高分辨質譜篩查復合預混合飼料中非法添加藥物

霍寧寧， 李研東， 霍惠玲， 韓 雪*， 苗玉濤

（1.河北科技大學食品與生物學院，河北石家莊 050018；2.河北省獸藥飼料工作總站，河北石家莊 050035）

近些年，由“獸藥殘留”引發的食品安全問題和“耐藥性傳遞”引發的生物安全問題備受關注。政府部門密集出臺多項政策嚴控養殖投入品的規范使用。2019年農業農村部第194號公告的（中華人民共和國農業農村部公告，2019）頒布實施，標志著我國飼料行業正式步入“無抗時代”。在減抗大形勢下，飼料中非法添加獸藥（允許添加的品種除外）的情況仍屢屢發生。針對飼料中非法添加獸用藥物進行監管是新政策出臺后相關政府部門所面臨的新挑戰。

現有的獸藥殘留檢測方法多是針對單一品種的已知目標物進行定量或定性分析，諸如中藥材、動物尿液、獸藥殘留和食品中（王聰等，2021；李岳等，2019；蘇燕，2019；賀美蓮等，2018；潘晨松，2018；孫雷等，2017）未知物篩查的分析報道較多，而針對高通量的、可同時檢測上百種未知物的篩查方法很少，對基質更加復雜的預混合飼料中未知藥物篩查的研究和標準則更少。本文采用超高效液相色譜四極桿靜電場軌道阱質譜進行檢測，建立小分子篩查數據庫，結合TraceFinder篩查軟件分析，旨在通過建立適用于復合預混合飼料中未知藥物的高通量快速篩查方法，為進一步優化完善飼料高通量檢驗方法，拓展更多獸用藥物和非法添加物的篩查途徑提供數據支撐，為政府部門的風險監測提供便捷而準確的技術路徑，更好的為企業諸如原材料質量風險控制、成品監督及相關檢驗需求提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑157種獸藥標準品，First Standard，阿爾塔公司；乙腈（色譜純），默克；蒸餾水，屈臣氏；甲酸，賽默飛世爾科技公司。

1.2儀器與設備UltiMate 3000-Q-Exactive Focus，色譜柱Accucore RP-MS，Thermo公司。

1.3 試樣溶液制備 稱取復合預混合飼料樣品2 g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，準確加入10 mL 50%乙腈水溶液，渦旋混勻3 min，超聲提取30 min。12000 r/min離心10 min；取上清液1 mL，用0.22 μm微孔濾膜過濾后，供質譜分析用。

1.4 液相色譜條件 色譜柱：Accucore RP-MS柱（100 mm×2.1 mm，粒徑2.6 μm）；柱溫：30℃；流動相A：0.05%甲酸水，流動相B：0.05%甲酸乙腈；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序

1.5 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI源），正負離子檢測模式（ESI+、ESI-）同時掃描，掃描方式為一級全掃描/數據依賴型二級質譜掃描（FUll MS/dd-MS2），源區主要參數設置：鞘氣流速為9 arb，噴霧電壓為3 kV，毛細管（離子傳輸管）溫度320℃，S-lens電壓55 kV，輔助氣加熱溫度30℃。質譜一級掃描模式為Full MS模式，掃描范圍（m/z）100~900，一級分辨率70000，進入C-Trap的離子數目1e6，離子最大注入時間100 ms；二級掃描模式模式dd MS2，二級分辨率35000，頂點激發時間3~6 s，設置階梯碰撞能20、35、50 kV，動態排除時間8 s。采集數據前使用正負離子校正液進行質量軸校正。質譜采集數據通過Xcalibur軟件提取化合物碎片離子信息，通過TraceFinder建立篩查數據庫。篩查數據庫信息見表2。

表2 篩查數據庫信息

1.6 篩查結果判定 根據歐盟2002/657/EC準則（EU.Commission Decision，2002），應用高分辨質譜對目標化合物進行分析時，篩查規則中提出，有1個母離子和1個子離子、或2個子離子匹配則確證分析的樣品含有該化合物（侯粲，2016）。對于疑似陽性樣品，進一步在ddMS2模式下對其進行二級特征碎片離子掃描，當有2個或以上豐度較高的碎片離子與標準譜圖中相應的碎片離子精確質量數偏差小于105，且碎片離子的相對豐度比在最大允許偏差范圍內時，確證含有該化合物（侯粲，2016）。

對供試品溶液進行Full MS/ddMS2全掃描，根據建立的標準篩查數據庫中的m/z精確質量數和保留時間對目標化合物進行篩查。當未知物保留時間在±0.5 min且母離子的精確質量數偏差在105、5 ppm范圍內，子離子精確質量數在104、5 ppm范圍內，同位素豐度比在70%范圍內，檢測結果為疑似陽性樣品，否則判定為陰性樣品。

