復合蛋白源替代魚粉對珍珠龍膽石斑魚幼魚生長性能、體成分和腸道菌群的影響

徐世微，Vivian Hlordzi，2， 鄒 岷， 植心妍， 崔志英， 遲淑艷，2*

（1.廣東海洋大學水產學院，廣東湛江 524088；2.廣東省水產動物精準營養與高效飼料工程技術研究中心，廣東湛江 524088；3.茂名希普生物科技股份有限公司，廣東茂名 525000）

魚粉富含魚類生長所需的蛋白質、脂質、必需氨基酸、必需脂肪酸、維生素以及無機鹽等營養成分，具有高消化性和適口性（Zhou等，2005；Zhou等，2004）。然而，隨著養殖業和飼料工業的蓬勃發展，魚粉的需求量上升。面臨有限的魚粉資源，同時兼顧不與人爭糧，不與糧爭地的愿景，開發利用非糧型飼料資源如大宗農產品加工副產物、餐飲殘渣剩余物和動物源加工副產物、水產品加工副產品或者廢棄物等已成為研究熱點（阮征等，2015）。

水解魚蛋白粉（Hydrolyzed fish protein powder）是主要以冰鮮魚或其加工副產品為原料，在一定條件下進行水解后獲得的一種含游離氨基酸和不同肽鏈長度小肽的蛋白質產品（王新星等，2011），其中小肽分子質量主要分布在1000 Da以下，低分子量組分是保證肉食性魚類正常生長必不可少的成分（Kousoulaki等，2009），有研究表明，飼料中用適當含量的水解魚蛋白替代魚粉對大菱鲆（Scophthalmus maximusL.）（李本相等，2019；衛育良，2014）和大西洋鮭（Atlantic salmon）（Kousoulaki等，2012；Refstie等，2004）的生長性能不會產生負面影響。作為非糧植物蛋白源的棉籽蛋白，是將棉籽粕通過加工、生物降解或遺傳改良的方式（Alam等，2018；Pelitire等，2014；Zhang等，2007）消減或鈍化棉籽中的游離棉酚（申建飛等，2019），成為水產飼料優質蛋白質來源之一。不同種類的魚對棉籽蛋白的耐受程度不同，已有研究表明添加3%~30%棉籽蛋白替代魚粉對珍珠龍膽石斑魚（He等，2021；殷彬，2019）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）（嚴全根等，2014）、羅非魚（Oreochromis niloticus）（林仕梅等，2011）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）（Luo等，2006）和卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）（申建飛等，2019）幼魚的生長性能不會產生負面影響。

棉籽蛋白是可替代部分魚粉的優質植物蛋白源（嚴全根等；2014），但所含賴氨酸等必需氨基酸含量遠低于魚粉（Li等，2006），替代大部分魚粉后會造成生長速度下降、飼料效率降低等（Krogdahl等，2003；Carter等，2000）問題，因此棉籽蛋白在使用量上存在瓶頸。與單一蛋白源替代魚粉相比，復合蛋白源具有營養成分互補和氨基酸平衡等優點，已有研究表明用復合蛋白源替代一定比例的魚粉對大菱鲆（郝甜甜等，2019）和大口黑鱸（Micropterus salmoides）（朱旺明等，2019）的生長性能和魚粉對照組相比沒有產生顯著影響。石斑魚是我國四大海水養殖魚類之一，具有重要的經濟價值，因其為肉食性魚類，對魚粉的依賴性較大，因此本試驗以珍珠龍膽石斑魚幼魚（Epinephelus lanceolatu♂×E.fuscoguttatus♀）為研究對象，綜合考慮氨基酸平衡和適口性等因素，以適量棉籽蛋白與水解魚蛋白粉進行復合，探討在降低魚粉后石斑魚對該復合蛋白源的使用效果，以此拓展替代蛋白源的使用方式，為石斑魚飼料配制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計 將水解魚蛋白粉和棉籽蛋白（氨基酸組成見表1）按一定比例進行配合后以復合蛋白源形式添加，按照約1.9%的比例遞增替代魚粉，最后一組遞增量加大1倍，使復合蛋白源在飼料中占比分別為4.10%、5.90%、7.77%、9.66%、11.55%、13.44%和17.25%，分別替代魚粉的比例為0.0%（F0）、5.0%（F5）、10.0%（F10）、15.0%（F15）、20.0%（F20）、25.0%（F25）和35.0%（F35），配制7種等氮（粗蛋白質50%）等脂（粗脂肪9%）的試驗飼料（表2）。將原料粉碎后過60目篩，按照配方混合均勻后，加工成粒徑為2 mm和2.5 mm兩種規格的顆粒飼料（F-26（II），華南理工大學實業總公司，廣東），自然狀態下室溫風干24 h，自封袋密封，放置于-20℃冰箱中保存備用。

