大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統

郎 松，張艷微，鄭漢青，徐林鈺，汪路涵，鞏 巖

（1. 中國科學技術大學 生物醫學工程學院(蘇州) 生命科學與醫學部, 江蘇 蘇州 215163；2. 中國科學院 蘇州生物醫學工程技術研究所, 江蘇 蘇州 215163）

1 引 言

現代生物學和生物醫學領域迫切需要大視場、高分辨率的顯微成像技術和儀器對生物樣品進行兼顧“全局形態”和“細節特征”的跨尺度觀測，以滿足重大科學問題的研究需求。在腦科學研究領域，需要在全腦范圍內獲取介觀尺度的單神經元結構和功能信息，揭示腦連接及腦活動的運行機制[1-2]；在發育生物學和胚胎學研究領域，需要對發育早期的胚胎進行快速三維成像，同時以亞細胞尺度的分辨率對器官或組織進行更加精細的追蹤分析[3-4]；在腫瘤學研究領域，需要對活體腫瘤組織進行大視野、亞細胞分辨率成像，進而對腫瘤發生和發展的機理、腫瘤分子診斷及邊界識別等開展研究[5-6]。

然而，通過傳統的顯微鏡捕捉到的圖像，樣品的成像范圍和圖像的細節水平間存在矛盾，即成像視場（Field of View, FOV）和分辨率相互制約，這主要受限于系統的空間帶寬積（Space Bandwidth Product, SBP）。空間帶寬積指顯微系統的成像視場中可解析像素的數量，用于表征系統所傳遞的信息量。顯微系統的空間帶寬積由顯微物鏡的空間帶寬積和探測器的空間帶寬積共同決定。一般而言，探測器的空間帶寬積（指探測器的像素數）需與顯微物鏡的空間帶寬積相匹配。顯微物鏡的空間帶寬積與成像視場成正比，與分辨率的平方成反比，即SBP=FOV/(0.5ε)2，其中，系數0.5來源于奈奎斯特采樣定律，ε為顯微物鏡的橫向分辨率，其由顯微物鏡的工作波長和數值孔徑（Numerical Aperture，NA）決定。現有商業顯微鏡的空間帶寬積通常在幾兆至幾十兆范圍內。一方面，受設計、加工和裝調工藝的限制，顯微物鏡的空間帶寬積難以提升，此外，商業顯微鏡的物鏡需滿足互換性要求，通常按照一定行業標準或企業標準設計，這也限制了顯微物鏡的設計空間；另一方面，商業圖像傳感器的像素數量有限，無法滿足高空間帶寬積成像需求。

為了突破成像系統空間帶寬積的限制，研究者們采取了以下兩種方法：(1)掃描拼接成像[7-10]；(2)傅立葉切片成像[11-12]。然而，這兩類方法的缺點是全視場成像速度慢，在成像過程中樣本需要保持靜態，這在生物動力學的研究中很難實現[13]。在半導體器件制造領域，為了提高成像系統的空間帶寬積，研究者們開發了大視場浸水光刻物鏡及成像系統，但這些系統僅適用于單色光（例如波長為193 nm的單色光）和固定物距的工作場景，難以應用于生物醫學成像領域[14]。在生物醫學成像領域，英國科學家McConnell 等人研發了大視場高分辨率顯微物鏡 Mesolens[14-16]。該顯微物鏡成像視場為 Φ6 mm，數值孔徑為0.47，基于Mesolens設計的共聚焦顯微鏡橫向分辨率和軸向分辨率分別為 0.7 μm 和 7 μm，可以對直徑達Φ6 mm、厚達3 mm的生物樣本進行三維成像，由于采用點掃描共聚焦成像的策略，該顯微鏡需要大約 200 s才能獲得全視場的圖像，這極大地限制了其在高動態樣品上的應用[14-16]。美國科學家Spencer LaVere Smith團隊開發了大視場、雙路徑掃描的雙光子顯微鏡系統Diesel2p，該系統在全視場成像模式下，成像視場略小于5 mm×5 mm，橫向分辨率約為1 μm，軸向分辨率約為8 μm，成像深度可達500 μm；在多區域成像模式下，兩束獨立的激光同時在兩個不同的區域采集圖像，成像視場均為1.5 mm × 5 mm，分辨率為1.5 μm×1.2 μm，成 像速率為3.84 frame/s[17]。采用雙光子成像技術的Diesel2p較好地抑制了離焦信號的干擾且具有較深的成像穿透深度，但是其成像速度和成像分辨率仍有較大的提升空間。國內方面，戴瓊海院士團隊研發了超寬視場高分辨率實時顯微成像儀器（RUSH），采用特制高空間帶寬積顯微物鏡（成像視場為10 mm×12 mm，數值孔徑為0.35）和35個像素為2 560 × 2 160的相機陣列，構建了多尺度曲面中繼協同的顯微成像系統，實現了兼具1 cm×1.2 cm超寬視場、1.2 μm高分辨率、30 frame/s高幀率、5.1 GPixel/s高數據通量的生物動態成像[13]。然而，RUSH系統的軸向分辨率偏低，僅有15.52 μm±1.80 μm，而且視場拼接的成像方式會不可避免地降低全視場圖像中重疊區域的分辨率和強度。此外，上述高空間帶寬積顯微成像系統共同的特征是體積龐大、實施成本高昂、難以推廣應用。

