lnc-POTEG-4調控miR-498/AR表達抑制食管鱗狀細胞癌鐵死亡的發生

米彩鋒，趙武斌，李亞利，余儒桓，楊洋

(1.平頂山學院第一附屬醫院 消化內科，河南 平頂山 467000； 2.平頂山學院第一附屬醫院 醫教部，河南 平頂山 467000； 3.鄭州大學第一附屬醫院 胸外科，河南 鄭州 450052)

食管癌是一種常見的消化道腫瘤，其主要病理類型有食管腺癌(adenocarcinoma of esophagus，EAC)和食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[1]。EAC在西方國家很常見，而ESCC是包括中國在內的亞洲地區的主要病理類型[2]。研究ESCC的分子機制對治療和預后具有重要意義。

最近的研究表明，在某些癌細胞中存在一種鐵依賴性的細胞死亡形式，稱為鐵死亡[3]。與細胞壞死和凋亡不同，鐵死亡的過程以脂質過氧化產物和鐵代謝產生的致命活性氧(ROS)的積累為特征[4]。值得注意的是，鐵死亡在調節多種腫瘤的進展中起著重要作用[5]。一些學者假設鐵死亡可能是惡性腫瘤的一種治療方法，而這種方法的有效程度有待進一步探究。

長非編碼RNA(lncRNAs)已受到研究者的廣泛關注，根據定義，lncRNAs由200個核苷酸組成，不具有功能性蛋白質編碼能力[6]。越來越多的證據證實，LncRNA靶向下游microRNA(miRNA)和基因誘導癌細胞鐵死亡[7]。如LINC00336在肺癌中表達上調，并作為癌基因抑制肺癌細胞鐵死亡[8]。本研究借助GEO芯片表達數據發現lnc-POTEG-4在ESCC中呈顯著高表達，而lnc-POTEG-4在ESCC中的功能并未有相關報道。因此，有必要對lnc-POTEG-4在ESCC中的作用及其機制進行探討。miR-498作為lnc-POTEG-4的靶點，已被證實在ESCC組織和細胞中表達下調，能夠抑制ESCC細胞增殖、凋亡和遷移[9]。進一步找到miR-498的下游靶基因雄激素受體(AR)，根據以往研究，AR的高表達與ESCC患者總體生存率較低相關，沉默AR能夠抑制腫瘤生長[10]。

本研究旨在通過介導鐵死亡，來確定lnc-POTEG-4在ESCC進展中的作用及其潛在的促腫瘤機制。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

人食管上皮細胞系Het-1a和ESCC細胞系Eca9706、Eca109、KYSE150、KYSE450來自中國科學院細胞庫，Opti-MEM培養基脂質體3000和TRIzol試劑來自美國Invitgen公司，miR-498模擬物/抑制劑、pcDNA-AR和對照載體購自上海吐露港生物科技有限公司，Opti-MEM培養基(31985070)和QIAGEN質粒提取試劑盒(12943)購自上海凌儀生物科技有限公司，ROS檢測試劑盒-DCFHDA和丙二醛(MDA)檢測試劑盒(GL2090)來自北京百奧萊博科技有限公司，鐵比色分析試劑盒來自深圳市錦賢科技有限公司，KAPATMSYBR?快速定量PCR試劑盒購自北京普凱瑞生物科技有限公司，Erastin、NRF2抑制劑、GPNA和化合物968均來自MCE公司，雙熒光素酶基因檢測試劑盒(D0010)和CCK-8檢測試劑盒(CA1210)來自北京索萊寶科技有限公司，熒光原位雜交試劑盒為上海歌凡生物科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 組織采集 對平頂山學院第一附屬醫院2018年9月至2020年12月間接受ESCC切除術但未進行術前放化療的62例患者的ESCC組織和鄰近正常組織進行采集。在分析之前，所有樣品都儲存在-80 ℃ 下。所有參與研究的患者都簽署了知情同意書，研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2.2 細胞培養 Het-1a和Eca9706、Eca109、KYSE150、KYSE450在RPMI 1640培養基中培養，加入10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/鏈霉素和1% L-谷氨酰胺，細胞在37 ℃、含5%CO2的培養箱中培養。

