一株短小芽胞的分離鑒定及其對屠宰牛血液的降解功能研究

向 軍， 馬子豪， 余金鳳， 馬忠仁， 丁功濤，周雪雁，*， 張福梅， 默罕默德.索布瑞.塔克瑞夫

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730124；2.西北民族大學生物醫學研究中心，甘肅蘭州 730030；3.西北民族大學醫學院，甘肅蘭州 730030；4.馬來西亞國立大學工程與建筑環境學院化工系，馬來西亞雪蘭莪州萬宜43600）

隨著社會的不斷發展和人們對肉制品的需求增長，畜禽屠宰過程中所產生的廢棄血液也隨之增加，無論長時間存放還是消毒處理后排放，都會導致土壤環境和空氣污染及資源浪費。目前對于屠宰血液主要被開發利用為高蛋白血飼料（王燕，2017；潘春梅，2015；Yao等，2012）的生產、血蛋白肽（趙靜，2015；赫玉蘭，2015）制備和血紅素（賈志春，2016）提取。傳統采用蒸煮干燥、膨化、微生物發酵和酸堿水解等處理方法（Ward等，2009）將血液蛋白制備成畜禽和水產飼料原料，但這種飼料的缺點是適口性差，消化吸收率低，在實際應用上受到很大限制。而血紅素的提取或血蛋白肽制備利用程序復雜，要求配置高，對屠宰血液的再利用也非常有限，因此，急需發掘一種對屠宰血液有效處理和全面利用的新途徑。相比之下，采用蛋白酶和微生物降解廢棄血液生產含氨基酸水溶肥料，可在保護環境的同時實現資源的全面循環利用。研究表明，乳酸菌（Salum等，2017）、堿性蛋白酶和風味蛋白酶（劉元林等，2021）、地衣芽孢桿菌（周雪雁等，2020）、枯草芽孢桿菌 （Wang等，2015）、黑曲霉（Zheng等，2014）和米曲霉（Wang等，2007）都對屠宰牛血污有降解效果，但由于血液中血紅蛋白和纖維蛋白空間結構復雜高級，單菌劑和單酶制劑很難完全將血液降解利用。因此，需要大量試驗篩選出能夠有效降解牛血液的多種微生物和酶類，采用菌-酶協同作用才能實現對血液蛋白的充分降解和全面的利用。本研究旨在從屠宰場血液污泥中篩選出一株高效降解牛血液的菌株，并初步探究該菌株對牛血液的降解效果和優化其降解的最佳參數，為后續的多菌劑和菌-酶協同作用降解血液提供可行性的試驗方法，以及將降解后的產物制備成含氨基酸水溶肥的一種新型生態肥料。

1 材料與方法

1.1 分離基質 采集于甘肅省甘南藏族自治州瑪曲縣屠宰場下水污泥（N：34°31′4″，E：102°39′33″；海拔：3700 m左右）。

1.2 培養基

1.2.1 酪素培養基平板Na2HPO4·12H2O 1.3 g/L，KH2PO40.36 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，ZnCl20.014 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCl2·2H2O 0.002 g/L，酪素4 g/L，胰蛋白酶0.05 g/L，瓊脂18 g/L，pH 7.0。

1.2.2 哥倫比亞血瓊脂平板 酪蛋白胰酶消化物、肉胃酶消化物、酵母浸出粉、心胰酶消化物、無菌脫纖維羊血、玉米淀粉、氯化鈉、瓊脂、純化水。1.2.3 LB培養基 蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.2。

1.3 主要試劑 革蘭染色液試劑盒（北京陸橋），細菌生化試劑盒（杭州微生物試劑），細菌DNA提取試劑盒（TaKaRa），甲醛溶液（天津市百世化工），培養基中各試劑均為分析純。