表1 魚粉、水解魚蛋白粉與棉籽蛋白氨基酸組成%

表2 試驗飼料組成及營養水平 %

1.2 飼養管理 將遺傳背景一致的珍珠龍膽石斑魚暫養在水泥池中（廣東海洋大學海洋生物研究基地，東海島，湛江），投喂商業飼料馴化飼養3周。禁飼24 h，選擇健康無損傷、規格一致的珍珠龍膽石斑幼魚[初始個體體重（31.56±0.04）g]隨機分為7組，分別放養于海洋生物研究基地室內玻璃鋼養殖桶內（300 L），每試驗組設置3個重復，每個重復30尾魚，養殖周期8周。每天定點投喂飼料2次（08：00和16：00），記錄在此期間的飼料消耗量，投喂試驗飼料至石斑魚表觀飽食。試驗期間水體溫度（29±1）℃，溶解氧≥5 mg/L，氨氮含量≤0.03 mg/L，每天換水占玻璃鋼養殖桶水量約70%。

1.3 樣品采集與處理8周的養殖試驗結束，禁飼24 h后稱重，記錄每個重復的存活尾數，分別用于計算各處理組增重率（WGR）、特定生長率（SGR）和存活率（SR）。每個重復取2尾全魚冷凍保存用于體成分分析。用丁香酚（1：10000）將石斑魚麻醉，每個重復取3尾石斑魚稱重、量體長用于計算肥滿度，用75%酒精擦拭石斑魚體表，無菌解剖剪剪開腹部，在無菌條件下剝離其后腸，無菌生理鹽水沖洗后裝入無菌凍存管并放入液氮中，用于腸道菌群分析。

1.4 飼料、魚體概略養分分析 對飼料和魚體樣本進行常規養分分析（AOAC，1995），其中水分的測定采用105℃恒溫烘干失重法測定；粗蛋白質的含量采用半微量凱氏定氮法測定；粗脂肪的含量采用索氏抽提法測定；粗灰分采用550℃灼燒恒重法測定。

1.5 腸道菌群分析 試驗魚腸道樣品中微生物總DNA用MN NucleoSpin 96 Soi DNA試劑盒提取，采用通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'） 和 806R （5'-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3'）擴增細菌16S rRNA基因的V3~V4區。PCR反應體系為20 μL，反應參數：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火20 s，72℃延伸6 s，30個循環；最后在72℃下再延伸7 min。用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳法對擴增產物進行純化和回收，純化后的PCR產物，委托北京百邁客生物科技有限公司，通過Illumina高通量測序平臺（www.biocloud.org）進行生物信息學檢測分析。

將測序的原始數據進行拼接，得到高質量的Tags序列。使用USEARCH（版本10.0）將相似性高于97 %的序列聚類成同一個分類操作單元（OTUs），默認以測序所有序列數的0.005%作為閾值過濾OTUs。根據OTU數據進行標準化處理后，選取前80個物種進行相關分析。

