DHX33作為可切除結腸癌患者術后輔助化療預后標志物的臨床研究

劉楠楠，宋珊珊，李凡

(遼寧省健康產業集團阜新礦總醫院 消化內科，遼寧 阜新 123000)

輔助化療(ACT)是目前結腸癌術后標準的治療方案[1-2]。然而眾多臨床實踐發現，即使處于同一病理階段，患者的個體復發風險也存在很大差異[3-4]。因此，考慮到ACT對結腸癌(CC)的適度益處和相關毒性，尋找一種有效的生物標志物來前瞻性地區分能夠從ACT中獲益的患者，具有重要的臨床意義。在ACT過程中，CC中許多重要的信號通路被解除調控，例如Wnt、Ras、p53信號通路。DEAH盒解旋酶(DHX)33是ATP依賴性RNA解旋酶的DEAH-box家族成員之一，對RNA代謝至關重要[5]。例如胞質DHX33參與mRNA翻譯起始，而細胞核DHX33在細胞周期進展、遷移和核糖體RNA合成過程中調節特定的基因轉錄。重要的是，DHX33還被發現在感應dsRNA以啟動先天性免疫反應中發揮關鍵作用[6]。然而DHX33在人類癌癥中的作用仍然難以確定。本研究旨在分析組織DHX33表達與可切除CC患者術后ACT預后的關系，從而為探索DHX33對癌癥進展的影響提供一些線索。

1 資料和方法

1.1 一般資料

本研究納入了215例CC手術切除患者的甲醛固定-石蠟包埋(FFPE)組織。所有患者均于2014年1月至2018年9月期間在我院接受CC根治性切除。該研究由當地醫院機構審查委員會審查和批準。在采集樣本之前，獲得每位患者的知情同意。納入標準：(1)根 據國際抗癌聯盟/美國癌癥聯合委員會第八版癌癥分期系統(至少由兩名我院病理學專家審查)，經組織病理學或細胞學證實為原發性CC[7-8]；(2) 接受腫瘤根治性切除，然后接受標準化療方案；(3) 之前沒有接受過化療或放療者。在免疫組識化學染色前，通過蘇木精和伊紅染色對所有標本進行鑒定，以確保腫瘤細胞富集。排除標準：(1) 術前接受新ACT和(或)輔助放療者；(2)因肉眼可見的殘留病灶或接受非根治性切除手術而接受R2切除術的患者以及未接受ACT的患者；(3)術后短期內(≤3個月)死亡者。

1.2 治療及隨訪

進行標準的CC根治性切除后，由內科腫瘤學專家考慮患者術后恢復時間，個體化啟動ACT。包括FOLFOX(奧沙利鉑130 mg·m-2，d1，靜脈滴注；亞葉酸鈣200 mg·m-2，d1～d2，靜脈滴注；5-氟尿嘧啶，d1～d2，靜脈推注；5-氟尿嘧啶600 mg·m-2，靜脈持續滴注，d1～d2。每2周為1個療程)、FOLFIRI(伊立替康180 mg·m-2，d1，靜脈滴注；亞葉酸鈣400 mg·m-2，d1，靜脈滴注；5-氟尿嘧啶400 mg·m-2，d1,靜脈推注；之后給予5-氟尿嘧啶靜脈泵入，2 400 mg·m-2，持續46 h。每2周為1個療程)、XELOX(奧沙利鉑130 mg·m-2，d1，靜脈注射；希羅達1 000 mg·m-2，d1～d14，口服，每日2次。每3周為1個療程)、sLV5FU2(亞葉酸鈣400 mg·m-2，d1，靜脈滴注；5-氟尿嘧啶400 mg·m-2，d1，1 200 mg·m-2，d2～d3，靜脈輸注，總量2 400 mg·m-2，輸注46～48 h。每2周為1個療程)或希羅達(希羅達1 000 mg·m-2，d1～d14，口服，每日2次，休息7 d。每3周為1個療程)治療。選定的患者在腫瘤位置、腫瘤浸潤深度、直腸周圍淋巴結轉移、環切緣、合并癥和術后表現評分方面評估后接受術后放療。所有手術患者在前5年內每隔3個月或6個月進行1次隨訪，此后每年進行1次。從手術到第1次確診復發的時間，或最后1次接觸時沒有復發的存活時間被定義為無病生存時間，從手術到最后1次隨訪或死亡的時間被定義為總生存時間。