1.4 儀器與設備 恒溫磁力攪拌器（IT-09A5，上海一恒科學儀器），pH儀（Seven2G0TM，上海梅特勒-托利多儀器），電泳儀（DYY-6D，北京市六一儀器廠），立體式蒸汽滅菌器（YXQ-LS，上海博訊醫療生物儀器），超凈工作臺（SW-CJ-1CU，蘇州安泰空氣技術），PCR擴增儀（846-X-070-280，德國Biometra公司），恒溫培養箱（XMTD-8222，濟南來寶器械），恒溫振蕩器（IS-ROV1，上海智城分析儀器制造），凱氏定氮儀（KjeltecTM 8200，上海展儀儀器設備），蛋白印跡免染檢測分析系統（732BR1588，時代聯想生物科技）。

1.5 試驗方法

1.5.1 菌株分離篩選及形態學鑒定 將血液污泥基質用無菌水進行10-4~10-5梯度稀釋，吸取200 μL稀釋液均勻涂布于酪素培養基上37℃恒溫培養24 h，選取具有透明水解圈的單個菌落，劃線接種于哥倫比亞血瓊脂平板上繼續培養，再挑取有最大溶血環的單個菌落進一步接種于血瓊脂平板上純化，選取純化后的單個菌落進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察并記錄菌落的形狀、大小、顏色、排列、光澤、透明度、邊緣、質地等，判斷為純培養菌株后用體積分數為20%的甘油保存，作為目標菌株。用固定液對目標菌株進行處理，結合掃描電子顯微鏡觀察菌體的大小和形態結構。

1.5.2 生理生化鑒定 吸取適量凍存菌液接種于100 mL的LB培養基中，在37℃、180 r/min的搖床中培養12 h至對數生長期，分別接入50 μL種子液到各生化反應管中培養至指定時間，觀察并記錄反應結果，做三次平行試驗，按照《常見細菌系統鑒定手冊》作菌株鑒定（Holt等，1994）。

1.5.3 16S rDNA序列鑒定 將菌株接種于100 mL培養基中，在37℃、180 r/min搖床中培養12 h至對數生長期，吸取2 mL菌液至無菌離心管中，12000 r/min離心2 min后，棄去上清液，提取目標菌 株 的 總DNA。采 用 通 用 引 物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’對所提DNA進行特異性PCR擴增。PCR反應管中7 μL ddH2O水、2 μL 27F引物、2 μL 1492R引物、12.5 μL 2×TaqMix、1.5 μL DNA模板，總反應體系為25 μL。采用94℃預變性4 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環后72℃延伸10 min，4℃冰箱保存，PCR產物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA測序。利用GenBank數據庫中Nucleotide BLAST比對功能進行分析（Bethesda等，2021），使用MEGA 7.0軟件構建基于16S rDNA序列的Neighbor-Joining系統發育樹。

1.5.4 降解血液效果試驗

1.5.4.1 碳源、無機鹽對降解血液效果的影響采用單因素試驗，以20 mL牦牛血液作為氮源，分別在培養基中添加不同的碳源（10 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥麩、乳糖、小麥淀粉、玉米淀粉），按照2%的菌株添加量接種到培養基中，在37℃、180 r/min條件下發酵培養96 h，測定牛血液降解率。確定最優碳源后，優化其最佳濃度，碳源濃度選擇0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%。再對不同的無機鹽（5 g/L的NaCl、CaCl2、KCl、MgCl2、ZnCl2、NH4Cl、NaH2PO4+Na2HPO4）進行探究。試驗采用甲醛滴定法（楊文博等，2014）測定游離氨基酸的含量，凱氏定氮法（國家食品藥品監督管理總局，2016）測定牛血液發酵前總氮含量，牛血液降解率計算公式如下：

1.5.4.2 降解血液發酵條件優化 確定培養基中最佳組分后，以20 mL牛血液作為培養基中氮源，加入80 mL無菌水，依次對不同降解溫度、初始pH、接種量和發酵時間進行單因素試驗，確定各最優單因素降解條件。降解溫度選擇20、25、30、35、37、40、45℃；初始pH選擇5、6、7、8、9、10、11；接種量選擇1%、2%、3%、4%、5%、6%；降解時間選擇12、24、36、48、60、72、84、96 h。確定上述最佳培養條件后，對相對體積分數的牛血液進行優化，牛血液體積分數選擇5%、10%、15%、20%、25%、30%。1.5.4.3 Plackett-Burman試驗設計 以各單因素為試驗基礎，牛血液降解率（%）為響應值，利用minitab19軟件對降解時間（h）、接種量（%）、麥麩濃度（g/L）、降解溫度（℃）、初始pH和血液體積（%）6個影響因素進行n=12的Plackett-Burman試驗設計（表1）。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素及水平

