基于數據挖掘分析FAM64A在肺腺癌中的表達模式和作用機制

龐倩，蒙緒君，肖欽曉

(1.海南博鰲超級醫院 呼吸內科，海南 瓊海 571437； 2.瓊海市人民醫院 呼吸內科，海南 瓊海 571499)

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，具有復發率高、早期診斷困難和預后差等特點[1]。作為非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer) 的一員，肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD) 占所有肺癌病例的約 40%[2]。目前LUAD的主要治療方式是手術切除、化療、放療等，但這些治療手段在提高患者生存率方面存在局限性[3-4]。因此，迫切需要探索肺癌的致癌作用和治療方法。靶向治療是目前最有希望的腫瘤治療選擇之一，新型靶向生物標志物的探索是LUAD研究的重點及難點。

FAM64A (family with sequence similarity 64 member A)定位于19號染色體，具有10個外顯子區域，主要分布于胸腺、脾臟和結腸中[5]。早期研究發現FAM64A 可以控制細胞分裂過程中中期到后期的轉變，促進細胞增殖，顯示了其在癌細胞生長中的作用[6]。有研究人員發現FAM64A蛋白在淋巴瘤、白血病等血液系統腫瘤中高度表達[7]。其次，Jiang等[8]已經證明 FAM64A 可以通過激活 NF-κB 信號來促進乳腺癌的侵襲性。此外，Jiao等[9]報道高表達FAM64A可被視為胰腺癌預后較差的獨立危險因素。Jiang等[10]證實，FAM64A可通過調節細胞周期相關標志物進而促進膽管癌細胞的侵襲性發育。Wang等[11]發現膠質瘤組織中FAM64A的表達高于正常腦組織，進一步分析發現FAM64A的過表達增加了細胞周期蛋白 D1、細胞周期蛋白 E、波形蛋白、基質金屬蛋白酶 (MMP)-2 和 MMP-9 的表達，但降低了 E-鈣黏蛋白的表達。盡管相關研究顯示了FAM64A在癌癥發生發展中的潛力，但尚未見報道其在LUAD中的表達、預后和潛在的作用機制。隨著高通量測序技術的發展和生物學信息方法的應用，我們可以對現有的公開可獲取的腫瘤學數據資源進行二次挖掘，以探索FAM64A在LUAD中的表達和作用機制，希望能為后續進行實驗驗證提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 TIMER數據庫

TIMER網絡服務器是一個用戶友好的數據平臺，可用于系統地分析不同類型癌癥的免疫細胞浸潤。此外，TIMER網絡服務器允許用戶輸入特定功能的參數，并動態顯示所得到的數字，以方便獲取腫瘤的免疫學、臨床和基因組學特征[12]。本研究利用TIMER數據庫的“Diff Exp”模塊探索FAM64A在正常組織和腫瘤組織中的表達差異。

1.2 基因表達譜交互式分析(gene expression profiling interactive analysis，GEPIA)數據庫

GEPIA數據庫含來自TCGA 和 GTEx 項目的9 736個腫 瘤和8 587個正常樣本的 RNA 測序表達數據[13]。通過GEPIA數據庫的“Expression DIY”模塊分析FAM64A在LUAD中的表達以及FAM64A表達與LUAD臨床分期的相關性。

1.3 UALCAN數據庫

UALCAN 是一個綜合的、用戶友好的、交互式的網絡資源，用于分析癌癥 OMICS 數據。該數據庫旨在提供對公開可用的癌癥 OMICS 數據(TCGA、MET500 和 CPTAC)的訪問和分析[14]。本研究利用UALCAN數據庫進一步分析FAM64A表達與LUAD臨床分期的相關性。

1.4 Kaplan-Meier Plotter

使用在線數據庫Kaplan-Meier Plotter評估FAM64A在LUAD中的預后預測價值，該數據包含基因表達數據和多種人類惡性腫瘤患者的生存數據[15]。為了分析LUAD的OS、RFS，我們將患者樣本按最佳截取值分成高表達和低表達組，利用 Kaplan-Meier Plotter生成生存曲線以分析FAM64A在LUAD中的預后預測意義。

