血清細胞因子預測晚期NSCLC患者PD-1阻斷劑治療反應的臨床研究

朱健榮，靳建峰，陳美鳳

(臨汾市中心醫院 呼吸與危重癥醫學科，山西 臨汾 041000)

非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常見的組織學類型，通常預后不良[1]。近年來，免疫檢查點抑制劑(ICI)應用越來越廣泛，例如程序性死亡受體1(PD-1)或其配體(PD-L1)阻斷劑，極大地改變了晚期NSCLC的治療結局[2-3]。抗PD-1/PD-L1單克隆抗體可有效阻斷免疫抑制信號，從而恢復對腫瘤的免疫反應[4]。但由于延遲動力學和非典型反應模式，PD-1阻斷劑的治療有效性難以區分和預測[5]。因此，迫切需要識別生物標志物，以篩選可能受益于PD-1阻斷劑的患者。細胞因子是先天性和適應性免疫系統的主要調節因子，它允許免疫細胞以旁分泌和自分泌的方式進行短距離通信[6]。鑒于免疫系統識別和摧毀癌細胞的能力，一些細胞因子已被探索用于癌癥的治療[7-8]。然而到目前為止，能夠可靠預測抗PD-1/PD-L1治療結果的細胞因子標志物仍有待發現。本研究通過重點調查11種循環細胞因子是否可以在接受PD-1阻斷劑治療的NSCLC患者中發揮改善預后或預測作用，以期為改進臨床免疫治療策略提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

這是一項由當地醫院倫理委員會批準的前瞻性研究，并根據良好臨床實踐(GCP)指南進行。所有患者在納入研究前均提供書面知情同意書。2015年1月至2019年10月共招募91例晚期NSCLC患者(NSCLC組)，其中男68例，女23例，年齡34～81歲，中位年齡56.0歲。納入標準：年齡≥18歲；組織學證實診斷為晚期或轉移性NSCLC，免疫組織化學檢測PD-L1表達≥1%，所有患者接受PD-1阻斷劑免疫單藥治療；東部腫瘤協作組(ECOG)表現狀態0～2分，器官功能充足，精神狀態正常；表皮生長因子受體(EGFR)突變或間變性淋巴瘤激酶(ALK)易位均為陰性；預計生存期至少為12周。排除既往有間質性肺病、全身免疫抑制治療或活動性自身免疫性疾病病史的患者。另外選擇同期在本院體檢的90例健康志愿者的血清樣本作為對照組，其中男60例，女30例，中位年齡54.0歲，性別構成、年齡與NSCLC組相匹配(P>0.05)。

1.2 治療

入選患者接受tislelizumab(百濟神州生物制藥有限公司，批準文號S20190045)作為單藥治療(未接受化療的患者為200 mg，每3周1次；以前接受化療的患者為2 mg·kg-1)，或每2周靜脈注射nivolumab(百時美施貴寶公司，批準文號S20180015)，劑量為3 mg·kg-1。藥物選擇基于PD-L1狀態和患者先前的治療史(一線或二線治療)。

1.3 療效判斷

通過計算機斷層掃描或磁共振成像測量疾病的嚴重程度，并使用實體瘤療效評價標準1.1(RECIST 1.1)[9]評估治療反應。每8周評估1次PD-1阻斷劑治療的臨床反應，并在其后不少于4周通過后續評估予以確認。根據RECIST 1.1標準，靶病變的完全消失被評估為完全緩解(CR)，總靶病變減少30%以上被評估為部分緩解(PR)，總靶病變增加20%以上被評估為進展性疾病(PD)，靶病變總數減少30%或增加20%以下被評定為穩定疾病(SD)。無進展生存期(PFS)是從PD-1阻斷劑治療開始到影像學評估的首次疾病進展的時間。由兩名研究人員獨立審查電子醫療圖表，以分配臨床反應組。有反應者以無病、病情穩定或腫瘤體積減少超過6個月來定義，無反應者以腫瘤生長或≤6個月的臨床獲益來定義。

1.4 血清細胞因子檢測

于開始PD-1阻斷劑治療前使用標準方案收集和處理血清樣本，等分并儲存在-80 ℃，直到化驗。使用AimPlex流式高通量多因子試劑盒(美國AimPlex Biosciences)和BD-FACS Calibur系統(美國BD Biosciences)測定血清白細胞介素(IL)-5、IL-8、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-2、IL-4、γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉化生長因子-β(TGF-β)水平。先將45 μl血清樣品和45 μl試劑磁珠混合，室溫下培養1 h。孵育后，添加0.5 ml洗滌緩沖液，離心5 min。用生物素結合單克隆抗體孵育樣品30 min，然后用鏈霉親和素結合單克隆抗體孵育樣品20 min。最后，在所有樣品中加入洗滌讀取緩沖液上機檢測。

