ROS激活P53調控線粒體凋亡途徑在α-鵝膏毒肽中毒肝損害中作用的研究進展

賴福平，胡杰，陸元蘭，楊登會，詹江珊，吳瑾，王庭剛，謝智慧

(遵義醫科大學附屬醫院1.急診科，2.重癥醫學科，3.高壓氧科，貴州 遵義 563003)

鵝膏毒肽類毒素是由7～8個氨基酸組成的環肽化合物，根據結構差異可分為鵝膏毒肽(amatoxin)、鬼筆毒肽(phallotixin)和毒傘肽(virotixin)3類，其中最主要的致死毒素是鵝膏毒肽[1]。鵝膏毒肽屬于聯吡啶N-二氧化物，其大環多肽結構類似致死性極大的敵草快，根據側鏈取代基團不同可分為多種類型，目前國內外研究類型主要集中在α-鵝膏毒肽(α-amanitin，α-AMA)、β-鵝膏毒肽(β-amanitin，β-AMA)、γ-鵝膏毒肽(γ-amanitin，γ-AMA)，但目前對鵝膏毒肽中毒機制研究不足，由于鵝膏毒肽在多個屬蘑菇均有出現，且不僅只有1種毒素存在，因此這些毒素相互交集作用給臨床診斷及診療帶來困難[2]。α-AMA作為鵝膏毒肽中含量多、毒性強、致死劑量低(半數致死量0.05～0.1 mg·kg-1)且最為常見類型，其由8個氨基酸殘基構成雙環八肽，分子量約900 g·mol-1[3-4]。根據α-AMA的毒代動力學表現，肝臟是最主要的受累靶器官，主要引起肝代謝異常、肝細胞損害、肝臟合成功能受損、凝血功能障礙等，而持續性肝損害可進展至多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)、腸系膜血栓形成等，甚至威脅生命[5-6]。線粒體作為動態的雙膜結構，通過產生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)為細胞活動提供所需能量，而當接受線粒體凋亡途徑上游信號時線粒體內凋亡因子釋放至胞質中引起細胞凋亡。當機體發生α-AMA中毒可使肝細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)產量增多打破細胞內環境氧化還原平衡，并作為凋亡上游信號分子促進P53過度表達和磷酸化，以非轉錄依賴方式向線粒體易位介導線粒體凋亡途徑發生[7]?？梢奟OS激活P53調控線粒體凋亡途徑在致肝細胞凋亡中發揮重要作用。作者就ROS激活P53調控線粒體凋亡途徑與α-AMA中毒肝損害的關系作一綜述，期望對α-AMA中毒肝損害有一新的認識，為α-AMA中毒肝損害診治甚至預后評估提供理論依據。

1 α-AMA抑制RNAPⅡ活性與調控線粒體凋亡途徑致肝損害的研究進展

α-AMA由肝細胞轉運多肽1B3轉運蛋白(organic anion transporting polypeptide 1B3, OATP1B3)以Km值(3.7±0.6)mm和鈉離子-?；悄懼徕c共轉運蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP)轉運至胞內，與RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ, RNAPⅡ)的橋螺旋(bridge helix)和觸發環(trigger loop)之間以非共價結合形成較強極性作用的氫鍵，降低RNAP Ⅱ活性使mRNA轉錄水平降低導致蛋白質合成受阻，最終導致細胞死亡[8-10]。然而在研究中發現，一種化學性質類似于α-AMA的抗生素可釋放RNAPⅡ，在預防α-AMA中毒動物模型的肝損害和增加存活率方面并未有明顯上升趨勢[11]。近幾年研究發現，在α-AMA環境下的小鼠肝細胞內出現不同程度的形態變化，和功能失調的線粒體膜通透性轉化孔呈不可逆開放狀態，破壞線粒體內膜完整性引起離子平衡紊亂和線粒體內細胞色素C(Cytochrome C, CytC)等凋亡因子釋放至胞質中，抑凋亡蛋白Bcl-2和促進促凋亡蛋白Bax表達使Bax/Bcl-2比值上升，進而誘導含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族激活，誘導細胞凋亡[7,12]。因此，線粒體作為內分泌細胞器，不僅是為發生氧化應激作用直接提供所需要的能量和信號的細胞器，還是ROS激活P53調控線粒體凋亡途徑發生引起α-AMA中毒肝細胞發生凋亡的主要機制之一。

