而據統計，干旱將會使大豆產量減少40%左右[2-3]，因此開展大豆抗旱相關研究迫在眉睫。【前人研究進展】目前常規大豆抗旱研究相對較多[4-6]，也有很多相關品種的審定，如隴中黃602[7]、晉豆50號[8]、合豐48、綏農28、龍小粒2號、黑農65等[9]，但是雜交大豆抗旱研究目前較少。前人對大豆抗旱性研究主要在大豆種子萌發期[6]、苗期[10-11]、花期[12]以及整個生育期[13]，通過檢測萌發期、苗期、花期和成熟期生理生化指標和農藝性狀，從而利用抗旱指數法和隸屬函數值等方法對大豆抗旱性評價分析。【本研究切入點】本文利用課題培育的3個雜交大豆品種進行抗旱相關研究，通過PEG-6000不同濃度模擬干旱脅迫。【擬解決的關鍵問題】研究以期通過測定苗期葉綠素含量、光合生理指標、滲透調節物質含量以及抗氧化酶活性等，明確3個雜交大豆在抗旱生理方面的共性和特性，進而通過耐旱性比較選育抗旱雜交大豆品種。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料為3個雜交大豆品種/系，分別為晉豆48，優勢豆-A-5和雜交豆6號，以上材料均由山西農業大學農業基因資源研究中心雜交大豆課題選育并提供。

1.2 種子處理

從3份雜交大豆品種/系中選擇子粒完整、大小一致、表面光滑的種子各90粒，然后利用0.1%的氯化汞在超凈臺進行浸泡滅菌6 min。浸泡后的大豆置于滅菌水中沖洗3～4次，然后將種子置于滅菌濾紙上自然晾干表面水分。將每個材料的90粒種子分為3份，每份30粒種子置于直徑為9 cm且以雙層濾紙為芽床的培養皿中，加入20 mL滅菌水，與25 ℃恒溫暗處理催芽。露白后挑選生長一致的幼苗置于帶網格的塑料發芽盤，加入適量的Hongland’s營養液，置于PERCIVAL(ARC-41L2-AR)生長箱中生長，設置晝夜溫度為30和25 ℃，相對濕度恒定60%，光暗周期為 16/8 h。待大豆生長到子葉葉片展開后，移栽到帶有網格的泡沫培養板上并用定植棉固定根部(圖1)，然后置于Hongland’s營養液中生長，每2 d更換1次培養液，生長至第1個三小葉期進行干旱脅迫。

圖1 3個雜交大豆水培定植

1.3 干旱脅迫處理

干旱脅迫處理采用不同濃度的聚乙二醇6000(PEG-6000)溶液模擬。PEG-6000溶液(Hongland’s營養液為溶液)濃度(質量比)分別設3個處理，5%、10%和20%，以Hongland’s營養液為對照(PEG-6000濃度為0%)，干旱脅迫時間為2 d。

1.4 測定項目和方法

1.4.1 光合參數的測定 用 LI-6400便攜式光合儀于上午 10:00—12:00 測定葉片凈光合作用速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)。每個材料測定 3 株，每株測定3個葉片，最后取平均值。

1.4.2 葉綠素含量的測定 利用葉綠素儀(SPAD-502 Plus，Konica Minolta，Japan)測定不同品種大豆葉片的葉綠素相對含量。每個材料測定3 株，每株測3個不同部位，然后取平均值。

1.4.3 生理指標和抗氧化酶系活性的測定 由北京索萊寶科技有限公司購買的可溶性蛋白、可溶性糖、游離脯氨酸(Pro)含量、超氧化物歧化酶(SOD) 活性、過氧化物酶(POD) 活性的測定試劑盒進行測定，每個指標測3次重復。

1.5 數據統計和分析

利用Excel 2010分析所有數據并作圖，SAS v8進行方差分析。大豆抗旱性綜合評價指標參考劉學義[14]的平均隸屬函數法。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對雜交大豆苗期生長的影響

