miR-105聯合MMP-2預測腦膠質瘤術后復發的臨床價值分析

宋旭東，羅波，陳華軒，張逵，王瀟婭

(南充市中心醫院 神經外科，四川 南充 637000)

腦膠質瘤是顱內常見的源自神經膠質細胞的原發性顱腦腫瘤，該病不同病理級別患者的臨床治療方案存在較大差別，且預后差異也較大[1]。膠質瘤具有惡性程度高、術后易復發等特點，雖然對腦膠質瘤的術前評估及治療手段不斷完善，但術后高復發率及高相關并發癥仍是臨床難以解決且急需解決的問題[2]。腦膠質瘤的標準治療以手術切除為主，并結合放化療等綜合治療手段[3]。血漿基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)被認為對溶栓后出血有預測作用[4-5]，MMP-2為最主要的降解細胞外基質之一，與腦膠質瘤之間的關系最為密切，其表達水平與膠質瘤細胞增殖和侵襲性均存在密切相關性[6]。臨床研究[7]表明，降低MMP-2的表達水平可抑制膠質瘤細胞的遷移及侵襲。微小RNA(microRNA，miR)是一類由18～25個核苷酸組成的小分子非編碼RNA,通過與靶基因的mR結合，抑制其翻譯或促進降解,從而起到調控靶基因表達的作用[8]。miR在腫瘤發生發展中的作用已有廣泛研究，且有研究[9]表明可通過部分miR對MMP-2進行調控。miR-105在膠質瘤中高表達[10]，miR-105可通過靶向緊密連接蛋白ZO-1破壞血管內皮屏障，促進腫瘤轉移[11]。

本研究通過選取2018年7月至2021年7月間于我院行手術治療的腦膠質瘤患者，探討腦膠質瘤術后miR-105、MMP-2的表達與腦膠質瘤術后復發的關系，為臨床評估患者的預后及調整合適的治療方式提供理論依據，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2018年7月至2021年7月間于我院行手術治療的腦膠質瘤患者89例，收集腦膠質瘤組織與瘤旁組織。患者原發病灶術后按照WHOCNS2016病理分級：Ⅰ級6例，Ⅱ級30例，Ⅲ級34例，Ⅳ級19例；其中男47例，女42例；年齡28～73歲，平均(45.95±12.44)歲。術后對患者隨訪9個月，每月隨訪1次，觀察是否復發。腦膠質瘤復發診斷：連續兩次MRI檢查顯示病灶明顯增大。納入標準：(1) 初次手術；(2) 術后病理檢查證實為腦膠質瘤；(3) 年齡≥18歲；(4) 術前無放療、化療；(5) 既往體檢及精神狀況正常；(6) 病例資料齊全，臨床隨訪資料完整。排除標準：(1) 患其他原發性腫瘤及癲癇等；(2) 患腦血管疾病(如腦缺血、腦出血、腦梗死等)；(3) 嚴重感染；(4) 心、肺、肝、腎功能不全等；(5) 患病毒性肝炎、自身免疫性疾病；(6) 既往有顱腦損傷史；(7) 交流障礙及既往有精神病史；(8) 未按時隨訪。本研究經我院倫理委員會審核批準，患者或其家屬均自愿且簽署知情同意書。

1.2 細胞株、試劑和儀器

腦膠質瘤細胞株 U251(上海極威生物科技有限公司)；miR提取試劑盒、熒光定量及逆轉錄試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司)；TRIzol(RNA 提取試劑盒) 試劑(大連寶生物工程有限公司)；MMP-2試劑盒(福州邁新公司)；miR-105、MMP-2 DNA 序列，miR-105、MMP-2熒光定量相關引物(上海生工生物工程公司)；RPMI 1640培養基(美國Hyclone公司)；胎牛血清、DMEM 培養液(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)；山羊抗兔一抗、二抗(碧云天生物技術研究所)；RIPA裂解液、PMSF(國藥集團化學試劑有限公司)；細胞計數板(上海五相儀器儀表有限公司)；轉膜儀(江蘇金域國勝實驗儀器廠)；流式細胞儀(美國BD biosciences公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 RT-PCR檢測組織miR-105表達水平