1.6 計算方法 生長指標計算公式：

增重率/%=（末均重-初均重）/初均重×100；特定生長率/（%/d）=（ln末均重-ln初均重）/飼喂天數×100；

飼料系數=攝食飼料干重/（終末體重-初始體重）；

存活率/%=試驗結束時魚尾數/試驗開始時魚尾數×100；

攝食率/（%/d）=攝食量/[（初始體重+終末體重）/2]/天數×100；

肥滿度/（g/cm3）=終末體重（g）/體長（cm）3×100。

1.7 數據分析 采用Excel 2010進行數據整理，利用SPSS 22.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析（one-way ANOVA），顯著水平為P<0.05。當差異顯著時采用Tukey’s多重比較分析差異顯著性，數據采用“平均值±標準誤”表示。

2 結果

2.1 復合蛋白源替代魚粉對珍珠龍膽石斑魚幼魚生長性能的影響 由表3可知，與對照組相比，各飼料處理對珍珠龍膽石斑魚幼魚的增重率、攝食率、特定生長率、飼料系數和存活率無顯著影響（P>0.05），但F20和F35組的魚體肥滿度分別比對照組顯著降低14.46%、15.69%（P<0.05）。

表3 復合蛋白源替代魚粉對珍珠龍膽石斑魚幼魚生長性能的影響

2.2 復合蛋白源替代魚粉對珍珠龍膽石斑魚幼魚魚體成分的影響 由表4可知，各組魚體的水分和粗脂肪含量無顯著變化（P>0.05）。隨著復合蛋白源替代水平的增加，各處理組的粗蛋白質含量開始出現升高的趨勢，F25、F35組的粗蛋白質分別比對照組顯著升高9.58%、10.14%（P<0.05）。此外各組的粗灰分含量分別比對照組顯著增加30.45%、30.25%、86.93%、36.68%、33.97%、22.41%（P<0.05）。

表4 復合蛋白源替代魚粉對珍珠龍膽石斑魚幼魚體成分的影響%

2.3 復合蛋白源替代魚粉對珍珠龍膽石斑魚幼魚腸道菌群的影響 根據生長性能的結果，對F0、F5和F35組的腸道組織進行菌群測序。結果顯示，3個處理組的OTUs數分別為1823、1757和1667，無顯著差異（圖1）。F0、F5和F35組3個處理組共有的OTUs數為1330，特有的OTUs數量分別為107、78和102。F0與F5、F0與F35、F5與F35組 共 有 的OTUs數 量 分 別 為1580、1466和1429。此外，三組之間的Alpha多樣性如ACE、Chao、Shannon和Simpson指數均無顯著性差異（P>0.05，表5）。

圖1 珍珠龍膽石斑魚幼魚飼喂3組不同試驗飼料的腸道菌群OTU韋恩圖

在門水平，F0組石斑魚腸道菌群的優勢門為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria），分別占腸道菌群比例為24.56%、24.79%、18.33%、8.98%（表6）。然而，三組之間的變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、酸桿菌門（Acidobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、藍藻門（Cyanobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）以及Epsilonbacteraeota的相對豐度均無顯著性差異（P>0.05，表6）。

表6 珍珠龍膽石斑魚幼魚腸道中微生物門水平前10的分布%

在屬水平，石斑魚腸道菌群中優勢菌屬為Muribaculaceae、乳酸菌屬（Lactobacillus）、毛螺旋菌屬（Lachnospiraceae）、Akkermansia和擬桿菌屬，分別占腸道菌群比例為8.44%、3.68%、3.17%、2.74%、2.82%（表7）。其余的菌屬主要為不動桿菌屬（Acinetobacter，2.05%）、大腸桿菌-志賀菌屬（Es-

cherichia-Shigella，1.89%）、Cutibacterium（0.92%）、uncultured_bacterium_c_Subgroup_6（1.48%）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium，0.93%）。除乳酸菌屬和Cutibacterium外，其余8個菌屬的相對豐度在F0、F5和F35組均無顯著差異（P>0.05，表7），其中F35組的乳酸菌屬相對豐度比對照組顯著降低30.47%，F5和F35組的Cutibacterium相對豐度比對照組顯著降低74.05%、77.30%（P<0.05）。