使用不同濃度PEG-6000溶液對3份雜交大豆苗期脅迫結果見圖2，隨著濃度增大，大豆苗期生長受到不同程度的抑制。在5% PEG-6000和10% PEG-6000處理下，各材料苗期表型與對照(0% PEG-6000)無顯著差異，但是在20% PEG-6000處理后與對照相比，表現出不同程度的生長抑制。

A. CK (PEG-6000 濃度0%)；B. PEG-6000 濃度5%；C. PEG-6000 濃度10%；D. PEG-6000 濃度20%；標尺：3 cm

2.2 干旱脅迫對雜交大豆苗期葉綠素含量的影響

由圖3可以看出，3份雜交大豆苗期葉片在不同濃度PEG-6000溶液處理條件下葉綠素含量(SPAD值)并不一致。對照處理后，3份雜交大豆苗期葉片的葉綠素含量差異顯著，優勢豆-A-5苗期葉片葉綠素含量最高，為35.6，雜交豆6號為次之(35.4)，晉豆48葉綠素含量只有26.1。隨著干旱脅迫的加劇，大豆苗期葉片的葉綠素含量逐漸增加，并且趨勢較一致。3份雜交大豆苗期葉片葉綠素含量均隨著PEG-6000溶液濃度的增加而增加，其次可以看出5% PEG-6000和10% PEG-6000處理后，優勢豆-A-5苗期葉片的葉綠素含量與對照差異不顯著，但是晉豆48和雜交豆6號差異顯著。20% PEG-6000溶液濃度處理后，3個雜交大豆品種間呈現出顯著差異，趨勢與對照處理一致，優勢豆-A-5苗期葉片葉綠素含量最高，為47.9，雜交豆6號為43.6，晉豆48為36.5。

不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一處理不同品種間差異顯著(P<0.05)

2.3 干旱脅迫對雜交大豆苗期葉片光合生理指標的影響

由圖4可以看出，隨著PEG-6000溶液濃度逐漸加大，3種雜交大豆苗期葉片的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間二氧化碳濃度(Ci)和氣孔導度(Gs)變化趨勢在不同品種間有差異。晉豆48苗期葉片的Pn在5%PEG-6000溶液濃度處理后表現出與對照無顯著差異(圖4-A)，而在10%PEG-6000和20%PEG-6000溶液濃度處理后與對照則呈顯著差異，尤其20%PEG-6000溶液濃度處理后Pn由對照17.47 μmol/(m2·s)降為6.09 μmol/(m2·s)。優勢豆-A-5苗期葉片Pn的下降趨勢與晉豆48一致，但是隨著PEG-6000溶液濃度逐漸加大，雜交大豆6號Pn逐漸下降。然而不同雜交大豆品種在同樣的PEG-6000溶液濃度處理下，也表現出顯著差異，如對照優勢豆-A-5的Pn最大，其次是雜交大豆6號，晉豆48的Pn最低。3種雜交大豆苗期葉片的胞間二氧化碳濃度(Ci)在不同PEG-6000溶液濃度處理下變化趨勢不一致(圖4-B)，晉豆48苗期葉片的Ci隨著PEG-6000溶液濃度的增加而降低，優勢豆-A-5的Ci反而由上升趨勢，雜交豆6號呈現先上升后下降的趨勢，并且對照處理后3個雜交大豆苗期葉片的Ci差異不顯著，進而說明干旱脅迫后對不同雜交大豆品種的Ci有不同的影響，不同濃度的PEG-6000對造成不同雜交大豆品種的Ci原因也不同。干旱脅迫對不同雜交大豆品種的氣孔導度(Gs)影響趨勢與Pn相近，均隨著 PEG-6000溶液濃度的增大而下降(圖4-C，4-D)，同一PEG-6000溶液濃度下，不同雜交大豆品種間也呈現顯著差異，整體趨勢優勢豆-A-5受干旱脅迫后影響較小。