1.5.5 響應面Box-Behnken試驗設計 根據Plackett-Burman試驗設計結果分析，利用Design Expert 8.0軟件對接種量、初始pH、降解溫度和麥麩濃度4個因素進行4因素3水平的Box-Behnken試驗設計（表2）。

表2 Box-Behnken試驗設計因素及水平

2 結果與分析

2.1 菌株分離篩選及形態學鑒定 試驗用酪素培養基和哥倫比亞血瓊脂平板分離得到一株能夠降解牛血液的菌株。將菌株置于37℃恒溫培養箱中培養24 h后，觀察到在血瓊脂平板上的菌落形態為圓形、凸起、灰白色、表明光滑、黏稠、邊緣整齊、不透明、有光澤，直徑2.7~4.2 mm，溶血圈的大小約為10.0 mm，在酪素培養基平板上菌落形態為白色，菌落直徑為1.0~1.4 mm，透明水解圈直徑約為4.5 mm（圖1）。選取單一菌落接于LB培養基中，置于37℃、180 r/min的搖床培養12 h，結合革蘭氏染色鏡檢和掃描電子顯微鏡觀察，菌體細胞呈藍紫色，桿狀，為革蘭氏陽性菌，大小為0.4~0.6 μm×1.2~3.1 μm，兩端鈍圓，有芽孢，周生鞭毛，呈單個或兩個排列（圖2）。2.2生理生化鑒定 根據細菌生理生化鑒定試驗，通過糖發酵、枸櫞酸鹽、硝酸鹽還原、大分子水解等試驗對菌株NWMCC0302進行生理生化特性測定（表3），結合《常見細菌系統鑒定手冊》進行分類分析，鑒定該菌株為芽孢桿菌屬。

表3 菌株NWMCC0302生理生化反應試驗結果

圖1 菌株NWMCC0302在酪素培養基平板（上）與哥倫比亞血瓊脂平板（下）上的菌落形態特征

圖2 菌株NWMCC0302革蘭氏染色鏡檢（×1000倍）（上）與掃描電子顯微鏡結果（×10000倍）（下）

2.3 16S rDNA序列分析 將菌株NWMCC0302提取的總DNA進行特異性PCR擴增，擴增后產物大小約為1500 bp。利用NCBI中Nucleotide BLAST功能對測序的16S rDNA序列（1371 bp）進行同源性比對，結果顯示與Bacillus pumilusstrain ATCC 7061相似性為99.93%，與Bacillus pumilusstrain NBRC 12092相似性為99.93%，結合該菌株的形態學特征及生理生化特性鑒定為短小芽胞。利用MEGA 7.0軟件對數據進行多重比對分析并構建以16S rDNA基因序列為基礎的Neighbor-Joining分子系統發育樹（圖3）。將菌株測序所得的16S rDNA序列提交至GenBank，準入編號為OL636364， 并 命 名 為Bacillus pumilusstrain NWMCC0302。

圖3 以16S rDNA序列構建的Neighbor-Joining分子進化樹

2.4 降解血液效果試驗結果分析

2.4.1 碳源、無機鹽對降解血液效果分析 如表4所示，在培養基中添加10 g/L濃度的不同碳源，得到以麥麩為碳源時的降解率最大（30.44%），其次是小麥淀粉和玉米淀粉的降解率分別為24.22%和24.37%，因此則選擇麥麩作為降解血液菌株的最佳碳源。根據不同的碳氮比對麥麩進行濃度篩選，隨著濃度的增大，降解效果先升高后下降，且當麥麩濃度為20 g/L時降解率最大，為22.47%。綜合考量麥麩的經濟價值，后續試驗中選擇麥麩為主要碳源。