用TRIzol法提取組織總RNA，用Nanodrop分光光度計測定吸光度值(A260 nm/A280 nm)，按試劑盒說明書合成樣品cDNA和進行熒光定量 PCR的擴增，反應條件為:94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增35個循環;72 ℃延伸10 min。用2-ΔΔCt法計算miR-105相對表達量。

1.3.2 免疫組化法檢測組織中MMP-2表達水平

取新鮮腫瘤組織，以10%中性甲醛固定24 h后切塊。按照MMP-2試劑盒說明書采用免疫組化SP法進行檢測，切片機對石蠟標本進行4 μm厚切片，將所取腫瘤標本先進行二甲苯脫蠟，酒精脫水處理，脫水處理完畢后標本在pH值為6.0的酸性緩沖液中進行抗原修復處理，使用枸櫞酸沖洗液連續沖洗3次后加10%的過氧化酶阻斷內源性過氧化酶的活性，室溫孵育后再次緩沖液沖洗3次，加血清再次室溫孵育后處理干凈血清，滴加一抗，37 ℃孵育1 h, PBS洗滌3 min 3次，滴加二抗，37 ℃孵育45 min, PBS洗滌3 min 3次，DAB翻譯顯色后自來水下沖洗，蘇木素復染，常規固定后觀片。免疫組化閱片：選擇腫瘤組織內陽性染色密集區，細胞核/質呈棕黃色顆粒，400倍鏡下計數500個細胞，計算陽性百分率。未發現陽性細胞為-；≤10%的陽性細胞為+；>10%～≤50%的細胞陽性為++；>50%的細胞陽性為+++。+及以上為陽性表達。

1.3.3 細胞實驗

1.3.3.1 細胞培養與轉染 腦膠質瘤細胞U251的培養在 5% CO2、37 ℃的培養箱中進行；將凍存的細胞用鑷子從液氮中取出,放入水浴鍋,快速搖動至完全消融,解凍后以3 000 r·min-1低速離心5 min,吹打細胞成細胞懸液,以1×109L-1接種于培養瓶中，細胞培養液為含100 ml·L-1胎牛血清的DMEM培養液，添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素，置于含5%CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養。細胞轉染參照LipofectamineTM2000試劑說明書上的步驟進行：首先制備LipofectAMINETM2000復合物和DNA復合物(每孔含4 μg濃度為1 μg·μl-1的質粒和246 μl的無血清培養基)，隨后將二者混勻，溫室靜置20 min。將混合物加入6孔板，溫室培養6 h后更換含血清培養基，繼續培養48 h。將處理后U251細胞分為對照組(NC組)、miR-105組、MMP-2組和miR-105聯合MMP-2組,對照組不作任何處理,實驗組中依次加入miR-105、MMP-2和miR-105聯合MMP-2作用于細胞48 h。

1.3.3.2 RT-PCR 用TRIzol法促進細胞裂解，添加氯仿0.2 ml，4 ℃條件下12 000 r·min-1離心15 min，取無色水相上層，添加等體積異丙醇并沉淀。加入適量乙醇(75%)清洗，獲得RNA沉淀，提取總RNA，用Nanodrop分光光度計測定吸光度值(A260 nm/A280 nm)，按試劑盒說明書合成樣品cDNA和進行熒光定量 PCR的擴增，反應條件為:94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增35個循環;72 ℃延伸10 min。存儲在4 ℃條件下。反應產物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。將腦膠質瘤細胞 U251中的總 RNA 與miR提取后，再以總 RNA 為模板，將其反轉錄為cDNA，miR則應用逆轉錄試劑盒。用2-ΔΔCt法計算miR-105、MMP-2表達量。miR-105上游引物5′-TCAAATGCTCAGACTC-3′，MMP-2 上游引物 5′-AGAAGGCTGTGTT-CTTCGCA-3′,GAPDH上游引物5′-TGTTCGACAGTCAGCCGC-3′。

