一株固態發酵豆粕的枯草芽孢桿菌的分離與應用

陳倩倩， 葛慈斌，劉 波， 王階平， 劉國紅， 車建美， 李慧敏， 劉 欣

（福建省農業科學院農業生物資源研究所，福建福州 350002）

豆粕是大豆加工后的副產物，是畜禽飼料中重要的蛋白質原料，但豆粕中的粗纖維難以消化吸收，會增加畜禽腸道負擔，降低營養轉化率。微生物能夠轉化利用飼料中不易分解的大分子物質，促進飼料中的物質轉化，提高飼料營養物質的吸收利用率（Bi等，2015；Kim等，2010）。同時，微生物可產生多種胞外酶，促進飼料中纖維素等難利用物質的轉化（Zhang等，2018；Alnahdi等，2012）。研究表明，在飼糧中添加纖維素酶制劑能有效地將纖維素轉化為糖類物質，提高飼料的吸收率（張煜等，2018；Meinlschmidt等，2016）。因此，篩選獲得高產纖維素酶的菌種，應用于豆粕發酵中，可將飼料中難消化的粗纖維細化，提高發酵飼料的營養價值。

細菌、真菌和放線菌都能夠合成纖維素酶，細菌由于環境適應能力強、底物范圍廣，且易培養、生長周期短的特性，而被廣泛應用。芽孢桿菌和乳酸菌是發酵飼料生產中常用的菌株。其中，芽孢桿菌能夠產生具有抗逆性的芽孢，對高溫、干燥和鹽堿等都有很強的抗性，能適應發酵環境，具有廣闊的應用前景（Chi等，2016）。此外，芽孢桿菌能夠產生抗菌物質抑制病原微生物，有效避免飼料污染，減少抗生素在飼料中的應用（陳倩倩等，2020；邱博書等，2019）。已有研究表明，添加芽孢桿菌發酵飼料可降低斷奶仔豬腹瀉的發生率，維持腸道菌群平衡（Gao等，2020；Seo等，2016）。

本文針對畜禽飼料中纖維素難以降解，分解轉化率低的問題，旨在篩選耐受發酵高溫的芽孢桿菌，并研究其產酶特性，以期利用菌株產酶解決豆粕纖維素難以降解的問題，利用其抑菌特性解決豆粕發酵的雜菌污染問題，提高發酵飼料的營養價值和安全性，促進發酵飼料的發展與應用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗菌株：芽孢桿菌和青霉菌為本實驗室分離保藏菌株。

酶活試劑：3，5-二硝基水楊酸（3，5-DNS）顯色液、檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.5）、1%羥甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液、標準葡萄糖溶液（1.00 mg/mL）、碘化鉀混合液（1 mg/mL）。

培養基：Luria-Bertani（LB）培養基：酵母提取物10.0 g，NaC1 5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，水1000 mL，pH 7.2~7.4。LB-CMC培養基：羧甲基纖維素鈉1%+LB培養基。 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：土豆200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL，pH 7.2~7.4。固體培養基按15~20 g/L的比例添加瓊脂。

PCR試劑：10×Buffer、dNTP（10 mM/each）、Taq酶（2.5 U/μL），上海博尚生工生物工程技術服務有限公司；ITS、16S rDNA引物和100 bp Marker，上海英駿生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 耐高溫產纖維素酶芽孢桿菌篩選 菌株分離自福建莆田江口鎮葡萄園葡萄根系土壤。取葡萄根系土壤10 g，加入90 mL無菌水，振蕩混勻。80℃水浴10 min后，進行梯度稀釋后涂布于細菌培養基平板上，于55℃下培養2~3 d，獲得純培養芽孢桿菌菌株，命名為FJAT-5561。根據API50CH碳水化合物鑒定試劑條說明書進行菌株生理生化鑒定。同時，采用Tris-飽和酚法提取菌株FJAT-5561基因組DNA，并利用16S rRNA序列通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增（Rainey等，2010）。PCR產物送至上海鉑尚生物技術有限公司測序。通過對測序獲得的基因序列的比對與分析，確定芽孢桿菌FJAT-5561分類地位（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon/）。