表4 不同培養條件下的牛血液降解結果

無機鹽對血液降解的影響結果如表4所示，不同的無機鹽對血液降解效果的影響有所不同，以NH4Cl為無機鹽時降解效果最好，為26.46%，添加麥麩空白對照的降解效果為25.75%，以Zn-Cl2為無機鹽時降解效果最差，為8.06%。根據試驗分析，在一定濃度下，NH4+離子能夠提高蛋白酶的活性，Zn2+離子對該菌株所產的蛋白酶具有一定的抑制作用。由于本試驗中加入的NH4+離子中含有氮元素，對于測定血液降解率有一定的影響，基于后續工業化經濟性以及考慮到牛血液中本身含有一定的無機鹽離子，因此后續選擇不添加無機鹽進行試驗優化。

2.4.2 降解血液發酵條件各單因素優化分析

2.4.2.1 發酵時間 發酵時間對血液降解的影響結果如圖4A所示，隨著發酵時間的增加，降解效果從12 h至96 h一直處于上升趨勢，96 h時達到最大降解效果，最大降解率為21.61%，進而增加發酵時間，降解效果下降。因此，重復試驗后選擇96 h為最佳發酵時間。

2.4.2.2 接種量 結果如圖4B所示，當菌株接種量為2%時，有最大降解效果且最大降解率為13.07%。隨著菌液濃度的增加，菌株NWMCC0302對牛血液的降解效果明顯下降，故根據試驗結果分析最佳降解牛血液菌株接種量選擇2%。

2.4.2.3 溫度 不同溫度對血液降解的結果如圖4C所示，隨著降解溫度的升高，降解率也隨之增大，在降解溫度為37℃時，此時有最大降解率為20.02%。當溫度到達45℃時，菌株對血液的降解效果降低至7.95%。因此，該菌株最適降解牛血液溫度為37℃。

2.4.2.4 初始pH發酵的初始pH對血液降解的結果如圖4D所示，當pH為7時，有最大降解效果且最大降解率為39.73%，隨著初始pH的繼續增加，降解效果逐漸降低。

2.4.2.5 牛血液體積濃度 結合各發酵條件，對不同添加牛血液體積濃度進行了探究，如圖4E所示，隨著培養基中牛血液體積濃度的增加，降解效果先增加后下降。當牛血液體積濃度為10%時，有最大降解效果（降解率為19.67%）。隨著牛血液體積濃度繼續增加，降解效果逐步下降。因此，多因素試驗設計采用10%牛血液對降解效果進行探究。

圖4 降解時間（A）、菌株接種量（B）、降解溫度（C）、初始pH（D）、牛血液體積濃度（E）對降解牛血液效果的影響

2.4.3 Plackett-Burman試驗結果分析 利用Plackett-Burman試驗設計對各最優單因素條件進行優化，采用軟件Minitab 17對試驗數據進行多元回歸分析（表5），得到以血液降解效果為響應值的最優方程：Y=34.41-1.72X1+3.82X2-2.59X3+2.74X4-2.91X5+0.12X6。根據表6中方差分析結果表明，該模型顯著（P=0.027<0.05），根據方差分析顯著性大小可知影響降解血液效果的因素依次為：X2（接種量）>X5（初始pH）>X4（降解溫度）>X3（麥麩濃度），而X1（降解時間）和X6（牛血液體積濃度）對降解血液效果不顯著。因此，篩選出菌株接種量（P=0.012<0.05）、初始pH（P=0.033<0.05）、降解溫度（P=0.041<0.05）以及麥麩濃度（P=0.049<0.05）這四個關鍵因素并結合單因素試驗結果進一步做Box-Behnken試驗設計和分析。

表5 Plackett-Burman試驗設計及響應結果分析

表6 Plackett-Burman試驗設計各影響因素方差分析

2.4.4 響應面Box-Behnken試驗設計結果分析結合Plackett-Burman試驗設計結果分析，采用軟件Design-Expert.V8.0.6對試驗數據進行多元回歸擬合分析，各因素間交互作用的3D響應曲面如圖5所示，并獲得二元多次回歸方程：Y1=48.87+2.25A+8.75B+2.09C+4.54D-0.73AB-0.19AC-1.32AD+1.11BC+2.19BD-0.06CD-5.96A2-6.40B2-2.63C2-11.57D2，Y1是降解效果，A是菌株接種量，B是初始pH，C是降解溫度，D是麥麩濃度。