1.3.3.3 蛋白質印跡實驗 細胞轉染48 h后,用RIPA裂解液抽提細胞總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白質含量。以12 000 r·min-1離心10 min，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取。蛋白質印跡實驗時，首先將待檢測蛋白樣品按30 μg·孔-1上樣后行SDS-PAGE電泳，然后用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫牛奶粉液封閉2.0 h后，加入相應的DIRAS3抗體(1∶1 000)或者β-actin抗體(1∶1 000)，在4 ℃條件下加入相應一抗并孵育過夜，清洗。次日取出膜，在室溫孵育30 min，用TBST溶液(TBS，1 ml·L-1Tween-20)洗膜3次，10 min·次-1，洗去殘余的一抗；分別加HRP標記的抗兔或抗小鼠二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h。TBST(TBS，1 ml·L-1Tween-20)洗膜3次，10 min次-1，洗去殘余的二抗后最后加入發光液，曝光處理。ImageJ軟件統計灰度值。

1.3.3.4 CCK-8法檢測U251細胞的增殖實驗 采用CCK-8試劑盒,將處理過的U251細胞以5×103個·孔-1接種在96孔板中, 37 ℃下孵育24、48、72、96 h。加入 CCK-8試劑,再次孵育1 h。采用分光光度計在490 nm波長測量吸光度,平均OD值用于估計每個組的細胞數量。

1.3.3.5 Transwell法檢測U251細胞侵襲和劃痕實驗檢測細胞遷移 將8 μm的Transwell分別放于24孔板中,將處理過的各組U251細胞置于培養基中,用胰酶進行消化,按照每孔2.0×105個·ml-1的密度加入Transwell小室內,每孔加入200 μl的細胞懸液和RPMI 1640培養基,置于CO2培養箱中培養,棄去培養基,取出小室,10%的甲醇固定,采用結晶紫染色15 min,PBS洗去浮色,曬干,顯微鏡(×100)下觀察,隨機取3個視野拍照,計算細胞數量。劃痕實驗：制備U251細胞懸液并進行細胞計數，然后將數量相同的U251細胞種植到5 cm板中，經培養過夜后每個孔中均鋪滿了均勻單層細胞，然后使用大小相同的槍頭進行劃痕，每個孔的劃痕粗細均勻，劃下的細胞采用 PBS 進行清洗，應用沒有血清的培養液培養，在 37 ℃、5%CO2的培養箱中進行培養，分別于 1、12、24 h在倒置顯微鏡下拍照。

1.3.3.6 流式細胞術檢測U251細胞凋亡 胰酶消化,分別收集各組的U251細胞,當細胞的密度為1.0×105個·ml-1時接種于6孔板中,然后3 000 r·min-1離心5 min,離心半徑為11 cm,離心完成后棄上清,重懸細胞,加入Annexin V-FITC/PI雙染色染料,上流式細胞儀檢測。

1.3.3.7 預測腦膠質瘤術后復發的ROC曲線分析 通過ROC曲線，在患者出院后進行為期9個月的跟蹤隨訪，比較患者腦膠質瘤術后復發情況與檢測期間患者miR-105、MMP-2表達量之間是否存在相關性。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 miR-105和MMP-2在膠質瘤組織中的表達

RT-PCR檢測結果顯示，膠質瘤組織miR-105表達量為0.19±0.12，低于瘤旁組織的0.56±0.10，P<0.05。免疫組化法染色顯示，膠質瘤組織陽性表達率為73.03%(65/89)，高于瘤旁組織的13.48%(12/89)，P<0.05，見圖1。

A.MMP-2在腦膠質瘤組織中的表達；B.MMP-2在瘤旁組織中的表達圖1 免疫組化法染色檢測MMP-2表達A.The expression of MMP-2 in glioma tissue; B.Expression of MMP-2 in paraneoplastic tissuesFig 1 Immunohistochemical staining was used to detect the expression of MMP-2

2.2 術后復發影響因素的多因素Logistic回歸分析

Logistic回歸分析結果顯示，miR-105和MMP-2對腦膠質瘤術后復發存在顯著影響；進一步分析可發現，對腦膠質瘤術后復發的影響從大到小依次是MMP-2、miR-105。詳見表1。

表1 腦膠質瘤術后復發的Logistic回歸分析Tab 1 Logistic regression analysis of postoperative recurrence of glioma