將芽孢桿菌FJAT-5561接種于LB固態培養基中，30℃活化培養24 h，再接種至LB-CMC固體培養基，55℃培養48 h。采用剛果紅染色法檢測菌株是否產纖維素酶，測定水解透明圈直徑（H）和菌落直徑（D）大小，根據H/D比值初步判定高溫環境下菌株產纖維素酶的能力。

將活化后的芽孢桿菌按2%的接種量轉移至LB-CMC液體培養基，進行復篩。55℃、170 r/min培養48 h后，取發酵液6000 r/min離心10 min，上清即為粗酶液。采用3，5-二硝基水楊酸顯色法測定其活性：向20 mL試管中加入3 mL CMC-Na溶液（50℃水浴下孵育3 min），然后加入1.0 mL稀釋后的粗酶液，50℃水浴反應30 min。沸水浴10 min使纖維素酶失活，然后加入3 mL DNS沸水浴10 min進行顯色，在540 nm波長下測定吸光值。空白組采用煮沸失活的粗酶液為對照。在上述試驗條件下，每分鐘每毫升水解淀粉釋放1 μmol葡萄糖所需酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.2.2 纖維素酶酶學特性研究

1.2.2.1 pH對芽孢桿菌纖維素酶活性的影響按2%的接種量將芽孢桿菌接種至不同pH（4.0~9.0）的發酵培養基，發酵培養48 h。以各個發酵培養基滅活的粗酶液作為對照。

1.2.2.2 溫度對芽孢桿菌纖維素酶活性的影響將芽孢桿菌于25~65℃（梯度10℃）下培養48 h，測定酶活力。以各溫度發酵培養基滅活的粗酶液纖維素酶活性作為對照。

1.2.3 產酶芽孢桿菌抑菌活性分析 芽孢桿菌接種于100 mL LB培養液中培養2 d，0.22 μm濾膜過濾，獲得菌株發酵上清液。將青霉FJAT-110在PDA培養基上30℃培養5 d，取孢子制備106cfu/mL的孢懸液。制備PDA雙層板，下層為固體PDA培養基，上層為半固體PDA培養基（瓊脂含量減半）。在平板中間打孔，注入芽孢桿菌發酵上清液100 μL，以無菌水為陰性對照，0.1 mg/mL潮霉素為陽性對照，觀察抑菌圈（邱博書等，2019）。同時，將發酵上清液稀釋1、2、4、8、16倍，觀察不同濃度的上清液對青霉的抑制效果。取抑菌圈附近的菌塊，電鏡觀察芽孢桿菌對青霉菌絲生長及結構形態的影響。

抑菌率/%=（菌落直徑-打孔直徑）/（對照直徑-打孔直徑）×100。

1.2.4 芽孢桿菌發酵豆粕試驗 豆粕發酵基礎培養基：2250 g豆粕中添加250 g麩皮，按10%的接種量（V/V）加入活化后的菌液，調整含水量至50%。35℃發酵7 d，完成發酵。于發酵起始（0 d）和發酵結束（7 d）取樣，分別進行理化性質和微生物鑒定。

理化性質檢測：飼料中的黃曲霉素和玉米赤霉烯酮采用標準NY/T 2071-2011要求檢測，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和赭曲霉毒素按照GB/T 30956-2014要求檢測。同時，檢測發酵豆粕中的粗纖維（GB/T6434-2006）、粗蛋白質（GB/T6432-2018）、脂肪（GB/T6433-2006）和含水量等理化指標。

微生物分離鑒定：對樣品進行梯度稀釋后，涂布于固體LB/PDA培養基，分離發酵后豆粕中霉菌和芽孢桿菌，分別進行ITS、16S rDNA鑒定。霉菌采用百泰克公司的離心柱型試劑盒進行DNA提取，采用特異引物ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'） 和ITS5（5'-GGAAGTAAAAAGTCGTAACAAGG-3'）進 行PCR擴 增（劉少軍等，2019）。芽孢桿菌的16S rDNA鑒定按照1.2.1耐高溫產纖維素酶芽孢桿菌篩選中所描述的方法進行。

2 結果與分析

2.1 產纖維素酶芽孢桿菌篩選FJAT-5561可以與葡萄糖、果糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、熊果甙、七葉靈、柳醇、纖維二糖、麥芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、菊糖、棉子糖、淀粉、肝糖等發生反應，FJAT-5561的生理生化鑒定結果為Bacillus subtilis，鑒定分數為99.6%（表1）。