表7 珍珠龍膽石斑魚幼魚腸道中微生物屬水平前10的分布%

3 討論

3.1 復合蛋白源替代魚粉對珍珠龍膽石斑魚幼魚生長性能及體成分的影響 復合蛋白源為水解魚蛋白粉和棉籽蛋白，其中水解魚蛋白粉主要以小分子肽類和游離氨基酸為主，谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和脯氨酸含量較高（Tang等，2015；衛育良，2014；Shamloo等，2012；Chalamaiah等，2010；Liaset等，2003），可以促進幼魚腸道上皮細胞的發育和成熟，提高蛋白質的消化和吸收，從而促進仔稚魚的生長和發育（李文杰，2013；劉峰，2007；Cahu等，2004）。并且，水解魚蛋白小肽分子質量主要分布在1000 Da以下，對大菱鲆（衛育良，2014）、大西洋鮭（Kousoulaki等，2012）、大西洋鱈（Aksnes等，2006）和牙鲆（Paralichthys olivaceus）（Zheng等，2012）的生長均有較好的影響。在本試驗中，采用復合蛋白源替代不同水平的魚粉對石斑魚幼魚存活率沒有顯著影響，這與尼羅羅非魚（Mbahinzireki等，2001）的研究結果一致，表明復合蛋白源替代魚粉后對石斑魚幼魚的健康沒有產生不利影響。有研究表明，用動植物蛋白源替代魚粉造成生長下降是由于適口性低引起的（Kader等，2010），但在本研究中各組的攝食率、增重率和飼料系數均無顯著差異，這可能是因為復合蛋白源中的水解魚蛋白粉含有較多的鮮味氨基酸、小肽、牛磺酸等，改善了飼料的適口性，且分子質量小于1000 Da的小肽占比達78.5%，具有耗能低、轉運速度快、載體不易飽和等優點（Zheng等，2012；Mbahinzireki等，2001；SèVE，1994），使石斑魚幼魚保持較高的攝食率，同時水解魚蛋白份和棉籽蛋白在蛋氨酸和賴氨酸上可較好的互補，對生長也起到了較好的作用。可見，將棉籽蛋白與適宜水平的水解魚蛋白粉進行配伍使用可以替代35%魚粉而不影響石斑魚幼魚的生長性能。

在本試驗中用復合蛋白源替代不同水平的魚粉不會對珍珠龍膽石斑魚幼魚的體成分產生負面影響。在Zheng等（2013）研究中發現，含有高植物蛋白的大菱鲆飼料中分別添加1.2%、3.7%的低分子水解魚蛋白替代魚粉，可提高魚體粗蛋白質含量。在牙鲆飼料中添加不同水平水解魚蛋白替代魚粉也能顯著提高魚體粗蛋白質含量（許團輝等，2012）。在本試驗中，當魚粉替代比例達到20%時，魚體粗蛋白質含量顯著上升。可能是因為復合蛋白源中的水解魚蛋白粉中含有的游離氨基酸、小肽、胺類等化學物質（王佳麗等，2003；王碧蓮等，2001；Takii等，1986），更易于參與蛋白質合成，使魚體氨基酸的吸收速度提高，促進蛋白質的吸收利用，也可能是復合蛋白源中脯氨酸的作用。榮華等（2022）研究表明，飼料中添加脯氨酸可顯著提高淺色黃姑魚的粗蛋白質含量，脯氨酸作為魚類的功能性氨基酸能夠調控膠原蛋白的合成，促進損傷組織的修復，在代謝、營養和蛋白質合成等方面 發 揮 重 要 的 作 用 （榮 華 等，2021；Karna等，2020），因此復合蛋白源中兩種蛋白源均含有較高的脯氨酸，能夠增強配合飼料的營養性能，在一定程度上影響蛋白質的合成。 已有研究表明，復合蛋白源替代魚粉對牙鲆（Deng等，2006）和黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）（羅嘉翔等，2017）灰分含量無顯著影響，但本試驗中，飼料中復合蛋白源替代魚粉能夠顯著增加魚體粗灰分含量。魚體粗灰分含量與礦物質的沉積密切相關（李學麗等，2017），推斷是復合蛋白源中的水解魚蛋白粉含有的小肽在腸道與金屬元素結合生成螯合物，增加了鈣、鐵等金屬離子的可溶性，提高其吸收和轉運速度（Zambonino等，1997），從而使魚體粗灰分含量上升。可見，復合蛋白源可以替代35%魚粉而不影響石斑魚幼魚的體成分。