1.5 cBioPortal數據庫

cBioPortal(www.cbioportal.org)是一個全面的網絡資源，可以可視化和分析多維的癌癥基因組學數據[16]。本研究基于TCGA-LUAD數據集，從cBioPortal獲得了FAM64A的基因改變類型和和突變頻率。

1.6 相互作用網絡的構建

GeneMANIA (http:∥genemania.org) 是一個開放的、用戶友好的在線數據庫，在該數據庫中提交一個基因， GeneMANIA會使用大量基因組學和蛋白質組學數據查找功能相似的基因并生成基因互作網絡圖[17]。STRING 數據庫旨在收集、評分和整合所有公開可用的蛋白質-蛋白質相互作用信息來源，并通過計算預測來補充這些信息。其目標是實現一個全面客觀的蛋白互作網絡[18]。本研究分別利用GEMEMANIA和STRING數據庫構建FAM64A的基因互作網絡和蛋白互作網絡。韋恩圖在線工具(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)用于獲取兩個網絡中的交集基因。

1.7 LinkedOmics數據庫

LinkedOmics數據庫是一個基于網絡的平臺，可用于分析32個TCGA癌癥相關的多維數據集[19]。本研究中，FAM64A的共表達使用Pearson相關系數進行統計分析，以火山圖和熱圖的形式呈現。使用LinkedOmics的功能模塊并通過基因集富集分析(GSEA)對共表達基因所參與的KEGG通路進行探索，設置參數為FDR<0.05。

2 結 果

2.1 FAM64A在LUAD中顯著高表達

TIMER數據庫分析顯示，與正常組織相比，FAM64A在膀胱癌、乳腺癌、膽管癌、結直腸癌、食管癌、頭頸部鱗狀細胞癌、腎嫌色細胞癌、腎透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、肝細胞癌、LUAD、肺鱗癌、前列腺癌、胃癌、甲狀腺癌和子宮內膜癌中顯著高表達(圖1A)。GEPIA數據庫進一步分析顯示，與正常組織相比，FAM64A在膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、食管癌、膠質母細胞瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、低級別膠質瘤、LUAD、肺鱗癌、卵巢癌、胰腺癌、皮膚黑色素瘤、胃癌、睪丸癌、胸腺癌、子宮內膜癌和子宮肉瘤顯著高表達(圖1B)。圖1C表達柱狀圖顯示，與正常肺組織相比，FAM64A在LUAD中顯著高表達。

A.與正常組織相比，FAM64A在多數惡性腫瘤組織中顯著高表達(TIMER數據庫)；B. 與正常組織相比，FAM64A在多數惡性腫瘤組織中顯著高表達(GEPIA數據庫)；C.與正常組織相比，FAM64A在LUAD中顯著高表達(GEPIA數據庫)圖1 FAM6A4在腫瘤組織和正常組織中的表達差異A.Compared with normal tissues, FAM64A was significantly higher in most malignant tumor tissues (TIMER database); B. Compared with normal tissues, FAM64A was significantly high expression in most malignant tumor tissues(GEPIA database); C. Compared with normal tissue, FAM64A was significantly high expression in lung adenocarcinoma (GEPIA database)Fig 1 The expression difference of FAM6A4 in tumor tissues and normal tissues

2.2 FAM64A表達與LUAD臨床分期以及預后的關系

為了分析FAM64A在LUAD中的臨床意義，我們利用GEPIA和UALCAN數據庫探索FAM64A表達與LUAD臨床分期的關系，結果如圖2A、B所示，隨著FAM64A表達量的升高，LUAD分期越晚。此外，我們還分析FAM64A表達對LUAD患者的預后影響，通過Kaplan-Meier 數據庫繪制了生存曲線以評估FAM64A對LUAD患者5年總體生存率和無復發生存率的影響。研究結果顯示，FAM64A高表達組患者的總體生存率明顯低于低表達組患者(圖2C)。此外，FAM64A高表達組患者同樣表現出了較差的無復發生存率(圖2D)。以上研究結果提示，FAM64A高表達與LUAD患著的不良臨床結局有關。