圖5 各影響因素交互作用的響應曲面圖

進一步對回歸模型做方差分析，由表7所示，該回歸模型極顯著（P=0.0001<0.01），失擬項不顯著（P=0.5618>0.05），模型相關系數R2=0.9461，校正相關系數R2Adj=0.8922，說明該模型擬合度良好，試驗實際值與預測值具有高度的相關性，可用于預測該菌株對血液降解效果。試驗模型中的一次項B（P=0.0001<0.01）、D（P=0.0002<0.01）與二次項A2（P=0.0002<0.01）、B2（P=0.0001<0.01）、D2（P=0.0001<0.01）對降解血液效果影響達到極顯著水平，而一次項A（P=0.0249<0.05）、C（P=0.0348<0.05）與二次項C2（P=0.0489<0.05）則為顯著水平，其他相關系數對降解血液效果影響不顯著。

表7 Box-Behnken試驗設計及響應結果分析

根據擬合模型優化分析，通過Design-Expert.V8.0.6軟件預測該菌株對血液降解參數的最優條件為A=0.1、B=0.76、C=0.56、D=0.26，換算成實際理論值為菌株添加量2.05%、初始pH 7.39、降解溫度38.11℃、麥麩濃度2.131%，預測的最高降解率為53.53%。根據得到的最佳條件，對該模型進行準確性驗證，用優化后的降解條件對牛血液進行7次降解試驗，測得牛血液降解率和總氮含量 分 別 為51.18%（696.27 mg/100 mL）、52.75%（688.69 mg/100 mL）、53.54%（672.84 mg/100 mL）、55.11%（651.89 mg/100 mL）、57.47%（646.55 mg/100 mL）、56.69%（646.19 mg/100 mL）、50.08%（698.38 mg/100 mL），對牛血液的平均降解率為53.83%，與預測結果基本一致，表明該優化模型能夠較好的預測血液發酵結果。

3 討論

目前對于屠宰廢棄血液的生物降解較多采用蛋白酶水解法，蛋白酶能夠有效地將血液蛋白水解，水解后的產物中含有小分子肽和游離氨基酸等物質，可用于動物飼料和有機肥制備，從而增加它們的使用價值。江霞等（2012）采用風味蛋白酶和胰蛋白酶對豬血蛋白進行水解試驗，當降解溫度為50.88℃、初始pH為8.15、復合酶配比為0.96：1、底物濃度為6%和降解時間為6 h時，水解率達到43.13%。劉成梅等（2010）結合中性蛋白酶和風味蛋白酶同步水解鴨血蛋白，當初始pH為7.1、降解溫度為50.5℃、酶解時間為4.8 h時，對鴨血的水解率為25.75%。Raúl Pérez-Gálvez等（2011）利用堿性蛋白酶對豬血紅蛋白進行酶解優化，當發酵pH為7.5、降解溫度為59.8℃、酶與底物比例為10%時，有最大水解度為30.29%。由于血紅蛋白和血纖維蛋白的空間結構復雜，蛋白酶水解過程單一，酶效應有限，因此未能獲得對血液蛋白的完全水解。

許多微生物菌株在發酵過程中產生胞外蛋白酶能夠將大分子蛋白質分解成小分子多肽和氨基酸類水解物。例如，Zheng等（2014）通過對枯草芽孢桿菌進行紫外線誘變產生中性蛋白酶，在最佳條件溫度33.8℃，降解時間69.36 h，pH 7.0，接種菌液含量7.2×107cfu/mL，250 r/min下對血紅蛋白降解率為62.05%。Zhang等（2014）采用基因工程的方法將米曲霉蛋白酶基因重組到畢赤酵母菌中，通過對3.15%底物濃度血液進行降解試驗，降解率達到49.05%。Asha等（2018）利用亞硝酸和紫外線對蠟樣芽孢桿菌進行誘變處理后降解血紅蛋白，當血紅蛋白濃度為1.05%時，降解率為53.29%。李曉宇等（2021）利用枯草芽孢桿菌、短小芽胞和貝萊斯芽孢桿菌制備成復合菌劑，對屠宰牛廢棄物進行堆肥試驗，降解率達到95%以上。這些菌株大多數可以在有氧或無氧條件下產生分解血液蛋白的酶類，而這些蛋白酶在降解過程中對原料的要求較低，能全面保留血液水解后的氨基酸種類，并且可供植物吸收的左旋氨基酸也能得到保護，同時水解液中寡肽含量較高及有害物質較少 （Zhang等，2019；Wang等，2017）。