為了獲取大體積生物組織的三維精細結構，顯微成像系統需具備光切片成像能力。通常采用兩種策略實現光切片成像[18]：一種是通過控制照明光僅激發樣品焦面附近信號，避免激發離焦信號，如多光子顯微成像技術[19]、光片照明顯微成像技術[20]、全內反射顯微成像技術[21]等；另一種是通過物理阻擋、解調或去卷積算法實現對離焦信號的去除，留下焦面上的清晰信號，如共聚焦顯微成像技術[22]、結構光照明顯微成像技術[23]、動態散斑照明顯微成像技術[24]、HiLo顯微成像技術[25]等。相關的研究證明了HiLo 顯微成像與共聚焦顯微成像技術的光切片能力相當，但前者全視場光切片成像速度明顯優于后者，原則上僅受相機曝光時間的限制，此外，HiLo 顯微鏡僅需要消散斑裝置和相干照明光源（如激光）即可低成本地實施[25]，且與常規熒光顯微鏡具有良好的兼容性。

因此，針對現代生物學和生物醫學領域對生物樣品進行大視野、高分辨率的跨尺度觀測需求，以及現有高空間帶寬積顯微成像系統存在體積龐大、實施成本高昂等問題，本文基于HiLo光切片技術和自主設計的大視場高分辨顯微物鏡，研發了具有高空間帶寬積特點的大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統，測試了系統的成像視場和分辨率，開展了生物樣本成像實驗，旨在展示該系統具有兼顧大視場和高分辨率成像的優勢和快速光切片成像的能力，能夠對大體積生物樣本開展快速三維成像，為胚胎發育、腦成像、數字病理診斷等研究提供有力的技術支撐。

2 方法及原理

2.1 HiLo光切片技術

HiLo光切片技術最早由Mertz等人提出，其中，“Hi”和“Lo”分別代表焦面高（High）空間頻率和焦面低(Low)空間頻率分量。該技術需對樣本采集一幅散斑照明圖像Is和一幅均勻照明圖像Iu（包含焦面高頻信息、焦面低頻信息和離焦信息），然后對Is和Iu的差分圖像進行對比度評價，得到加權函數，以此函數作為Iu中焦面信息的比例，將低通濾波器應用于加權的均勻照明圖像，得到Iu中的焦面低頻分量，然后，將互補的高通濾波器應用于Iu，獲得焦面高頻分量，最后，將二者加權融合，得到光切片圖像[25-26]。相應算法的流程如下：

首先，計算散斑照明圖像和均勻照明圖像的差分圖像δI的 散斑對比度Cδs(z)，Cδs(z)在樣本對焦時達到峰值，而在樣本離焦時衰減為零，因此可以用于區分均勻照明圖像中焦面信息和離焦信息，具體表達式為[26]：

其中，As是 散斑顆粒的平均橫向面積， OTFdet(k,z)是顯微系統光學傳遞函數， OTFill(k,0)是照明光學傳遞函數，W(k)是通過兩個高斯低通濾波器相減生成的帶通濾波器，用于加速Cδs(z)離焦衰減，

其中，k是空間頻率，σ是帶通濾波器的標準偏差。仿真實驗已經證明，光切片能力（即系統軸向分辨率）與σ成反比[26]。系統的軸向分辨率與其三維點擴散函數相關，可通過顯微物鏡焦深計算公式確定系統的軸向分辨率理論值，進而估計σ。