不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一處理不同品種間差異顯著(P<0.05)，下同

分析凈光合作用速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)對干旱脅迫響應的相關性(表1)，結果表明，Pn對干旱脅迫的響應分別與Gs、Ci和Tr對干旱脅迫的響應之間均存在極顯著正相關(P<0.01)，而且Gs對干旱脅迫的響應分別與Ci和Tr對干旱脅迫的響應之間均存在極顯著正相關(P<0.01)，Ci和Tr對干旱脅迫的響應之間也存在極顯著正相關(P<0.01)。

表1 凈光合作用速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)對干旱脅迫響應的相關性分析

2.4 干旱脅迫對雜交大豆苗期葉片中可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸的影響

如圖5所示，隨著PEG-6000溶液濃度不斷增加，3種雜交大豆苗期葉片的可溶性糖含量、可溶性蛋白質含量和脯氨酸含量均呈現上升趨勢。可溶性糖含量在3個雜交大豆苗期葉片對照組中表現出顯著差異(圖5-A)，其中優勢豆-A-5的可溶性糖含量最高，為32.38 mg/mL，晉豆48(29.95 mg/mL)和雜交豆6號(28.99 mg/mL)的可溶性糖含量差異不顯著；隨著干旱脅迫的加劇，3個雜交大豆苗期葉片的可溶性糖含量均上升，并且不同品種間在相同濃度處理下也呈現顯著差異。如圖5-B所示，在4組處理中優勢豆-A-5苗期葉片的可溶性蛋白含量顯著高于其它兩個雜交種，每個品種的可溶性蛋白含量隨著PEG-6000溶液濃度的增加呈緩慢增長趨勢，沒有可溶性糖含量和脯氨酸含量(圖5-C)增加幅度大。干旱脅迫后，脯氨酸的含量隨著PEG-6000溶液濃度的增加而急劇增加，在PEG-6000溶液濃度為20%處理后，晉豆48 的脯氨酸含量最高，為992.99 μg/g，其次是優勢豆-A-5，為868.27 μg/g，雜交豆6號最低，為836.67 μg/g。從以上結果可以看出優勢豆-A-5較其它兩個雜交豆耐旱。

圖5 不同濃度PEG-6000處理對雜交大豆苗期葉片滲透調節物質的影響

2.5 干旱脅迫對雜交大豆苗期葉片中抗氧化酶活性的影響

干旱脅迫后，3種雜交大豆苗期葉片中抗氧化酶活性隨著PEG-6000溶液濃度的增加，其含量也呈現急劇上升趨勢(圖6)，說明干旱脅迫促使雜交大豆體內形成免受傷害防御系統，從而超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)作為主要保護酶其活性顯著增強。5%PEG-6000和10% PEG-6000處理下，3個雜交種苗期葉片中的SOD活性與對照相比均有上升，但是幅度不大，20% PEG-6000處理后，優勢豆-A-5和雜交豆6號苗期葉片中的SOD活性急劇顯著上升，晉豆48的上升幅度較小(圖6-A)。

圖6 不同濃度PEG-6000處理對雜交大豆苗期葉片抗氧化酶活性的影響

過氧化物酶(POD)作為另一個主要保護酶其活性隨著PEG-6000溶液濃度的增加也呈現急劇增強(圖6-B)。不同濃度干旱脅迫下，3個雜交大豆苗期葉片中POD活性均顯著高于對照。5%PEG-6000處理下，雜交豆6號的增幅最大，其次是優勢豆-A-5，晉豆48最低；10%PEG-6000處理下，3個雜交大豆苗期葉片中POD活性整體增幅均顯著高于5%PEG-6000處理，然而20% PEG-6000處理下，其增幅從大到小依次為：晉豆48(237.33%)>雜交豆6號(79.25%)>優勢豆-A-5(43.58%)。

2.6 雜交大豆苗期抗旱性綜合評價

由2.1～2.5的結果可以看出，雜交大豆抗旱性受不同因素影響，并且同一因素在不同品種間也存在較大差異，很難從單一因素確定3個雜交大豆苗期的抗旱性。同時發現20% PEG-6000脅迫后的各個性狀指標明顯高于5% PEG-6000和10% PEG-6000，因此筆者采用20% PEG-6000脅迫后的各個指標值，通過隸屬函數法來綜合評價3個雜交大豆苗期的抗旱性。從表2可以看出，3種雜交大豆的抗旱性從大到小分別為：優勢豆-A-5>雜交豆6號>晉豆48，平均隸屬函數值分別為0.75，0.47和0.21。