2 結果

2.1 空白樣品和添加陽性樣品篩查結果 在對空白添加樣品進行快速篩查時，藥物濃度50 ng/g時檢出率為98.7%，添加藥物濃度100 ng/g時藥物檢出率為100%，該方法可基本滿足預混合飼料中非法使用獸藥的高通量快速檢測。根據實際樣品檢測結果，空白樣品基質中有部分物質響應低（e3、e4），且出峰時間與添加陽性樣品中的物質不對應，判斷為樣品中基質出峰。應用該方法處理樣品采集數據并進行分析，能夠應用于各種預混合飼料樣品中非法添加未知藥物的篩查工作，其正確率較高。空白樣品部分物質圖譜與添加陽性樣品圖譜見圖1和2。

圖1 空白樣品部分物質色譜圖

2.2 篩查未知物二級結構預測 在全掃描模式下，對HRMS參數進行優化，獲得了高分辨率、高靈敏度的二級結構碎片離子（Suo等，2022）。該數據庫所包含的藥物大部分在ESI+電離模式下的響應值最大，容易獲得H離子并形成[M+H]+；幾種物質在ESI-電離模式下的響應值最大，容易失去H離子并形成[M-H]-。在全掃描dd MS2條件下，毛細管電壓和特征碎片離子參數完全優化，NCE值分別為20、35和50。通過Xcalibur軟件中的分子擬合初步得到碎片離子的精確分子質量和分子式，計算母離子與碎片質量（M/Z）之差，判斷物質脫落的部分結構，從而預測碎片的分子結構。如圖3，選取部分代表性物質分析預測碎片離子結構。母離子質核比220.1443降低60 Da得到160.0869［M+H-60]+碎片離子，且該分子結構易脫落-1-羥基-2-異丙基氨基乙基部分結構，又知該分子式少了-C3H8O，故結構式如圖中所示；根據202.13383［M+H-18]+碎片離子的分子式相較于母體結構少了-H2O，故可推測該碎片離子結構式如圖中所示。母離子質核比256.0880降低100 Da得到156.01141［M+H-100]+碎片離子，該物質磺胺酰基上的氫，可被不同雜環取代，又知分子式少了-C3H4N2S，故判斷該碎片的結構式如圖中所示；108.04484［M+H-148]+碎片離子降低148 Da，結合分子式可知結構為磺胺酰基。同理分析得到8種代表性物質分析預測碎片離子結構見圖3。

圖3 8種代表性物質分析預測碎片離子結構

（續表2）

（續表2）

（續表2）

3 討論

本文結合高分辨質譜的分辨率高、可準確定性、檢測通量高的優勢（李濤等，2017），建立了一種可應用于復雜基質飼料中非法添加物高通量篩查的快速、準確的定性檢驗方法。通過前處理后的樣品進行上機檢測，可快速鎖定待測樣品中非法添加物的種類，進而結合標準品準確的含量信息，對其進行定量，達到飼料中非法添加物的定量信息。

本文選擇基質物質相對復雜的預混合飼料作為空白樣本，旨在測試在復雜基質干擾下本方法的抗基質干擾能力。按照復合預混合飼料標簽內容，該樣品中含多種維生素、微量元素和氨基酸，基質相對配合飼料、濃縮料等產品復雜多樣，對樣品前處理要求更高。本方法在滿足不影響檢驗效率的情況下，盡量簡化前處理程序，以實現快速檢驗的目的，因此該方法可適用于預混合飼料、配合飼料、濃縮料、精料補充料和大多數常規的混合型飼料添加劑。單一飼料、飼料添加劑因其使用范圍的局限性，通常為達到某種目的而使用某些特定品種或特定用途的藥物，沒有進行高通量非法篩查的必要，應作特定種類的藥物定性定量檢測。

對于藥物的檢出限和檢出率，當157種藥物添加濃度為50 ng/g時，檢出155種，檢出率為98.7%；當藥物添加濃度為100 ng/g時，157種藥物全部檢出，檢出率為100%。在飼料中主觀添加非法藥物發揮抗病或治療效果，按照藥物飼料添加劑使用規程和獸醫治療用藥規程，其添加濃度不會低于此濃度；生產過程因不可控因素所帶入的藥物污染低于100 ng/g時，在機體內殘留所產生的影響可以忽略，因此本文所選擇的檢測濃度已滿足實際檢測的需要。

目前，篩查方法基于檢驗的非法添加物篩查數據庫仍在進一步擴充，數據庫藥物種類和數量會陸續增加和完善，前處理方法也會因藥物種類的增加而進一步優化，拓寬基質考察范圍，優化前處理條件，開發兼容性更強、更高通量的前處理方法（郭添榮，2021）是未來發展的方向。某些特殊藥物、特殊基質的樣品會在今后的實驗中進一步開發和增加，提高實驗的靈敏度和精確度也是需要考慮的，以更加充分發揮高分辨質譜的優勢。