A、B.FAM64A表達越高，LUAD患者的臨床分期越晚；C、D.與FAM64A低表達組LUAD患者相比，高表達組患者的總體生存率和無復發生存率明顯較低圖2 FAM6A4高表達在LUAD中的臨床意義A、B. The higher the FAM64A expression, the later the clinical stage of lung adenocarcinoma patients; C、D. The overall survival and recurrence-free survival rates of patients in the high expression group were significantly worse compared to those in the low FAM64A expression group of lung adenocarcinoma patientsFig 2 The clinical significance of FAM6A4 lung adenocarcinoma

2.3 FAM64A在LUAD中的遺傳突變分析

為了研究FAM64A在LUAD中異常表達的原因，我們從遺傳突變和基因甲基化方面進行探索。首先cBioPortal數據庫顯示，FAM64A在LUAD中發生了7.39%的突變(圖3A)，其中包括mRNA High(5.65%)和Deep Deletion(1.74%)兩種突變類型(圖3B)。接著我們評估了突變組和非突變組之間的總體生存率，結果顯示兩者差異無統計學意義(圖3C)。

A.FAM64A在LUAD中的遺傳突變頻率為7.39%；B.FAM64A在LUAD中的兩種突變類型分別為mRNA High(5.65%)和Deep Deletion(1.74%)；C.生存分析顯示，突變組和非突變組之間總體生存率未見差異圖3 FAM6A4在LUAD中的遺傳突變A. The genetic mutation frequency of FAM64A in lung adenocarcinoma is 7.39%; B. The two mutation types of FAM64A in lung adenocarcinoma are mRNA High (5.65%) and Deep Deletion (1.74%); C. Survival analysis showed that there was no difference in overall survival between the mutant group and the non-mutant groupFig 3 Genetic mutations of FAM6A4 in lung adenocarcinoma

2.4 FAM64A基因互作網絡和蛋白互作網絡的構建

利用GEMEMANIA和STRING數據庫構建了FAM64A的基因和蛋白互作網絡，我們發現在基因水平FAM64A主要與PICALM、TDRD7、RBBP7、RBBP4、MTA2、HDAC2、SAPCD2、KIF15、CDT1、HDAC1、PRNP、PHF19、TYMS、ZYG11B、CCNE1、BUB1、UBASH3B、SPC24、BLM和TACC3存在相互聯系(圖4A)。而在蛋白質互作網絡中，FAM64A主要與ASPM、AURKB、BIRC5、BUB1、CCNA2、CCNB2、CDC20、CDCA8、CENPA、CENPF、CEP55、DLGAP5、HJURP、KIF20A、KIF2C、NCAPG、SPAG5、TPX2、TROAP和UBE2C存在相互聯系(圖4B)。取以上相互作用網絡靶點的交集發現，在基因互作網絡和蛋白互作網絡中FAM64A均與BUB1存在相互作用(圖4C)。

A.FAM64A基因互作網絡的構建；B.FAM64A蛋白互作網絡的構建；C.韋恩圖顯示FAM64A可能與BUB1存在相互作用關系圖4 FAM64A相互作用網絡的構建A.Construction of FAM64A gene interaction network；B.Construction of the FAM64A protein interaction network；C. Venn diagram showed that FAM64A might interact with BUBFig 4 Construction of FAM64A interaction network

2.5 FAM64A的共表達分析和功能富集分析

本研究利用LinkedOmics數據庫的LinkFinder模塊用于獲取FAM64A的相關性基因，結果顯示有7 139個基因與FAM64A存在負相關關系，有6 233個基因與FAM64A存在正相關關系(圖5A)。圖5B、C分別顯示與FAM64A存在正、負相關關系的前50個基因。其次，我們利用LinkedOmics數據庫的Linkinterpreter模塊分析FAM64A及其相關基因可能參與的信號通路，結果如圖5D所示，FAM64A及其相關基因主要參與細胞周期、DNA復制、RNA轉運、同源重組、P53信號通路、氧化磷酸化等信號通路。