1.3 組織DHX33表達檢測

樣本在離體20 min內采集，確保樣本新鮮。在癌灶處取CC組織，在離癌灶遠側或近側15 cm處取正常結腸組織作為對照。用甲醛固定，制備石蠟切片。取FFPE組織切片后，在二甲苯和分級乙醇溶液中脫蠟，水化，并在PBS中洗滌。在微波爐中預處理后，內源性過氧化物酶在3%過氧化氫/甲醇溶液中抑制20 min，然后使用生物素阻斷試劑盒阻斷親和素。之后將載玻片與DHX33抗體(1∶400，貨號sc-137424，美國Santa Cruz Biotechnology公司)在4 ℃潮濕室內孵育過夜，PBS洗滌，并與生物素化的山羊抗兔/小鼠抗體孵育。玻片用DAB顯影，蘇木精復染。半定量免疫組織化學(IHC)檢測用于確定DHX33蛋白質水平。使用H評分法，將百分比評分乘以染色強度評分。陽性染色細胞的百分比評分為0(0)、1(1%～25%)、2(26%～50%)、3(51%～75%)、4(76%～100%)。強度評分為0(陰性染色)、1(弱染色)、2(中度染色)、3(強染色)。對于每種情況，隨機選擇1 000個細胞并進行評分。評分由兩名病理學專家獨立決定。H評分≥4分被判斷為高表達。

1.4 其他檢測指標

采用免疫組織化學染色檢測FFPE組織錯配修復蛋白[人類Mutl同源物1(hMLH1)、人類減數分裂后分離增強蛋白2(hPMS2)、人類MutS同源物(hMSH)2、hMSH6]，任意1個以上蛋白表達缺失則視為微衛星不穩定(MSI)狀態；抗體購自北京中杉生物技術有限公司。提取FFPE組織DNA，采用ARMS-PCR法檢測BRAF V600E基因突變、KRAS基因外顯子2第12、13位密碼子突變，QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 試劑盒和基因突變檢測試劑盒購自德國QIAGEN公司。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 DHX33在腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達水平

IHC顯示DHX33主要定位于細胞核和細胞質，在CC細胞中多呈陽性染色(圖1)。與癌旁正常組織(17.67%，38/215)相比，53.95%(116/215)的腫瘤組織樣本中DHX33呈高表達(χ2=61.545，P<0.001)。

圖1 腫瘤組織和癌旁正常組織中DHX33蛋白表達(×400)Fig 1 DHX33 protein expression in tumor tissues and normal tissues adjacent to cancer (×400)

2.2 CC組織中DHX33表達水平與臨床病理特征的關系

對比不同臨床病理特征的DHX33不同表達狀態，與DHX33低表達亞組相比，DHX33高表達亞組CC組織MSI比例、cTNM Ⅲ～ⅣA期比例及癌旁正常組織DHX33蛋白高表達比例更高(P<0.05)。見表1。

表1 CC組織中DHX33表達水平與臨床病理特征的關系Tab 1 The relationship between the expression level of DHX33 in CC tissues and clinical pathological characteristics

(續表)

2.3 COX回歸模型分析CC患者遠期復發/生存預后

隨訪期內復發65例(30.23%)，死亡44例(20.47%)。Kaplan-Meier分析(LOG-RANK檢驗)顯示DHX33低表達者無病生存時間(χ2=12.566，P<0.001)和總生存時間(χ2=13.986，P<0.001)更長(圖2)。此外，單因素及多因素COX回歸分析結果顯示，年齡、術前血清CEA水平、cTNM分期、病理分級、CC組織DHX33蛋白表達是影響手術+ACT治療后復發和遠期死亡的獨立危險因素(P<0.05，表2、3)。

圖2 腫瘤組織DHX33表達狀態與CC患者生存時間的Kaplan-Meier生存曲線Fig 2 Kaplan-Meier survival curve between DHX33 expression status in tumor tissue and survival time of CC patients