表2 雜交大豆各項抗旱生理指標相對值的隸屬函數值

3 討 論

干旱是影響植物正常生長和減少產量的主要環境因素之一，而大豆的抗旱性是一個非常復雜的性狀，受多因素影響，不同發育期對抗旱性也存在一定差異，并且可能之間也不存在相關性[15-16]。對于大豆苗期抗旱性研究，前人主要采用盆栽反復干旱法[11,13]，對苗期干旱脅迫后測定生理指標和產量性狀，然后進行抗旱性評價。但是本研究在生長間采用PEG-6000水培模式模擬大豆苗期干旱脅迫，通過測定與大豆抗旱性密切相關的光合生理指標、滲透物質含量和抗氧化酶活性等，最后通過隸屬函數的方法鑒定3個雜交大豆苗期的抗旱性。相比于前人研究，利用PEG-6000水培模式并且在生長間更容易控制大豆生長環境，減少環境誤差，并且利用營養液培養大豆15 d左右生長期操作較為方便。

植物葉片中的葉綠素是光合作用的主要參與者，其含量可以一定程度上反應光合作用強度，從而反應植物生長情況，同時也可反映植物抗逆性的強弱。本研究顯示，3個雜交大豆在不同程度干旱脅迫后，其SPAD值的趨勢是先變化不顯著，后期加大干旱脅迫強度后出現上升趨勢，該結果與劉麗平等、王建偉等、馬曉華等[17-19]結果一致。說明干旱脅迫后雜交大豆葉片中葉綠素含量升高由可能是由于葉片中葉綠素濃縮效應導致。植物受到干旱脅迫后，其葉片光合作用會受到一定的影響[20]，主要表現在氣孔關閉，從而導致植物對二氧化碳和水分的利用率下降，通過測定凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間二氧化碳濃度(Ci)和氣孔導度(Gs)等指標來鑒定其影響程度[21-23]。本研究中，隨著干旱脅迫的加劇，3個雜交大豆苗期葉片均表現出Pn、Tr、Ci和Gs下降的趨勢，這與前人[24-25]研究結果一致。干旱脅迫下，植物葉片的Pn下降應該主要是由于干旱導致葉片組織損傷，從而使光合酶等活性下降。

隸屬函數是一種常見的多個影響因子綜合評價的方法，其可以避免由單一因素導致分析問題的片面性，從而使評價結果更科學可靠。本研究利用隸屬函數值法將影響雜交大豆抗旱性的10個指標進行綜合評價，從而篩選出3個雜交大豆抗旱性最好的是優勢豆-A-5，其次是雜交豆6號，晉豆48抗旱性較差。并且發現抗旱性最強的是優勢豆-A-5，其具體表現在干旱脅迫后光合生理指標(Pn、Gs、Ci和Tr)顯著高于其它兩個品種，說明優勢豆-A-5比其它兩個品種具有較強的葉片保水性和光合自身調節能力；而雜交豆6號抗旱性主要表現在滲透調節物質和抗氧化酶等方面，如可溶性蛋白質含量、脯氨酸含量、SOD和POD活性比其它兩個品種高，但是整體抗旱性略遜色于優勢豆-A-5。晉豆48干旱脅迫下在葉綠素含量和可溶性糖含量值較高，但是與其它兩個品種相比，抗旱性能力差。

4 結 論

本研究利用3個雜交大豆為試驗材料進行苗期抗旱性生理響應實驗，通過測定葉綠素含量、光合生理指標、滲透調節物含量和抗氧化酶活性等生理指標，并且通過隸屬函數值法進行綜合評價，得出優勢豆-A-5耐旱性最強。該結果為后期抗旱性雜交大豆育種提供數據支撐，并且將優勢豆-A-5作為耐旱雜交大豆進行大面積試種和推廣。