以上述散斑對比度Cδs(z)為加權函數得到均勻照明圖像中焦面信息的比例，將低通濾波器LP(k)應用于加權的均勻照明圖像，得到均勻照明圖像中的焦面低頻信息ILP為

進一步，將高通濾波器 HP(k)=1-LP(k)直接應用于均勻照明圖像，得到互補的焦面高頻信息，即

最后，由上述兩幅圖像加權融合得到HiLo 光切片圖像，即

其中，η是一個縮放函數，用于補償實際成像中散斑對比度通常不等于 1的情況，確保低空間頻率到高空間頻率的平滑過渡。η可以通過以下公式計算，

實踐中，高通濾波器和低通濾波器的分割頻率kc可 以按照kc=0.18σ估計[26]。

2.2 大視場高分辨顯微物鏡

顯微成像系統的視場和分辨率主要由顯微物鏡決定。根據瑞利判據和顯微物鏡焦深計算公式，顯微物鏡的橫分辨率 ε和軸向分辨率zmin分別為

式中，λ為工作波長，n為 物方介質折射率，NA為顯微物鏡的數值孔徑。若顯微物鏡工作波段為可見光波段，為保證系統橫向分辨率達到亞微米級，顯微物鏡數值孔徑至少為0.49。據此，設計了大視場高分辨顯微物鏡，其參數如表1所示。

表1 大視場高分辨顯微物鏡設計參數Tab. 1 Design parameters of the wide-field-of-view and high-resolution objective

大視場高分辨顯微物鏡光學采用無限遠共軛距結構，初始結構采用傳統顯微物鏡的8組11片鏡片結構形式，通過改變各個鏡片的曲率半徑與間距、選擇特殊玻璃材料以及控制鏡頭組的光焦度等一系列手段，對像差進行優化校正，得到滿足性能要求的光學設計，如圖1（彩圖見期刊電子版）所示。圖1（a）像差曲線表明，物鏡的球差和慧差控制良好；圖1（b）軸向色差曲線表明，各波長的光在0.85歸一化光瞳坐標下幾乎交于一點，表明良好地校正了軸向色差，實現了復消色差；圖1（c）場曲和畸變曲線表明，該鏡頭滿足平場條件，最大畸變小于1%；圖1（d）MTF曲線圖表明，全視場全波段的MTF接近衍射極限，在1 000 lp/mm處MTF達到0.2，物鏡設計良好。

圖1 大視場高分辨顯微物鏡光學設計評價圖Fig. 1 Design evaluation graphs of the wide-field-of-view and high-resolution objective

2.3 大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統

基于HiLo光切片技術和大視場高分辨顯微物鏡設計了大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統，系統光學原理如圖2所示，其主要由激光光源模塊、落射式照明模塊、白光照明模塊和成像模塊等組成。激光光源模塊由波長為488 nm和561 nm的雙色激光器、消散斑裝置和光纖耦合器構成，消散斑裝置基于多模光纖振動的方法抑制激光散斑，通過控制消散斑裝置中音圈電機模組振動的關閉/開啟，獲取散斑照明激光和均勻照明激光。落射式照明模塊由光纖耦合器、兩套4f中繼鏡組和光闌構成，用于將激光光源模塊傳導過來的激光光束準直、擴束、會聚、再準直，最后，形成平行光照亮樣品面。白光照明模塊由白光LED光源、科勒照明光路構成，用于為顯微系統提供合適的白光照明光源。成像模塊由軸向電動精密位移臺、二維載物臺、大視場顯微物鏡、熒光濾光器模組、反射鏡、管鏡、大靶面相機構成。其中，熒光濾光器模組由488 nm熒光濾光器和561 nm熒光濾光器構成，它們可以切換至成像模塊主光路中，每一組熒光濾光器由對應的激發光濾光片、二向色鏡、發射光濾光片構成。成像模塊用于接收樣品的透射光和熒光信號，實現明場成像或熒光成像。

圖2 大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統光學原理圖Fig. 2 Schematic diagram of wide-field-of-view and high-resolution HiLo optical sectioning microscopy system

為了匹配大視場顯微物鏡的空間帶寬積，需選用大靶面科學級相機（sCMOS），根據奈奎斯特采樣定理，探測器對角線方向需要的像素數為6 mm/(0.98 μm/2)＝12 245。因此，選用韓國LAON PEOPLE公司LPMVC-CXP151M面陣相機，像素為14 192(H)×10 640(V)，像元大小為3.76 μm×3.76 μm，全分辨率幀率為6 frame/s。由于該相機數據通量高達0.9 GPixel/s，為其配備了高速數據采集卡。高速數據采集卡型號為以色列KAYA Instruments公司的Komodo CoaXPress 4CH，具備4個CoaXPress接口通道，每個通道數據傳輸速度為6.25 frame/s。此外，根據大視場顯微物鏡和大靶面相機參數，匹配設計了成像管鏡，焦距為444 mm。