1.5 統計學處理

使用SPSS 26.0軟件處理數據，非正態分布連續變量表示為M50(四分位距：IQR)，進行Mann-WhitneyU檢驗。采用Logistic回歸模型分析血清細胞因子與PD-1阻斷劑治療反應的關系。采用受試者工作特征(ROC)曲線評估血清細胞因子對PD-1阻斷劑治療反應的預測價值。采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank法分析血清細胞因子與預后的相關性。采用Cox回歸比例風險模型分析影響NSCLC患者預后的危險因素。所有檢驗均為雙側檢驗，統計學顯著性假設為α=0.05。

2 結 果

2.1 2組血清細胞因子水平比較

NSCLC組患者血清IL-4、IL-5、IL-8、IFN-γ、TNF-α水平顯著高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 2組血清細胞因子水平比較[M50(IQR)] pg·ml-1Tab 1 Comparison of serum cytokine levels between the two groups[M50(IQR] pg·ml-1

2.2 血清細胞因子與PD-1阻斷劑治療反應的關系

根據腫瘤反應，55例被評估為PR或SD的患者被歸為有反應者。有反應者患者血清IL-5、IFN-γ水平顯著高于無反應者(P<0.05，表2)。進一步校正PD-1阻斷劑類型后，經多因素Logistic回歸分析，血清IL-5(OR=1.891，95%CI1.142～5.159，P=0.001)、IFN-γ(OR=2.018，95%CI1.336～5.007，P<0.001)仍是影響治療反應的相關因子。血清IL-5、IFN-γ預測PD-1阻斷劑治療反應的ROC曲線下面積分別為0.708(95%CI0.594～0.823)、0.825(95%CI0.735～0.914)，對應截斷值分別為2.930、5.365 pg·ml-1，特異度分別為74.5%、78.2%，敏感度分別為63.9%、77.8%，見圖1。

表2 NSCLC患者不同治療反應血清細胞因子水平比較[M50(IQR)] pg·ml-1Tab 2 Comparison of serum cytokine levels in NSCLC patients with different treatment responses[M50(IQR)] pg·ml-1

2.3 單因素和多因素Logistic回歸分析血清細胞因子水平與PD-1阻斷劑治療反應的關系

經單因素和多因素Logistic回歸分析顯示，血清IL-5、IFN-γ是PD-1阻斷劑治療反應的獨立預測因子(P<0.05，表3)。用于預測PD-1阻斷反應的血清細胞因子的Logistic回歸模型構建如下：logit(P=有反應者)=0.114×(IL-5)+0.079×(IFN-γ)-19.548，(IL-5)和(IFN-γ)分別是治療早期IL-5和IFN-γ的血清濃度。通過使用該模型，AUC確定為0.832(95%CI0.748～0.916)，敏感度為86.1%，特異度為88%，這表明血清細胞因子在區分有反應者和無反應者方面表現良好(圖1)。

表3 單因素和多因素Logistic回歸分析血清細胞因子表達水平與PD-1阻斷劑治療反應的關系Tab 3 The relationship between the expression of serum cytokines and the response to PD-1 blocker treatment by univariate and multivariate Logistic regression analysis

圖1 血清IL-5、IFN-γ及二者聯合預測PD-1阻斷劑治療反應的ROC曲線Fig 1 ROC curve of serum IL-5, IFN-?and their combined prediction of PD-1 blocker response

2.4 Cox回歸分析影響NSCLC患者預后的危險因素

經單因素和多因素Cox比例風險回歸模型分析顯示，血清IL-5、IFN-γ與PFS、OS之間的相關性具有高度的統計學顯著性和獨立性(P<0.05，表4、5)。

表4 單因素Cox回歸分析影響NSCLC患者預后的危險因素Tab 4 Risk factors influencing prognosis of NSCLC patients by univariate Cox regression analysis

表5 多因素Cox回歸分析影響NSCLC患者預后的危險因素Tab 5 Risk factors influencing prognosis of NSCLC patients by multivariate Cox regression analysis

2.5 血清細胞因子水平與NSCLC患者預后的關系

根據中位值(IL-5為2.70 pg·ml-1，IFN-γ為4.72 pg·ml-1)將患者分成高水平組和低水平組。隨訪期間，高IL-5水平組和低IL-5水平組中位OS時間分別為12.7、15.7個月，差異有統計學意義(χ2=13.876，P<0.001)；中位PFS時間分別為4.5、6.4個月，差異有統計學意義(χ2=19.671，P<0.001)。高IFN-γ水平組和低IFN-γ水平組中位OS時間分別為12.8、15.7個月，差異有統計學意義(χ2=17.614，P<0.001)；中位OS時間分別為4.5、6.5個月，差異有統計學意義(χ2=18.100，P<0.001)。見圖2。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線Fig 2 Kaplan-Meier survival curve