1.2.3 細胞轉染 將Eca109細胞接種于6孔培養板中培養過夜。將lnc-POTEG-4亞克隆到pEGFP-N1載體中，將lnc-POTEG-4 ShRNA序列連接到pGPU6/GFP/Neo載體中，構建si-lnc-POTEG-4質粒，用QIAGEN質粒提取試劑盒提取過表達質粒和干擾質粒，將miR-498模擬物/抑制劑、pcDNA-AR、si-lnc-POTEG-4和對照載體分別用脂質體3000試劑和Opti-MEM培養基轉染Eca109細胞。

1.2.4 CCK-8試驗 CCK-8試劑盒用于檢測Eca109細胞的活力。細胞以每孔1×104個細胞的密度接種在96孔板中，并在37 ℃、含5%CO2培養箱中培養2 h以使細胞黏附。向每個孔中添加10 μl CCK-8溶液并混合，然后再培養細胞2 h。使用雙波長微孔板讀取器在450 nm處測量OD值。

1.2.5 ROS和MDA生成測定 使用ROS檢測試劑盒-DCFHDA檢測細胞內ROS，用熒光顯微鏡監測DCF熒光以確定ROS水平。采用MDA檢測試劑盒(TBA微板法)檢測細胞內脂質過氧化反應。

1.2.6 Fe2+水平的測定 將細胞以1×105個細胞·孔-1的密度在6孔板中培養24 h后用Erastin或NRF2抑制劑處理，根據用戶使用說明書使用鐵比色分析試劑盒評估細胞內Fe2+水平。

1.2.7 qRT-PCR 使用TRIzol試劑從組織(ESCC及其對照)和細胞(Eca109)中純化和提取總RNA，以總RNA作為模板合成互補DNA(cDNA)。使用KAPATMSYBR?快速定量PCR試劑盒按照制造商的使用說明混合反應溶液，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(對于lnc-POTEG-4和AR)或U6(對于miR-498)作為內參，lnc-POTEG-4、miR-498和AR的水平通過2-ΔΔCT方法進行標準化。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR序列Tab 1 qRT-PCR sequences

1.2.8 熒光原位雜交 細胞蓋玻片用4%多聚甲醛固定20 min然后將蓋玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上洗滌3次，每次5 min。用免疫組化筆畫圈，根據不同組織的特點，蛋白酶K(20 μg·ml-1)處理1～5 min，蓋玻片用PBS洗滌3次，每次5 min。添加預混合溶液，并在37 ℃培養箱中培養1 h后倒出。添加雜交溶液，使載玻片在4 ℃下雜交過夜。將蓋玻片在SSC(2×)中洗滌1次10 min，在SSC(1×)中洗滌兩次各5 min，并在SSC(0.5×)中洗滌1次10 min。加入DAPI染料溶液，將蓋玻片在黑暗中培養8 min，用PBS洗滌并用抗熒光猝滅劑密封。在熒光顯微鏡下觀察lnc-POTEG-4的細胞定位。lnc-POTEG-4的熒光探針序列為：CTGATATCAAGACGGGAATAATCATAGATGGC。

1.2.9 雙熒光素酶報告實驗 含miR-498互補序列的lnc-POTEG-4/AR片段插入熒光素酶的基本載體psiCHECK-2，命名為WT-lnc-POTEG-4/WT-AR。同時構建在miR-498結合位點含有突變lnc-POTEG-4/AR的載體，命名為MUT-lnc-POTEG-4/MUT-AR。接下來在miR-498模擬物或其對照物存在下，將上述野生型或突變型報告質粒轉染到細胞中。按照用戶使用說明書，使用雙熒光素酶報告分析系統檢查熒光素酶活性。

1.2.10 生物信息學分析 從NCBI數據庫(http:∥ncbi.nlm.nih.gov)獲取GEO芯片表達數據GSE120356，構建全基因組范圍內的LncRNAs表達譜；差異篩選條件為adj.P.Value<0.05和|Log2FC|>1；在LncBook(http:∥bigd.big.ac.cn/lncbook/index)和LncRNASNP數據庫(http:∥bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP#!/)獲取lnc-POTEG-4的靶miRNAs；TargetSan(http:∥targetscan.org/vert_72/)和miRDB(http:∥mirdb.org)用于獲取miR-498的下游靶基因；韋恩圖通過Venn(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制；DAVID在線數據庫(http:∥david.ncifcrf.gov)對目標基因進行KEGG功能富集分析；DisGeNET數據庫(http:∥disgenet.org/search)用于獲取ESCC的疾病風險基因；STRING(https:∥string-db.org/)用于預測基因間的相互作用關系。