A.共表達基因火山圖；B、C.與FAM64A存在正、負相關的前50個基因；D.FAM64A及其共表達基因的京都基因與基因組百科全書圖5 FAM64A在LUAD中的共表達分析和功能富集分析A.Volcano map of co-expressed genes; B-C. The top 50 genes that are positively and negatively related to FAM64A; D. Kyoto Gene and Genome Encyclopedia for FAM64A and its co-expressed genesFig 5 Co-expression analysis and functional enrichment analysis of FAM64A in lung adenocarcinoma

3 討 論

肺癌是人類的主要死因，其中，LUAD是肺癌最常見的亞型。盡管包括免疫療法、放射療法和無創手術切除在內的多模式治療策略在近幾十年來取得了很大進展，但LUAD患者的臨床結局仍然不盡如人意，5年相對總體生存率僅為18%[1,4]。基于近年來新興的“精準醫學”概念，分子病理學檢測方法和靶向治療的改進顯著提高了LUAD患者的總生存期[20-21]。然而，由于跨越一系列不同生物學和臨床行為的不利因素的組合以及對抗肺癌藥物的耐藥性的增加，現有的靶向藥物顯示出不令人滿意的療效[22-23]。因此，有必要為LUAD患者的分子病理學診斷和預后預測尋找更有效的指標。本研究基于數據挖掘探討FAM64A作為LUAD靶向生物標志物的可能性，希望能為后續進行進一步實驗研究提供理論依據。

本研究中我們分析了 FAM64A在人類惡性腫瘤的表達模式，結果發現FAM6A4在包括LUAD在內的多種人類惡性腫瘤中顯著高表達；其次我們發現FAM64A高表達與LUAD患者的不良臨床結局有關，FAM64A表達水平越高，患者分期越晚、預后越差。這些研究結果提示FAM64A在LUAD中可能充當癌基因的角色。接著本研究試圖從遺傳學角度分析FAM64A突變在LUAD中的作用，結果發現FAM64A僅僅在少數LUAD患者中發生遺傳突變，且突變組和非突變組之間并未發現生存差異。提示遺傳突變可能不是FAM64A在LUAD中高表達的原因。然后我們在基因水平和蛋白水平分別構建了FAM64A的相互作用關系網絡，發現FAM64A可能與BUB1存在功能聯系。多域蛋白激酶 BUB1是紡錘體組裝有絲分裂檢查點的核心組成部分,在控制細胞染色體分離中發揮著關鍵的作用[24]。Zhu等[25]報道BUB1可通過激活SMAD2磷酸化進而促進肝癌細胞增殖。Piao等[26]發現BUB1高表達預示胰腺導管腺癌預后不良。這些發現表明，FAM64A可能與BUB1相互作用進而促進LUAD的發生發展。最后，我們獲取了FAM64A的共表達基因并對其進行功能分析，以探索FAM64A在LUAD中的潛在作用機制。結果顯示FAM64A及其相關基因參與細胞周期、DNA復制、RNA轉運、同源重組、P53信號通路、氧化磷酸化等信號通路。這些信號通路在癌癥進展中的作用早已得到廣泛證實。例如，DNA 復制確保細胞遺傳信息被準確復制并正確傳遞給后代細胞。然而，DNA復制在體內各種壓力下容易受到干擾和破壞，導致DNA復制停滯，影響基因組穩定性，甚至誘發細胞凋亡、壞死和癌變[27-28]。p53是一種與DNA特異性結合的轉錄因子。它可以調節特定基因的表達，誘導細胞周期暫停、DNA修復和細胞凋亡[29-30]。因此，上述結果表明FAM64A通過上述信號通路促進LUAD發生發展并導致LUAD患者的生存率降低，即FAM64A具有作為LUAD新型治療靶點和預后標志物的潛能。

然而，我們的研究仍然存在一些局限性。首先，本研究是一項回顧性研究，樣本量較少，分析偏倚無法避免。其次，本研究缺乏FAM64A在LUAD中的蛋白組學證據，未能在蛋白質水平證實FAM64A在LUAD中的表達。此外，本研究所得結果均來自公開數據庫，應通過基礎研究和臨床試驗進一步證實 FAM64A在LUAD中的表達、臨床意義以及潛在的調控機制。