表1 菌株FJAT-5561的生理生化結果

經測序獲得1050 bp的16S rDNA序列。根據16S rDNA基因序列比對分析（圖1），確定分離自福建莆田江口鎮葡萄園葡萄根系土壤的FJAT-5561為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。初篩結果顯示枯草芽孢桿菌在55℃條件下能降解CMC-Na，產生透明圈，其H/D為3.6（圖2）。復篩結果顯示枯草芽孢桿菌FJAT-5561發酵上清液能夠降解CMC-Na釋放葡萄糖，纖維素酶活性為0.60 U/mL。枯草芽孢桿菌是廣泛應用于飼料行業的益生菌，能夠分泌多種胞外酶，促進原材料中的纖維素降解為淀粉和葡萄糖，提高飼料的吸收率（王格等，2018）。

圖1 FJAT-5561菌株的系統進化樹

圖2 FJAT-5561在LB-CMC培養基上產生的透明圈

2.2 纖維素酶酶學特性研究 將枯草芽孢桿菌FJAT-5561在55℃下發酵培養，觀察其在不同pH培養基中的酶活性。結果顯示FJAT-5561在pH為8，酶活最高達0.75 U/mL（圖3）。進一步研究不同溫度下的酶活性。檢測結果顯示，在25~45℃，枯草芽孢桿菌FJAT-5561發酵上清液的酶活性呈上升趨勢，即在45℃，其發酵上清液酶活性最高，達0.90 U/mL。通過調整培養溫度和酸堿度，初步獲得枯草芽孢桿菌FJAT-5561最佳產酶溫度和pH。枯草芽孢桿菌FJAT-5561在45℃、pH為8時的酶活性達0.90 U/mL，較起始狀態提高了50%，提升了產酶效果。

圖3 枯草芽孢桿菌FJAT-5561在不同pH（a）和溫度（b）下纖維素酶活性變化

2.3 產酶芽孢桿菌抑菌活性分析 枯草芽孢桿菌FJAT-5561的抑菌試驗結果顯示，其對青霉菌具有抑制效果，抑菌率為84.2%。FJAT-5561上清液稀釋8倍后依然具有抑菌效果（圖4）。掃描電鏡觀察結果同樣證明，FJAT-5561對青霉具有良好的抑制效果。與清水對照相比，FJAT-5561發酵上清液使青霉菌絲變形和萎縮，抑制菌絲生長，從而達到抑制效果（圖5）。青霉是引發飼料霉變的主要真菌，產生的真菌毒素危害畜禽健康（劉少軍等，2019；李曉雪等2018）。芽孢桿菌對多種真菌具有抑制效果，具有抑菌譜廣，耐受性強的優點（滿麗莉等，2019；Parrado等，2014）。篩選具有抗菌活性的芽孢桿菌，進行豆粕發酵，能夠抑制環境中的青真菌污染飼料，進而保證發酵飼料的生物安全。產纖維素酶芽孢桿菌FJAT-5561兼具高產酶、抗病青霉菌、耐高溫和酸堿的能力，適用于發酵飼料的研發。2.4發酵豆粕理化性質分析 添加枯草芽孢桿菌FJAT-5561發酵豆粕，發酵后物料中的粗纖維含量為4.2%（干重），低于對照組的4.6%。芽孢桿菌產生的胞外酶能夠降解飼料中的粗纖維，促進轉化吸收（Zhao等，2015）。此外，芽孢桿菌的胞外酶能夠破壞豆粕表面的纖維結構，增大接觸面積，促進蛋白質、脂肪等營養物質的降解（Wang等，2012）。在菜籽粕發酵過程中，觀測其中的蛋白質、纖維素與多糖等大分子的降解過程，其中纖維素是最先降解的物質，其次是多糖、蛋白質（Hamidoghli等，2020）。因此，纖維素酶除了能夠降解纖維素，同時還可以釋放豆粕顆粒內部的大分子物質，促進蛋白質與多糖的分解利用，提高豆粕轉化效率。