1.3 統計學處理

實驗數據采用SPSS 20.0統計軟件進行分析。采用t檢驗分析兩組間的差異，并用單因素方差分析比較多組間的差異。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 生物信息學工具預測ESCC中可能的分子機制

獲取ESCC的GEO芯片表達數據GSE120356，構建全基因組范圍內的LncRNAs表達譜。我們發現在配對的5例ESCC組織和癌旁正常組織中，共有2 366個lncRNA差異表達，其中1 032個顯著上調，1 334個顯著下調。我們在異常高表達的LncRNAs中選取P值校正后(adj.P.Val)顯著差異表達的10個LncRNAs繪制熱圖，其中發現lnc-POTEG-4在ESCC中顯著高表達，且在LncRNASNP數據庫預測得到lnc-POTEG-4在ESCC中的高表達。但lnc-POTEG-4在ESCC中的功能性研究尚未有相關報道，因此有必要對lnc-POTEG-4在ESCC中的作用及機制進行探討。

分別在LncBook和LncRNASNP數據庫獲取lnc-POTEG-4的下游靶miRNAs并取交集，交集結果為hsa-miR-498、hsa-miR-335-3p、hsa-miR-452-3p、hsa-miR-380-3p和hsa-miR-411-3p。僅hsa-miR-498在ESCC中有較為明確的研究依據，因此選擇miR-498進行后續分析。在TargetScan和miRDB獲取miR-498的下游靶基因并取交集，共有289個交集靶基因，將這289個靶基因進行KEGG功能富集分析，共有7個輸出結果，將其繪制為氣泡圖，其中癌癥通路的term較為顯著富集(Fold Enrichment=2.252 966 518 025 84;P=0.011 197)，將其作為候選基因選取范圍。該term中有13個基因(RB1、TCF7L2、RALA、PTCH1、PTGER3、GNAI3、CBL、GNA13、AR、CDK6、EP300、ITGA6、SKP2)，與ESCC(CUI：C1142025)的疾病風險基因(ADRA1D、LTA、BRCA1和BRAF)在STRING在線預測網站預測二者間的蛋白相互作用關系，其中AR與其他基因間的緊密連接作用最強，并根據以往研究選用AR進行后續研究。見圖1。

A.GSE120356芯片中的差異表達miRNAs；B.LncRNAs差異表達的熱圖；C.LncRNASNP數據庫預測結果；D.lnc-POTEG-4在LncBook和LncRNASNP數據庫的交集靶miRNAs；E.lnc-POTEG-4和miR-498的相互作用結合位點；F.miR-498在TargetScan和miRDB中的交集靶基因；G.KEGG分析結果氣泡圖；H.蛋白相互作用關系圖；I.miR-498和AR的特異性結合位點圖1 生物信息學工具預測ESCC中可能的分子機制Fig 1 Bioinformatics tools predict possible molecular mechanisms in ESCC

2.2 在ESCC中lnc-POTEG-4和AR表達升高，miR-498表達降低

為了探討lnc-POTEG-4在ESCC中的生物學功能，我們采用qRT-PCR方法檢測lnc-POTEG-4在ESCC組織和細胞系中的相對表達。結果顯示，與鄰近正常組織和Het-1a相比，ESCC組織和細胞中的lnc-POTEG-4和AR明顯上調，而miR-498在ESCC組織和細胞中顯著下調(圖2)。這些數據表明，lnc-POTEG-4、miR-498和AR的異常表達可能參與了ESCC的進展。

A-C.lnc-POTEG-4、miR-498和AR在ESCC組織及鄰近正常組織中的表達；D-H.lnc-POTEG-4、miR-498和AR在Het-1a和Eca9706、Eca109、KYSE150、KYSE450中的mRNA和蛋白表達。* 與Het-1a相比，P<0.05圖2 lnc-POTEG-4和AR在ESCC中表達上調，miR-498表達下調Fig 2 Inc-POTEG-4 and AR were up-regulated in ESCC, and miR-498 was down-regulated