2 ROS誘導P53激活線粒體凋亡途徑與α-AMA中毒肝細胞異常凋亡的相關性

2.1 α-AMA促進肝細胞內ROS產量增加

α-AMA引起肝細胞內高ROS環境下對細胞成分造成不利修飾，通過氧化修飾對生物分子如DNA、蛋白質和脂質造成損傷，而受損分子可使ROS產量進一步增加，形成惡性循環[19]。進一步引起氧化應激、脂質過氧化反應、線粒體結構受損，進而促進Bax表達和抑制Bcl-2表達使Bax/Bcl-2值上調、Caspase-9和Caspase-3激活，α-AMA使ROS產量增多可以向P53基因提供激活信號，使P53表達增多和發生磷酸化向線粒體內易位，誘導線粒體凋亡途徑發生[7,20-22]。

2.2 α-AMA促進ROS產生進而誘導P53表達并磷酸化向線粒體內易位

P53作為核轉錄因子主要存在于細胞核和細胞質中，與DNA分子發生特異結合，通過磷酸化修飾發揮活性，同時也是細胞中具有關鍵調節功能的多功能轉錄因子，在維持基因組完整性方面占有舉足輕重的地位。P53在肝細胞內表達水平較低且半衰期短，其降解過程主要與泛素蛋白連接酶鼠雙微粒體2(murine double minute 2,MDM2)作為E3泛素連接酶(E3 ubiquitin ligases)相互作用降低活性，并通過泛素蛋白酶體途徑和26S蛋白酶體降解，使P53維持在低水平狀態[23-25]。而有文獻報道，α-AMA中毒可使P53作為重要應激傳感器調控線粒體凋亡途徑引起肝細胞凋亡[16,26-27]。相關研究發現，α-AMA抑制CAT活性使胞內產生大量的H2O2，而經人類細胞對H2O2進行降解的微陣列分析得知，H2O2的48個高度應答基因與P53近1/3靶點相吻合，并且ROS和P53之間也存在交叉信號通路，可使α-AMA中毒誘導P53基因表達增加，也使P53蛋白多個位點發生磷酸化修飾激活活性[28-29]。另有研究發現，由于α-AMA中毒可抑制RNAPⅡ表達水平，引起非復制依賴性方式誘導P53絲氨酸-15位點發生磷酸化和P53積聚，并且由于α-AMA中毒導致胞內呈氧化應激狀態，引起MDM2減弱對P53泛素化能力，進而減少P53降解、半衰期延長、穩定性和活性顯著提高[30-31]。