圖4 枯草芽孢桿菌FJAT-5561對青霉抑制作用

圖5 枯草芽孢桿菌FJAT-5561對青霉抑制作用的電鏡觀察（a：清水；b：B.subtilis FJAT-5561）

添加枯草芽孢桿菌發酵可以提高發酵豆粕粗 蛋 白 質 含 量 （Medeiros等，2018；Shiu等，2015）。添加枯草芽孢桿菌FJAT-5561發酵豆粕，發酵7 d后豆粕中的粗蛋白含量為52.7%，對照組為48.5%，比對照組對高了4.2個百分點。同樣地，研究發現添加枯草芽孢桿菌E20發酵72 h后，豆粕中的蛋白質升高了19%，達50.2%（Pleadin等，2019）。豆粕發酵過程中，微生物的增殖導致碳水化合物的大量消耗，其消耗速度遠高于蛋白質的消耗，進而提高了粗蛋白質的相對含量。總之，相比較未添加菌劑的對照組，添加枯草芽孢桿菌FJAT-5561進行發酵降低了豆粕中難以利用的粗纖維含量，提升了豆粕中的粗蛋白質含量。

2.5 發酵豆粕微生物分離鑒定 真菌毒素是由曲霉菌屬和鐮刀菌屬各種真菌產生的次生代謝產物，污染飼料，對人類和動物健康造成嚴重危害。由于真菌在自然界中分布廣泛，農產品、食品和飼料中都存在真菌毒素的隱患（Chesson等，2008）。本試驗結果表明，添加和未添加枯草芽孢桿菌FJAT-5561發酵，豆粕中均未檢出黃曲霉素、赭曲霉毒、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鑲刀菌烯醇等真菌毒素。然而，添加枯草芽孢桿菌發酵7 d后未檢出黃曲霉，而未添加菌劑的發酵飼料中檢測到了黃曲霉（表3）。黃曲霉的存在具有潛在安全隱患。添加芽孢桿菌，有利于微生物相關生態位的搶占，進而通過菌群競爭抑制真菌的生長（Sanjukta等，2021）。此外，枯草芽孢桿菌的胞外產物對真菌具有抑制效果，能夠預防飼料真菌污染。

表3 發酵豆粕真菌毒素與黃曲霉檢測

豆粕中芽孢桿菌的分離鑒定結果顯示，添加枯草芽孢桿菌FJAT-5561發酵后的豆粕中，分離到枯草芽孢桿菌、索諾拉沙漠芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌三類芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌是優勢菌；未添加菌劑的發酵豆粕中的芽孢桿菌包含貝萊斯芽孢桿菌、索諾拉沙漠芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌廣泛存在于環境中，是芽孢桿菌中應用較為廣泛的菌種。枯草芽孢桿菌應用于豆粕發酵，能夠提高豆粕中的蛋白質含量，更利于腸道吸收率（Pleadin等，2019；Zhang等，2018）。地衣芽孢桿菌能夠清除自由基，提高抗氧化能力（Parrado等，2014）。貝萊斯芽孢桿菌能夠產生淀粉酶和纖維素酶，在飼料中也有廣泛的應用（鐘麗娟等，2021）。索諾拉沙漠芽孢桿菌廣泛存在于發酵食品，如曬醋、飼糧中，提高食品品質（楊新等，2018）。添加枯草芽孢桿菌發酵，加入的芽孢桿菌優先占據相應的生態位，具有生長優勢（Chesson等，2008）。因此，抑制具有相同生態位芽孢桿菌的生長，推測這是導致添加菌劑組芽孢桿菌種類少的原因。而隨著發酵進行，發酵豆粕中的微環境改變，進而其他芽孢桿菌進入增殖狀態，導致地衣芽孢桿菌成為優勢菌。

3 結論

本文篩選獲得的耐高溫芽孢桿菌，能夠抵御飼料發酵產生的高溫，產生纖維素酶，促進豆粕中纖維素的降解。耐高溫枯草芽孢桿菌FJAT-5561在45℃、pH為8的條件下，其發酵上清液的纖維素酶活性為0.90 U/mL。并且枯草芽孢桿菌FJAT-5561的對青霉具有抑制效果。豆粕發酵試驗中，添加FJAT-5561發酵豆粕，發酵后物料中的粗纖維含量（4.2%）低于對照組（4.6%），粗蛋白質含量比對照組高4.2個百分點。發酵后的豆粕中未檢出真菌毒素和黃曲霉。本研究中的枯草芽孢桿菌FJAT-5561在豆粕飼料發酵中具有良好的應用潛力。