2.3 沉默lnc-POTEG-4誘導Eca109細胞鐵死亡

本研究考慮到lnc-POTEG-4在ESCC中高表達，我們將si-lnc-POTEG-4轉染Eca109細胞，轉染后檢測到lnc-POTEG-4的表達顯著降低(圖3A)。使用CCK-8法評估下調lnc-POTEG-4后Eca109細胞的增殖活力，結果表明si-lnc-POTEG-4較si-NC組顯著抑制細胞的活力(圖3B)。此外，為了進一步證明鐵死亡是否引起Eca109細胞的這種結果，我們用幾種細胞死亡抑制劑處理Eca109細胞。如圖3C所示，與對照組相比，沉默lnc-POTEG-4或鐵死亡誘導劑Erastin處理顯著降低Eca109細胞的活力。此外，用鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1(Fer-1)預處理細胞可消除沉默lnc-POTEG-4誘導的鐵死亡，但凋亡抑制劑ZVAD-FMK和壞死抑制劑Necro-sulfonamide(Nec)不起作用。此外，我們評估了鐵死亡過程中的兩個主要過程，包括脂質過氧化和鐵積累，發現沉默lnc-POTEG-4或Erastin處理顯著提高了Eca109細胞的MDA和ROS生成水平(圖3D、E)，并提高了細胞內Fe2+水平(圖3F)。綜上所述，沉默lnc-POTEG-4對Eca109細胞具有抗增殖作用。

A.qRT-PCR檢測lnc-POTEG-4的表達；B、C.CCK-8檢測細胞活力；D.MDA水平測定；E.ROS水平測定；F.Fe2+含量測定。 與si-NC細胞相比，P<0.05；& 與Blank組相比，P<0.05圖3 沉默lnc-POTEG-4誘導Eca109細胞鐵死亡Fig 3 Silencing lnc-POTEG-4 induces ferroptosisin Eca109 cells

2.4 si-lnc-POTEG-4誘導的Eca109細胞鐵死亡需要谷氨酰胺代謝的促進

圖4A顯示了谷氨酰胺代謝在癌細胞脂質過氧化誘導的鐵死亡中的調節過程，用谷氨酰胺代謝關鍵調控基因抑制劑(GPNA和化合物968)處理Eca109細胞，用CCK-8法測定其活力。如圖4B所示，si-lnc-POTEG-4顯著抑制Eca109細胞的活力，而GPNA或968預處理顯著減弱si-lnc-POTEG-4誘導的細胞死亡。為了進一步驗證這一假設我們進行了研究，結果表明GPNA和968通過降低細胞內Fe2+水平、MDA生成和ROS水平來減輕si-lnc-POTEG-4誘導的鐵死亡(圖4C～E)?？傊聊琹nc-POTEG-4通過調節谷氨酰胺代謝誘導Eca109細胞鐵死亡。

A.谷氨酰胺代謝在鐵死亡中的示意圖；B.CCK-8檢測細胞活力；C.MDA水平測定；D.ROS水平測定；E.Fe2+含量測定。& 與Blank組相比，P<0.05圖4 si-lnc-POTEG-4誘導的Eca109細胞鐵死亡需要促進谷氨酰胺的代謝Fig 4 si-lnc-POTEG-4-induced ferroptosis in Eca109 cells requires promotion of glutamine metabolism

2.5 lnc-POTEG-4是miR-498的海綿

lnc-POTEG-4主要存在于細胞質中，表明它能夠與miRNA相互作用(圖5A)。為了驗證lnc-POTEG-4是否能與miR-498結合，進行了雙熒光素酶報告實驗。我們構建了WT-lnc-POTEG-4和MUT-lnc-POTEG-4，分別與miR-498模擬物和miR-NC共轉染Eca109細胞，結果顯示，WT-lnc-POTEG-4和miR-498模擬物共轉染細胞的熒光素酶活性顯著降低(圖5B)。qRT-PCR檢測轉染si-lnc-POTEG-4后細胞miR-498的相對表達量，結果顯示，轉染si-lnc-POTEG-4的Eca109細胞miR-498的表達明顯高于si-NC轉染的細胞(圖5C)。此外，我們進一步分析得到lnc-POTEG-4和miR-498在ESCC中的表達呈顯著負相關(圖5D)。這些結果表明lnc-POTEG-4能夠充當miR-498的海綿。