2.3 miR-105、MMP-2預測腦膠質瘤術后復發的ROC曲線分析

miR-105、MMP-2單一及聯合檢測對腦膠質瘤復發的預測價值ROC曲線顯示，以復發組為陽性樣本，以無復發組為陰性樣本，繪制各指標預測腦膠質瘤術后復發的ROC曲線，結果顯示，miR-105、MMP-2單一及聯合檢測預測術后復發的曲線下面積(AUC)依次為0.735、0.797、0.894，提示miR-105聯合MMP-2可預測腦膠質瘤術后復發，見表2、圖2。

表2 miR-105、MMP-2預測腦膠質瘤術后復發的ROC曲線分析Tab 2 ROC curve analysis of miR-105 and MMP-2 in predicting postoperative recurrence of glioma

圖2 miR-105和MMP-2預測腦膠質瘤術后復發的ROC曲線Fig 2 ROC curve of miR-105 and MMP-2 in predicting postoperative recurrence of glioma

2.4 蛋白質印跡法檢測各組蛋白表達

對比轉染后NC組、miR-105組、MMP-2組和miR-105聯合MMP-2組各組細胞miR-105和MMP-2的表達情況，結果發現，miR-105聯合MMP-2組和miR-105組的U251細胞中MMP-2蛋白的表達顯著高于NC組(P<0.05), miR-105組和miR-105聯合MMP-2組的U251細胞中miR-105的表達明顯高于NC組。本研究顯示，miR-105聯合MMP-2組中MMP-2 、miR-105表達均較低(P<0.05)。見圖3。

圖3 蛋白質印跡法檢測MMP-2、miR-105水平Fig 3 The detection of MMP-2 and miR-105 levels by Western blot

2.5 miR-105和MMP-2水平對膠質瘤增殖的影響

與NC組相比，miR-105轉染后細胞OD值隨時間的增加而明顯降低，MMP-2組細胞OD值隨時間的增加而明顯升高，表明miR-105明顯抑制U251細胞增殖能力，而MMP-2可對細胞增殖起促進作用(均P<0.05),見圖4。

圖4 MMP-2和miR-105對腦膠質瘤細胞增殖作用的影響(*P<0.05，**P<0.01)Fig 4 Effects of MMP-2 and miR-105 on proliferation of glioma cells(*P<0.05, **P<0.01)

2.6 miR-105和MMP-2水平對膠質瘤侵襲和遷移的影響

MMP-2組細胞侵襲能力明顯高于NC組與miR-105聯合MMP-2組(P<0.05)，miR-105組侵襲能力與NC組差異較小，但較MMP-2組與miR-105聯合MMP-2組明顯降低(P<0.05)。見圖5。

圖5 MMP-2和miR-105對腦膠質瘤侵襲(A)和遷移(B)的影響(*P<0.05)Fig 5 Effects of MMP-2 and miR-105 on invasion(A) and migration(B) of glioma(*P<0.05)

2.7 MMP-2 和 miR-105的表達對腦膠質瘤細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示，各組細胞轉染后凋亡率NC組為11.26±1.56，MMP-2組為9.86±1.29，miR-105聯合MMP-2組為26.72±1.83，miR-105組為29.67±2.29。與NC組相比，miR-105組細胞凋亡率明顯升高，而MMP-2組細胞凋亡率有所降低(P<0.05)，miR-105聯合MMP-2組同NC組相比凋亡率較高，但較miR-105組較低(P<0.05)。說明miR-105能誘導腦膠質瘤細胞凋亡， MMP-2對細胞凋亡有所抑制，且miR-105可能通過作用于MMP-2對細胞凋亡進行調控。見圖6。

A.NC組；B.MMP-2組；C.miR-105聯合MMP-2組；D.miR-105組圖6 MMP-2和miR-105流式細胞檢測結果A.NC group; B.MMP-2 group; C.miR-105+MMP-2 group;D.miR-105 groupFig 6 Flow cytometry results of MMP-2 and miR-105

3 討 論

腦膠質瘤是較常見的原發性顱內腫瘤，世界衛生組織中樞神經系統腫瘤分類中將膠質瘤通常分為Ⅰ～Ⅳ級[12]，大部分患者首次治療后仍會出現腫瘤進展或復發，復發的主要原因在于腫瘤細胞不能完全手術清除，復發部位多在原部位，膠質瘤仍有極高的致殘率和病死率[12]。由于腫瘤呈浸潤性生長，腫瘤全切除率低，術后復發風險高，預后較差。