基于上述原理研發了大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統，實物照片如圖3所示。相較現有商業顯微鏡幾兆（Million，M）至幾十兆的空間帶寬積，本系統空間帶寬積高達151 M，系統參數如表2所示。系統具備3種成像模式：（1）白光照明的明場成像；（2）均勻激光照明的寬場熒光成像；（3）散斑和均勻激光混合照明的HiLo光切片成像。

圖3 系統實物照片Fig. 3 Photo of the system

表2 系統參數Tab. 2 Parameters of the system

綜上，HiLo光切片顯微成像系統與落射式熒光顯微鏡類似，只是在照明路徑中增加了激光束和消散斑裝置，以形成散斑照明和均勻照明光。當消散斑裝置處于靜態時，在樣品面上形成散斑照明；當消散斑裝置工作時，產生的散斑在相機曝光過程中變得模糊，有效地在樣品面上形成了均勻照明。對采集的散斑照明圖像和均勻光照明圖像進行處理，得到HiLo光學切片圖像。

3 系統性能測試

3.1 成像視場測試

利用大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統對Thorlabs公司測試靶標R1L3S5P進行白光照明明場成像，開展系統成像視場測試實驗，測試結果如圖4所示，其中，圖4(a)為橫向視場測試結果，圖4(b)為縱向視場測試結果。由圖4可知，系統的橫向視場H約為4.8 mm，縱向視場V約為3.6 mm。計算可得，系統的對角視場

圖4 系統成像視場測試結果圖Fig. 4 The test results of FOV of the system

3.2 分辨率測試

利用大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統對經過標定的星點直徑為 Φ 200 nm的星點板進行白光照明明場成像，開展系統橫向分辨率測試實驗。在采集的星點圖像上隨機選取15個星點像，對其橫向光強分布進行高斯擬合，得到橫向光強分布半峰全寬（Full Width at Half Maximum，FWHM），FWHM取平均值后，由以下公式計算得到系統橫向分辨率ε，即

式中，dx是相機像元大小，X是大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統的放大倍率。

系統橫向分辨率測試結果如圖5（彩圖見期刊電子版）所示。圖5（a）是200 nm星點板白光照明明場成像結果，圖5（b）是隨機選取的15個星點像橫向光強分布曲線，圖5（c）是15個星點像橫向光強分布高斯擬合曲線的FWHM。FWHM平均值為2.19 pixel，相機像元尺寸為3.76 μm，系統放大倍率設計值為11.1×，由式（9）計算得到系統的橫向分辨率為0.74 μm。

圖5 系統橫向分辨率測試結果圖Fig. 5 The test results of lateral resolution of the system

利用大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統對2 μm綠色熒光聚甲基丙烯酸甲酯微球（無錫瑞格生物科技有限責任公司，型號UniFlu PMMA-0202G，以下簡稱“熒光微球”）進行三維光切片成像，開展系統軸向分辨率測試實驗。將稀釋后的熒光微球溶液用濃度為6%甲基纖維素凝膠固定在培養皿中，然后將培養皿固定在樣品臺上。在488 nm激發光照明下，系統以0.3 μm的運動步長對熒光微球樣品軸向（Z向）掃描成像，共采集50層圖像，每層圖像包含一幅散斑照明熒光圖像和一幅均勻照明熒光圖像。

利用HiLo光切片算法處理每層散斑照明圖像和均勻照明圖像，得到50層熒光微球光切片圖像，合成為熒光微球三維光切片圖像。在三維光切片圖像中隨機選取15個熒光微球，對其光強分布進行去卷積處理，排除熒光微球直徑對測量結果的影響，得到系統三維點擴散函數（Point Spread Function, PSF），然后對三維PSF軸向光強分布進行高斯擬合，得到FWHM，FWHM取平均值后，結合電動精密位移臺運動步長dz計算得到系統軸向分辨率zmin，即

系統軸向分辨率測試結果如圖6（彩圖見期刊電子版）所示：圖6（a）是熒光微球部分Z平面的熒光圖像，圖6（b）是隨機選取的15個熒光微球去卷積后得到的三維PSF軸向光強分布曲線，圖6（c）是三維PSF軸向光強分布高斯擬合曲線的FWHM。FWHM平均值為13.87步（step），由式（10）計算得到系統軸向分辨率為4.16 μm。