A.熒光原位雜交實驗結果(×200)；B.雙熒光素酶報告實驗結果；C.qRT-PCR檢測miR-498的表達；D.相關性分析結果。 與si-NC組相比，P<0.05圖5 lnc-POTEG-4是miR-498的海綿Fig 5 lnc-POTEG-4 is a sponge of miR-498

2.6 抑制miR-498可部分抑制沉默lnc-POTEG-4促進的鐵死亡

我們進一步評估lnc-POTEG-4通過調節miR-498在ESCC細胞鐵死亡中的作用。用miR-498 inhibitor和si-lnc-POTEG-4共轉染細胞，并通過qRT-PCR檢測其轉染效率(圖6A)。miR-498的下調顯著抑制si-lnc-POTEG-4對細胞活力的抑制作用(圖6B)。此外，miR-498 inhibitor顯著降低si-lnc-POTEG-4誘導的ROS水平、MDA產生和細胞內Fe2+水平(圖6C-E)。抑制miR-498可部分逆轉沉默lnc-POTEG-4誘導的ESCC細胞鐵死亡。

A.qRT-PCR檢測miR-498的表達；B.CCK-8檢測細胞活力；C.MDA水平測定；D.ROS水平測定；E.Fe2+含量測定。與si-NC細胞相比，P<0.05；#與si-lnc-POTEG-4+miR-NC組相比，P<0.05圖6 抑制miR-498可部分抑制沉默lnc-POTEG-4促進的ESCC細胞鐵死亡Fig 6 Inhibition of miR-498 partially inhibits ferroptosis in ESCC cells promoted by silencing lnc-POTEG-4

2.7 AR作為miR-498的靶點被si-lnc-POTEG-4抑制

為了驗證miR-498是否以AR為靶點，我們采用了雙熒光素酶報告分析法。結果表明，WT-AR和miR-498模擬物共轉染的細胞的熒光素酶活性顯著降低(圖7A)。用qRT-PCR檢測轉染si-lnc-POTEG-4和miR-498 inhibitor的細胞中AR的相對表達，結果顯示，Eca109細胞中轉染si-lnc-POTEG-4細胞的AR表達顯著降低，而miR-inhibitor的轉染上調了AR的mRNA和蛋白表達水平(圖7B～D)。相關性分析表明，AR的表達水平與ESCC組織中的miR-498呈負相關，與lnc-POTEG-4表達呈正相關(圖7E、F)?？傊@些結果表明lnc-POTEG-4通過miR-498靶向AR。

A.雙熒光素酶報告實驗結果；B～D.qRT-PCR和蛋白質印跡法檢測AR的mRNA和蛋白表達；E、F.相關性分析結果。 與si-NC組相比，P<0.05；# 與si-lnc-POTEG-4+miR-NC組相比，P<0.05圖7 AR作為miR-498的靶點被si-lnc-POTEG-4抑制Fig 7 AR as a target of miR-498 and inhibited by si-lnc-POTEG-4

2.8 過表達AR可部分抑制沉默lnc-POTEG-4促進的鐵死亡

我們進一步探討AR在沉默lnc-POTEG-4誘導的鐵死亡中的作用，初步將pcDNA-AR轉染Eca109細胞，qRT-PCR檢測其轉染效率(圖8A)。此外，在Eca109細胞中，過表達AR顯著抑制了下調lnc-POTEG-4對細胞活力的抑制作用(圖8B)。過表達AR可顯著降低si-lnc-POTEG-4誘導的ROS水平、MDA產生和細胞內Fe2+水平(圖8C-E)?？傮w而言，沉默lnc-POTEG-4通過抑制Eca109細胞中的AR誘導鐵死亡。

A.qRT-PCR檢測AR的表達；B.CCK-8檢測細胞活力；C.MDA水平測定；D.ROS水平測定；E.Fe2+含量測定。 與si-NC細胞相比，P<0.05；$ 與si-lnc-POTEG-4+pcDNA-NC組相比，P<0.05圖8 過表達AR可部分抑制沉默lnc-POTEG-4促進的鐵死亡Fig 8 Overexpression of AR partially inhibits ferroptosis promoted by silencing lnc-POTEG-4