3.2 復合蛋白源替代魚粉對珍珠龍膽石斑魚幼魚腸道菌群的影響 腸道是與食物直接相互作用的重要功能器官，其中的菌群可參與調節機體消化營養物質、免疫、腸道增殖、抗病和病原體定植等（Nayak，2010），有益菌屬以改善宿主營養吸收能力和免疫調節能力等來促進宿主良好生長（Cahenzli等，2013），而有害菌屬則因改變了腸道黏膜層的通透性，使細菌和其他大分子穿過黏膜屏障（Lee等，2000），良好的腸道微生態系統對魚類健康生長尤為重要。已有研究表明，當飼料中添加水解豬血肽替代10%魚粉后，伴隨腸道中乳酸菌屬的相對豐度增加，改善了珍珠龍膽石斑魚的生長性能（He等，2021）。

在本研究中，飼料中添加復合蛋白源替代魚粉對石斑魚的腸道Alpha多樣性沒有產生顯著影響，變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門為優勢菌群。在濃縮棉籽蛋白、大米發酵蛋白和豬血肽等（He等，2021；He等，2021；Ye等，2020）蛋白源替代魚粉的試驗也觀察到類似的結果。不管飼料組成如何，這些門水平通常構成珍珠龍膽石斑魚的核心腸道菌群（張衛，2020；Ayiku，2020）。變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門代表了各種海洋和淡水物種中高達80%以上的腸道微生物（何嬌嬌等，2018；唐楊等，2017；邢孟欣，2013）。多種魚類的腸道微生物群中細菌分類群的相似性表明，這些細菌參與了重要的宿主腸道功能，如消化、營養吸收和免疫反應等（潘厚軍等，2005）。在本試驗中，各組間優勢菌在門水平的相對豐度沒有顯著差異，這表明復合蛋白源替代魚粉不會對珍珠龍膽石斑魚幼魚腸道菌群組成產生不利影響。

在屬水平上，主要為Muribaculaceae、乳酸菌屬、毛螺旋菌屬、Akkermansia和擬桿菌屬。本試驗中，飼料中添加復合蛋白源替代35%魚粉會顯著降低乳酸菌屬和Cutibacterium的含量，這與大西洋鮭（Hartviksen等，2014）研究結果一致。可能與復合蛋白源中的棉籽蛋白有關，棉籽蛋白所含的甲硫氨酸即蛋氨酸，能夠改善大菱鲆（Gao等，2019）和石斑魚（Li等，2020）的腸道發育和提高腸道吸收效率，在飼料中添加適量的蛋氨酸能夠改善草魚（Su等，2018）腸道免疫功能。乳酸菌屬是水生動物的有益菌，可以通過分泌乳酸等有機酸降低pH來抑制革蘭氏致病菌擴散，對增強腸道免疫力、改善腸道結構、提高抗病力等具有重要意義（章文明等，2012）。Cutibacterium曾被稱為痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes）（UNNA，1896），與痤瘡引起的毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性疾病發生密切相關（Platsidaki等，2018）。可見，飼料中用復合蛋白源替代到35%魚粉時，其主要優勢屬并沒有發現顯著改變，雖然潛在益生菌乳酸菌屬的豐度降低，但同時也顯著抑制了可能致病菌Cutibacterium。

4 結論

在本試驗的條件下，飼料中復合蛋白源替代35%魚粉不會對珍珠龍膽石斑魚幼魚的生長性能和體成分產生顯著的負面影響，且沒有顯著改變石斑魚腸道菌群的優勢門和優勢屬的相對豐度，但復合蛋白源對石斑魚腸道微生物組成和結構的影響還需要進一步分析。這一研究結果拓寬了石斑魚蛋白源的選擇和配伍，為優化其配方提供重要數據支持。