表2 單因素分析影響CC患者預后不良的臨床因素Tab 2 Univariate analysis of clinical factors affecting poor prognosis of CC patients

表3 多因素分析影響CC患者預后不良的臨床因素Tab 3 Multivariate analysis of clinical factors affecting poor prognosis of CC patients

3 討 論

CC的發病是一個多基因相關、多步驟的復雜過程[9-11]。根治性切除手術后的ACT是Ⅱ期和Ⅲ期CC患者的標準治療方法，可大大降低局部復發率并提高患者的生存預后。然而一部分患者無法在ACT中獲益[12]。既往有很多與CC術后ACT預后相關的預測生物標志物研究[13-15]，然而靈敏度和特異度有限。在本研究中，我們調查了可切除CC中DHX33蛋白的表達，并發現DHX33高表達的腫瘤患者術后復發風險更高。據我們所知，這是第1項證明DHX33可以作為術后復發的預測性生物標志物的研究。

DEAD/H盒蛋白屬于RNA解旋酶中最大的一類，具有多種保守基序，包括Asp-Glu-Ala-Asp/His(DEAD/H)。已發現這些蛋白質在涉及RNA/DNA結構改變的許多細胞過程中發揮重要作用，例如翻譯起始、核/線粒體mRNA剪接、核糖體/剪接體組裝、miRNA生物發生和RNA衰變。DHX33是DEAD/DEAH盒蛋白家族的成員，在肺癌、肝癌和淋巴瘤中高度表達[16-17]。Wang等[18]發現，DHX33基因下調可導致膠質母細胞瘤細胞在體外和體內的增殖和遷移顯著降低。在機制上，DHX33可調控一組參與細胞周期和細胞遷移的關鍵基因，以促進膠質母細胞瘤的發展，這也強調了其在治療膠質母細胞瘤中的潛力[18]。此外DHX33缺乏可導致Bcl-2下調和BAD上調，以支持CC細胞凋亡[19]。基于上述數據分析，我們推斷DHX33在CC中的過度表達對于維持CC的惡性表型至關重要，并且可能參與CC的發生和發展。這一點也解釋了本研究中組織DHX33過表達與腫瘤進展和術后復發有關。

最近Wang等[20]發現，DHX33基因消融消除了大多數由Ras驅動的肺腺癌發展。但在少數情況下，仍然能觀察到DHX33基因敲除小鼠出現惡性病變，盡管效率和速度都要低得多，這可能是由于替代上游信號的激活。Wnt途徑中的β-連環蛋白可隨著DHX33基因敲除而顯著下調，這意味著DHX33在調節Wnt信號中起著關鍵作用[5]。RNA解旋酶DHX33已被證明是細胞增殖和生長的關鍵調節因子。然而，其功能背后的潛在機制仍不完全清楚，目前的一些證據表明DHX33轉錄控制參與細胞周期的基因表達，尤其是細胞周期蛋白、E2F1、細胞分裂周期和微染色體維持基因。DHX33與這些基因的啟動子發生物理關聯，并控制活性RNA聚合酶Ⅱ在這些啟動子上的裝載。DHX33缺乏會破壞細胞周期進程和DNA復制，并導致細胞凋亡。例如Yuan等[21]發表的一項來自肺組織的RNA測序分析表明，DHX33缺乏可導致基因表達的整體變化。由于這些RNA是從具有異質細胞起源的肺組織中提取的，我們不能排除許多基因在癌癥發展過程中受到DHX33間接調控或僅受Ras調控的可能性。盡管如此，DHX33顯然在Ras驅動的腫瘤發生過程中起著關鍵和多方面的作用。這也解釋了為何CC腫瘤被根治性切除后，組織DHX33高表達仍然能夠預測術后復發風險。

綜上，本研究表明，原發性腫瘤組織中DHX33高表達可能是CC患者根治性手術+ACT治療后復發和死亡的強有力的預測因子。因此DHX33可作為一種臨床生物標志物，用于識別可從ACT積極管理策略中獲益的患者。