3 討 論

ESCC是常見的胃腸道惡性腫瘤[11]。本研究探討了lnc-POTEG-4通過調節鐵死亡促進ESCC細胞惡性生物學行為的分子機制。lnc-POTEG-4在ESCC組織和細胞中均異常高表達，沉默lnc-POTEG-4可明顯誘導Eca109細胞鐵死亡，抑制細胞增殖活力。從機制上看，lnc-POTEG-4海綿miR-498上調AR的表達，以抑制ESCC細胞鐵死亡，發揮促腫瘤作用。

近年來，越來越多的證據表明，鐵死亡在放療、化療以及多發性惡性腫瘤的發生發展中起著重要的調節作用，如阿帕替尼通過靶向ELOVL6/ACSL4信號通路促進大腸癌細胞鐵死亡[12]。此外，谷氨酰胺分解途徑是細胞生長、凋亡、鐵死亡、自噬的關鍵調節因子，抑制谷氨酸代謝能夠有效阻斷細胞鐵死亡進程[13]。

本研究借助GEO數據庫并采用limma包進行差異性分析，得到lnc-POTEG-4在ESCC中顯著高表達，且在LncRNASNP數據庫預測到同樣的趨勢。有報道[14]發現lnc-POTEG-4在ESCC中異常高表達，但對于其在ESCC中發揮的功能尚未有相關探索。本研究證實了lnc-POTEG-4在ESCC組織和細胞中的表達均顯著高于癌旁正常組織和Het-1a細胞，沉默lnc-POTEG-4顯著降低Eca109細胞的增殖活力，并能夠提高ROS、MDA和細胞內Fe2+水平，以及阻斷谷氨酰胺的攝取進而促進脂質過氧化誘導的細胞鐵死亡。

越來越多的證據證實，miRNA作為一種新型的調控因子，在包括ESCC在內的多種惡性腫瘤的發生發展中起著重要的作用，同時也證實了癌基因或抑癌基因的作用[15]。此外，一些研究已經探索了miRNA在癌癥中的治療靶點，miRNAs引起的鐵死亡已經得到證實，如腫瘤相關成纖維細胞(CAF)通過分泌miR-522靶向ALOX15并阻斷ROS積聚來抑制胃癌細胞的鐵死亡[16]。以往的研究[17-18]表明，miR-498在ESCC中顯著低表達，并對ESCC細胞增殖、克隆和侵襲具有抑制作用。本研究首先驗證了miR-498在ESCC中顯著低表達，并采用雙熒光素酶報告實驗驗證了miR-498和lnc-POTEG-4的相互作用關系，lnc-POTEG-4能夠顯著抑制miR-498的表達。敲減miR-498能夠部分逆轉沉默lnc-POTEG-4降低的Eca109細胞活力，降低ROS、MDA和Fe2+水平，抑制細胞鐵死亡。

我們進一步利用TargetScan和miRDB靶向關系與網站篩選得到miR-498的下游靶基因AR。AR在ESCC中的作用已得到初步證實，AR的高表達與ESCC患者總體存活率較低相關，沉默AR能夠抑制腫瘤生長[19]，AR拮抗劑能夠有效誘導前列腺癌細胞鐵死亡[20]。姜黃素類似物能夠抑制谷胱甘肽過氧化物酶(GPX4)進而誘導膠質母細胞瘤細胞鐵死亡，而在GPX4存在的情況下，過表達AR能夠防止鐵死亡[21]。本研究首先采用雙熒光素酶報告實驗驗證了AR和miR-498的靶向結合關系，其次qRT-PCR法驗證了AR在ESCC中為顯著高表達，與lnc-POTEG-4在ESCC中的表達呈正相關，與miR-498呈負相關。lnc-POTEG-4可海綿miR-498上調AR的表達。功能性實驗結果顯示，沉默lnc-POTEG-4能夠誘導Eca109細胞鐵死亡的發生，而過表達AR能夠對這一結果部分逆轉。這表明lnc-POTEG-4可能通過上調AR抑制ROS、MDA和Fe2+水平，并阻斷谷氨酰胺的代謝來抑制ESCC細胞鐵死亡的發生。

綜上所述，我們的研究結果證實了lnc-POTEG-4在ESCC的發生發展中起著至關重要的作用。此外，lnc-POTEG-4還通過海綿miR-498上調AR的表達，顯著地抑制鐵死亡，促進腫瘤進展。這些發現為ESCC的治療提供了新的靶點。