表8 Box-Behnken試驗回歸模型方差分析

微生物菌株對血液蛋白的降解機制比蛋白酶水解過程更為復雜，前者不僅存在其產生蛋白酶分解血液蛋白底物，同時還存在菌株生長繁殖需要利用血液蛋白底物作為氮源，從上述的研究數據來看，菌株的發酵降解率高于蛋白酶水解率。本試驗篩選出的短小芽胞利用10%底物對牛全血液進行降解試驗研究，優化其降解條件后的降解率為53.83%，較上述研究報道中的畢赤酵母菌和蠟樣芽孢桿菌降解率要高，但是對于血液的降解處理還是沒有完全利用。不同菌株對血液蛋白的降解能力是由菌株自身蛋白酶產生的數量及酶活性所決定，但血液降解除了受到所產蛋白酶影響外，還受到菌株自身的利用及血液蛋白濃度的影響。血液蛋白濃度對于整個分解體系來說，菌株對血液蛋白的利用機制比較復雜，菌株的生長會受到培養條件的影響，當血液添加量較少或較多時，則不能為菌體的生長提供適宜的繁殖條件，對于蛋白酶產生的數量也會受到一定的影響。但菌株在整個復雜的降解過程中，除了自身的生長之外，產生蛋白酶的數量，蛋白酶分解及菌株利用血液蛋白的多少，都需要進一步的研究。畜禽血液中的血紅蛋白和纖維蛋白空間結構復雜，血液的理化因素復雜，導致蛋白酶無法完全水解，菌株無法完全分解利用，而現有菌株對血液蛋白的利用能力有限，因此如何將畜禽血液蛋白更全面徹底地降解以及對降解產物的開發有待進一步探究。就目前存在的問題可以采用以下幾種途徑：第一，探明蛋白酶水解和菌株降解的機制，優化菌株配方制備成復合菌劑來提高菌株利用血液的能力；第二，利用突變育種或基因工程育種方法對菌株進行優化，以增加菌株蛋白酶的產量，從而提升對血液的水解能力；第三，采用發酵補料或血液前處理的方式對血液進行降解；第四，采用菌-酶協同作用的方法實現對畜禽血液蛋白的充分降解和再利用。本試驗中篩選出的短小芽胞對牛血液具有較高的降解能力，對動植物具有抗菌、抗病毒和改善農作物品質等益生作用（向軍等，2021），可以作為微生物法降解牛血液的候選菌株，降解后的產物可制備成含氨基酸水溶肥料，從而實現對牛血液廢棄物進行降解處理，既能有效解決對環境帶來的污染問題，又能全面利用血液資源，提高廢棄蛋白附加值，具有重要的現實意義。

4 結論

本研究利用酪素瓊脂平板和哥倫比亞血瓊脂平板從屠宰場血液污泥中分離得到一株高效降解牛血液的菌株NWMCC0302，根據形態學特征、生理生化特性和16S rDNA測序分析，鑒定為短小芽胞。利用該菌株對牛血液進行降解試驗研究，以20 mL牛原血液作為氮源，得到影響降解牛血液關鍵影響因素為初始pH、麥麩濃度、接種量和降解溫度。優化后的最佳降解參數為初始pH 7.39、麥麩濃度21.31 g/L、菌株接種量2.05%（V/V）、降解溫度38.11℃、降解時間96 h、血液體積濃度10%（V/V），在該條件進行驗證試驗得到對牛血液的降解率為53.83%。