MMP-2是MMP家族中重要的一員，主要來源于內皮細胞、血管平滑肌細胞和成纖維細胞等，是一種酶活性鋅離子依賴性肽鏈內切酶家族，MMP與腫瘤發生及癌細胞生長、增殖、遷移等有關。相關研究[13-17]結果顯示，在多種腫瘤細胞中均存在 MMP-2的表達；正常腦組織細胞中MMP-2的表達可能是因為腦組織遭到損傷所引起，因陰性對照組均為腦外傷后行內減壓手術的新鮮腦組織，可能腦組織本身已經出現了水腫，損傷到了血腦屏障，導致毛細血管通透性增加，因此致使非正常生理狀態下的神經膠質細胞及血管內皮細胞分泌 MMP-2。MMP-2基因有可能作為判斷神經母細胞瘤的侵襲性和預后情況的參考指標,可作為其預測指標和干預靶點，對其診斷及治療提供重要的指導作用[18]。

目前對miRNA功能的研究主要包括對其進行過表達與抑制這兩種方式，通過脂質體將其轉染到生物體內，從而使內源性 miRNA的表達明顯增強。腫瘤的發生發展主要與miRNA調節出現異常有關，但是一個 miRNA 可對多個靶基因產生調控作用，一個靶基因又可能被多個 miRNA 所調控，使得難以完全弄清 miRNA 的功能。與正常細胞相比，腫瘤細胞的 miRNA 表達水平有著明顯的差異性，且與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲、轉移過程密切相關，因此在腫瘤的治療中，miRNA 成為了重要的靶點[19]。現有研究表明，miRNA-105與肝癌、結腸癌和卵巢癌的發生發展有著密切關系[20-21]，如在直腸癌中可通過miR-105-5p/RAB22A軸加重結直腸癌的惡性發展，而在心臟缺血性損傷中卻又可通過多重途徑程序性抑制細胞凋亡。Guan等[22]發現，與正常腦組織相比，miRNA-105在腦膠質瘤組織中異常低表達。在惡性腫瘤中，有let-7、miR-105、miR-124、miR-154等下調 miRNA，且均已經證實在腫瘤細胞的侵襲轉移、增殖凋亡過程中起到了明顯的調控作用[23-24]。

本研究通過采用免疫組化法檢測MMP-2蛋白的表達水平發現，主要在腦膠質瘤細胞的細胞膜、細胞質中存在MMP-2蛋白的表達，少許腦膠質瘤細胞周圍血管內皮細胞中也存在MMP-2的表達。MMP-2高表達者復發率高于低表達者，提示MMP-2高表達是腦膠質瘤患者術后復發的危險因素，其可能原因在于MMP-2在細胞基底膜的降解中起著積極的作用，腫瘤細胞侵襲[25]，降解細胞外基質，影響細胞與細胞和基質之間的信號傳遞，對細胞的生長分化、遷移、黏附、損傷及修復等方面產生影響。miR-105在復發腦膠質瘤患者中呈低表達，提示miR-105低表達是腦膠質瘤患者術后復發的危險因素。各組腦膠質瘤細胞內 MMP-2蛋白均高表達，miR-105 的 mRNA 表達水平與 MMP-2呈負相關(P<0.05)，MMP-2可能為 miR-105 下游靶基因。通過Transwell侵襲實驗與劃痕實驗檢測細胞侵襲遷移顯示，miR-105可抑制腫瘤侵襲遷移，并對MMP-2增強的侵襲遷移能力進行抑制。結合以上實驗結果，推測其可能原因在于miR-105靶向負調控，抑制表達逆轉了抑制miR-105對膠質瘤細胞遷移和侵襲的抑制作用，這與現有研究結果有所呼應[26-27]。后續或可通過miR-105對腫瘤細胞的侵襲遷移機制進行研究，可以提高腫瘤的臨床治療效果，延長腫瘤患者的生存期。

綜上所述，miR-105在復發腦膠質瘤患者中呈低表達，MMP-2是在復發腦膠質瘤患者中高度表達。miR-105、MMP-2均參與膠質瘤的侵襲、遷移和凋亡，二者對膠質瘤術后復發的預測有一定價值，可能成為膠質瘤的生物學標志物。