2.3 α-AMA誘導ROS產生進而激活P53調控線粒體凋亡途徑發生

線粒體凋亡途徑是通過激活細胞內部途徑引起凋亡的主要調節通路，以激活Caspase-9蛋白為主，α-AMA中毒肝細胞凋亡正是通過激活線粒體凋亡途徑導致。ROS不僅作為α-AMA中毒誘導肝細胞線粒體凋亡的上游信號分子，同時也誘導P53調控Bcl-2家族基因和Bax基因表達觸發線粒體凋亡途徑發生。因此，P53在α-AMA中毒誘導線粒體凋亡途徑的發生中起到極其重要作用。Chen等[7]研究也加以驗證，α-AMA環境中的L-02細胞內Caspase-9和Caspase-3活性增加，但Caspase-8活性并未發生變化。眾所周知，促凋亡蛋白Bax是調控細胞凋亡的關鍵啟動因子，由于Bax基因第1個內含子中的啟動子是P53依賴性轉錄激活反應元件，當磷酸化P53與該內含子反應元件相互作用時可促進內源性Bax的mRNA翻譯，使Bax蛋白含量增加[39]。與此同時，P53通過調控銜接蛋白凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC)表達增加，與Bax相互作用定位于線粒體內膜上發生寡聚化，線粒體P53下調線粒體膜上抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平，使Bax/Bcl-2值增加而引起線粒體孔隙形成，使線粒體膜通透性增加、膜電位降低、Cyt C等促凋亡因子釋放至胞質[25,40]。在胞質內，P53反應元件直接上調凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1)表達水平并與Cyt C形成凋亡復合體，進一步誘導Caspase-9活化并激活效應Caspase-3，啟動Caspase級聯反應觸發線粒體凋亡途徑，最終導致肝細胞快速凋亡[41-43]。

3 α-AMA中毒肝損害的治療展望

α-AMA中毒誘導肝細胞快速凋亡引起肝損害已成為最致命也是最難治療環節。然而，目前對α-AMA中毒導致肝損害具體機制尚未完全清楚，因此還未有對含鵝膏毒肽類物質中毒的治療國際共識和特異性解毒劑。ROS作為誘導人肝細胞線粒體凋亡的上游介質和啟動因子之一，可調控P53表達及磷酸化激活活性，通過mPTP向線粒體易位觸發線粒體凋亡途徑引起肝細胞凋亡。因此，減弱細胞內氧化應激發生是最有效的治療選擇。近期研究發現，海洋蠕蟲海沙躅(marine worm arenicola marina，M101)體內提取的胞外血紅蛋白由198條多肽鏈組成，總質量為3 682 kDa，在飽和狀態下可攜帶156個O2，具有顯著O2結合能力和抗氧化特性[44]。相關實驗證明，α-AMA以不同劑量與人肝臟祖細胞(HepaRG)共同孵化時，α-AMA濃度與ROS生產量成正比關系，并顯著降低HepaRG細胞活力，當加入M101時線粒體ROS生成量顯著降低、活性增強，抑制線粒體氧化應激發生并發生逆轉效果，從而降低線粒體功能障礙發生，進而引起P53表達及磷酸化修飾減少，并且凋亡細胞相關蛋白酶、Cyt C、Caspase家族都出現可逆性作用，使人肝癌細胞(HepaRG)死亡率下降，甚至恢復活性[45]。因此M101可能會成為α-AMA中毒的有效解毒劑，但還需大量研究加以證實。對α-AMA毒性機制研究對于開發更加有特異性解毒劑至關重要。

4 結 語

綜上所述，α-AMA中毒可影響多種細胞生命代謝過程，在肝細胞內可引起大量ROS產生進而導致氧化應激發生、P53與磷酸化P53表達增加并向線粒體發生易位引起線粒體通透性發生改變造成功能障礙，還可引起Bax/Bcl-2值增加使Cyt C釋放至胞質中激活Caspase級聯反應，激活線粒體凋亡途徑造成肝細胞快速凋亡。進一步闡述了α-AMA中毒調控肝細胞凋亡的潛在機制，也驗證ROS可能作為α-AMA誘導肝細胞凋亡早期上游信號分子，在誘導P53對線粒體凋亡途徑調控肝細胞凋亡機制中起到關鍵調控作用，使α-AMA、P53、ROS、線粒體凋亡途徑和肝細胞凋亡產生關聯。因此，臨床上發生急性α-AMA中毒時，減少ROS產生進而抑制P53過度表達和磷酸化將會是減少α-AMA中毒肝損害的工作重點，也是我們努力的方向，期望進一步明確α-AMA中毒肝損害的機制，為含α-AMA蘑菇中毒患者提供更加有效治療方案、尋求特異性解毒劑提供合理的理論依據。

聲明：所有作者均不存在利益沖突。