圖6 系統軸向分辨率測試結果圖Fig. 6 The test results of the axial resolution of the system

綜上，系統成像視場測試值為6.0 mm，與設計值一致；系統橫向分辨率測試值為0.74 μm，軸向分辨率測試值為4.16 μm。

4 生物樣本成像實驗

4.1 小鼠腦切片明場成像實驗

利用大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統對蘇木精-伊紅(HE)染色的小鼠腦冠狀切片開展白光照明明場成像實驗，并與成像視場相近的OLYMPUS顯微鏡BX50（配備PLN4X物鏡：NA，0.1，FOV，Φ5.5 mm）和分辨率相近的OLYMPUS顯微鏡BX50（配備PLN20X物鏡：NA，0.4；FOV，Φ1.1 mm）成像結果對比，成像結果如圖7（彩圖見期刊電子版）所示。圖7（a）是大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統的成像結果，圖7（b）是成像視場相近的OLYMPUS顯微鏡成像結果，圖7（c）是分辨率相近的OLYMPUS顯微鏡成像結果。圖7表明，大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統與成像視場相近的OLYMPUS顯微鏡相比，具有更高的分辨率；與分辨率相近的OLYMPUS顯微鏡相比，具有更大的成像視場。因此，系統具有兼顧大視場和高分辨成像的優勢。

圖7 HE染色的小鼠腦切片白光照明明場成像結果對比圖Fig. 7 Comparison of brightfield imaging results of a HEstained mouse brain slice illuminated by white light

4.2 小麥種子熒光切片三維光切片成像實驗

利用大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統對異硫氰酸熒光素-小麥胚芽凝集素(FITCWGA)染色的小麥種子切片開展三維（Three-dimensional，3D）光切片成像實驗。被測樣品體積約為4.2 mm×3.6 mm×0.1 mm，激發光波長為488 nm，激光器功率約為50 mW，樣品平面上的光功率密度約為1.2 mW/cm2，相機曝光時間設為500 ms，以2 μm的運動步長對樣本進行軸向（Z向）掃描

成像，共采集50層100幅圖像（每層采集一幅散斑照明圖像和一幅均勻照明圖像）。利用HiLo光切片算法處理每層采集的散斑照明圖像和均勻照明圖像（即寬場熒光圖像），得到50層圖像切片，將所有切片合成為三維光切片圖像棧，相應的均勻照明圖像切片合成為三維寬場圖像棧，成像結果對比圖如圖8（彩圖見期刊電子版）所示。圖8（a）和8（b）分別是三維光切片圖像棧和三維寬場圖像棧全視場XY平面均值投影圖，圖8（c）和8（d）分別是三維光切片圖像棧和三維寬場圖像棧局部視場XY平面均值投影圖，圖8（e）和8（f）分別是三維光切片圖像棧和三維寬場熒光圖像棧局部視場XZ平面投影圖。圖8表明，大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統具有顯著的光切片能力，在對厚樣本成像時，能夠有效抑制傳統寬場熒光成像時的離焦信息，提高圖像的橫向分辨率和軸向分辨率。

圖8 FITC-WGA染色的小麥種子熒光切片三維光切片成像和三維寬場熒光成像結果對比圖（50層圖像切片，單層圖像切片厚2 μm）Fig. 8 Comparison of 3D optical sectioning and wide-field fluorescence imaging results of a FITC-WGAstained wheat seed fluorescence slice (50 slices,2 μm thick of every slice)

此外，系統對小麥種子熒光切片50層圖像的采集共計耗時約150 s（包含軸向精密位移臺的運動時間和圖像存儲時間），這表明，大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統能夠對大體積生物樣本開展快速光切片成像。

5 結 論

現代生物學和生物醫學領域迫切需要大視場、高分辨率的顯微成像技術和儀器對生物樣品進行兼顧“全局形態”和“細節特征”的跨尺度觀測，以滿足重大科學問題的研究需求。受限于系統的空間帶寬積，傳統商業顯微鏡無法滿足這一需求，且現有高空間帶寬積顯微成像系統存在體積龐大、實施成本高昂等問題。本文基于HiLo光切片技術和自主設計的大視場高分辨顯微物鏡，研發了具有高空間帶寬積特點的大視場高分辨顯微成像系統，測試了系統的成像視場和分辨率，應用該系統對小鼠腦切片開展了白光照明明場成像實驗，并與成像視場和分辨率相近的OLYMPUS顯微鏡成像結果做了對比，同時，應用該系統對小麥種子熒光切片開展了光切片成像和寬場熒光成像對比實驗。實驗結果表明, 大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統的成像視場為4.8 mm×3.6 mm(對角視場6.0 mm)，橫向分辨率為0.74 μm，軸向分辨率為4.16 μm。大視場高分辨HiLo光切片顯微成像系統具有兼顧大視場和高分辨率成像的優勢和快速光切片成像的能力，能夠對大體積生物樣本開展快速三維成像，將為胚胎發育、腦成像、數字病理診斷等研究提供有力的技術支撐。