3 討 論

使用靶向PD-1/PD-L1抗體的ICI治療已證明對晚期NSCLC具有深遠的臨床療效[10-11]，識別生物標志物以預測檢查點阻斷的反應至關重要。外周血采集是一種創傷小、安全、方便、可重復的樣本采集方法，此外，外周血可以提供宿主免疫狀態的系統視圖。近年來，血液循環中的一些生物標志物在預測患者對免疫治療反應方面顯示出了價值。在本研究中，我們證明血清IL-5和IFN-γ水平與晚期NSCLC患者抗PD-1治療的療效相關；進一步的分析也闡明了這兩種分子對于OS和PFS的預測價值。

細胞因子作為免疫活性的重要調節劑，將免疫細胞募集到腫瘤免疫微環境中，并在抗腫瘤活性過程中促進某些免疫檢查點分子的表達[12]。因此，這些細胞因子可能是對PD-1阻斷劑治療反應的潛在預測生物標志物。IFN-γ是一種在先天性和適應性免疫中發揮作用的細胞因子，主要由用于天然免疫的T細胞和 NK細胞產生，但也由用于適應性免疫的CD4+和CD8+T細胞產生[13]。在腫瘤中，腫瘤浸潤淋巴細胞是IFN-γ的主要來源[14]。IFN-γ在對感染和癌癥的免疫反應中起重要作用，它可以通過改善主要組織相容性復合體(MHC)介導的抗原呈遞、增強輔助性T細胞1(Th1)反應、調節白細胞運輸、促進Toll樣受體信號傳導以及增強抗腫瘤和抗菌功能來發揮免疫調節作用[5]。有研究[15]表明，基線IFN-γ基因表達特征與ICI治療的晚期NSCLC癌癥患者的臨床結局相關。本研究中我們發現治療有反應組血清IFN-γ和IL-5水平顯著高于治療無反應組，且校正混雜因素后血清IL-5和IFN-γ是PD-1阻斷劑治療反應的獨立預測因子。這可以通過以下機制來解釋：一方面IFN-γ信號通過直接上調腫瘤、免疫浸潤和基質細胞中的配體PD-L1和PD-L2，使PD-1信號軸活化，這些配體與腫瘤浸潤T細胞上的PD-1相互作用，從而下調細胞毒效應；另一方面，IFN-γ可以上調腫瘤微環境中其他關鍵免疫抑制分子(如IDO1)的表達，腫瘤細胞利用這種正負免疫信號因子的微妙平衡得以繼續生存和發展。

IL-5主要由輔助性T細胞-2亞型(Th2)淋巴細胞和Ⅱ型固有淋巴細胞(ILC2)產生[16]，通過促進B細胞的分化和生長增加抗體分泌，增強Th2細胞介導的體液免疫應答[17]。ILC2是原始肺組織中的常駐群體，通過快速釋放效應細胞因子(如IL-5)和影響Th2細胞的共刺激配體，介導先天性和適應性2型炎癥，進而促進腫瘤轉移[5]。ILC2還可以通過以IL-5依賴的方式招募和激活嗜酸粒細胞來介導其免疫抑制作用[18]。本研究中，我們發現血清IL-5水平升高與PD-1阻斷劑治療反應不良密切相關，IL-5是ILC2釋放的主要細胞因子，一方面ILC2衍生的IL-5對于嗜酸粒細胞介導的NK細胞功能抑制非常重要，在一定程度上能夠抑制PD-1阻斷劑的抗腫瘤免疫；此外ILC2通過抑制PD-1信號傳遞使腫瘤細胞能夠控制適應性免疫反應，從而促進腫瘤生長和轉移。事實上，以IL-5及其受體為靶點的免疫治療策略已經引起普遍關注[19]。

綜上所述，早期治療血清中細胞因子標志物的鑒定可作為選擇NSCLC患者的預測工具，例如低血清IL-5和IFN-γ水平的患者將從抗PD-1治療中獲益。因此，IL-5和IFN-γ可能成為預測晚期NSCLC患者PD-1阻斷劑治療反應和預后的可靠生物標志物。但本研究具有一定局限性，收集樣本量較小且血清細胞因子在NSCLC中的潛在機制尚不明確，有必要進行更多更大的臨床研究來進一步證實其在NSCLC中的臨床應用價值。