藍刺頭藥材總黃酮的高效液相色譜指紋圖譜研究

羅愛勤， 曹穎男， 鐘春燕

（廣州新華學院，廣東廣州 510520）

孔令躍等（2022）報道，藍刺頭是菊科植物藍刺頭（Echinops LatifoliusTausch.）的干燥頭狀花序，蒙藥名為扎日阿-烏拉，又稱為或驢欺口，其藥性苦、稀、輕、柔、鈍、涼。趙軍等（2021）研究表明，藍刺頭具有固骨、接骨、清熱、止痛之功效，可用于骨折、骨熱、刺痛、瘡瘍的臨床治療。李怡筱等（2022）、賴麗金等（2020）和劉巖等（2017）研究表明，藍刺頭治療骨質的主要機制是含有芹菜素、芹菜苷等總黃酮，具有雌激素樣作用，可通過降低血清BGP水平增強卵巢大鼠ERα和ERβ的表達，進而調節骨吸收和骨形成的耦合，促進骨形成，降低骨轉化率，減少骨吸收。

藍刺頭的質量標準收錄在衛生部蒙藥分冊中（國家藥典委員會，1998），僅有性狀鑒別、性味、功能主治、用法用量、貯藏項目，沒有專屬鑒別實驗項和含量測定項目，不能真實反映藥材質量，曹嵐嵐等（2021）、王宇等（2020）、舒合拉·朱馬別克等（2020）、高建萍等（2018）和紅霞等（2010）建立了該藥材的顯微鑒別、理化鑒別、薄層色譜鑒別、藥材中總黃酮的含量測定和芹菜苷的HPLC含量測定等方法，以及藥材的HPLC指紋圖譜。為更詳細分析不同來源藍刺頭藥材所含的總黃酮成分差異，本文在上述基礎上，進一步研究檢測了10批藍刺頭藥材中的總黃酮的指紋圖譜，并參照孫麗君等（2021）的研究采用化學計量學分析法分析隱藏信息，尋找并區分不同來源藍刺頭的總黃酮成分，為藍刺頭指紋圖譜色譜研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器Waters 600E泵、Waters2996 PAD檢測器、717自動進樣器（美國Waters）；Apollo C18柱（200 mm×4.6 mm×5 μm）；Shi-MADZU UV-2550（島津儀器（蘇州）有限公司）；KQ-250DE數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PTHW調壓控溫電熱套（鞏義市予華儀器有限公司）；XA205電子分析天平（0.01~220 g，梅特勒-托利多）。

1.2 材料 芹菜苷對照品（批號B200823，≥98.0%，上海銘博生物科技有限公司）；10批藍刺頭藥材（編號S1~S10）分別采自巴音布拉格嘎查村、烏蘭鄉鎮烏蘭村、武川縣得勝溝鄉大東溝村、涼城縣雙古城村、恩和哈達鎮伊木河村、武川縣西烏不浪鎮什拉圖村、武川縣東土城鄉南土城村、武川縣納令溝村、巴彥布拉格嘎查村、德勒哈達村，經鑒定為菊科植物藍刺頭 （Echinops LatifoliusTausch.的干燥頭狀花序）；甲醇（色譜純）；其他試藥均為分析純；蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備 取藍刺頭藥材，粉碎通過60目篩，精密稱取藥材粉末1 g，加60%乙醇50 mL回流提取2次，每次1 h，合并提取液，濃縮至無乙醇味，加水使稀釋至10 mL，離心（4000 r/min，10 min），取上清液通過裝有10 g AB-8大孔樹脂的玻璃柱，分別取水100 mL和80%乙醇50 mL通過樹脂柱，收集80%乙醇流出液，濃縮蒸干，即得藍刺頭總黃酮，精密稱定藍刺頭總黃酮重量，用甲醇使溶解，并定容至10 mL，搖勻，即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取芹菜苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.3 mg的溶液，搖勻，即得。

2.3 總黃酮含量測定

2.3.1 標準曲線的制備 精密吸取芹菜苷對照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加5%三氯化鋁溶液3 mL，再加60%乙醇至刻度，搖勻，放置30 min，按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0401紫外-可見分光光度法（國家藥典委員會，2020），在275 nm波長處進行吸光度測定，以吸光度為縱坐標，芹菜苷質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸方程為Y=0.0357X-0.0065，r=0.9999。結果表明，芹菜苷質量濃度在3.28~32.8μg/mL與吸光度值呈良好的線性關系。

2.3.2 樣品測定 取藍刺頭藥材 （編號S1~S10），按照2.1項下方法制備藍刺頭總黃酮和供試品溶液，精密吸取各供試品溶液1.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加5%三氯化鋁溶液3 mL，再加60%乙醇至刻度，搖勻后放置30 min。按照2.3.1項下測定條件進行吸光度測定，并計算各編號藍刺頭總黃酮的百分含量（%），結果10批藍刺頭藥材的總黃酮重量和含量分別為：S1 0.0225 g 62.6%，S2 0.0239 g 65.7%，S3 0.0211 g 66.8%，S4 0.0242 g 58.3%，S5 0.0215 g 63.9%，S6 0.0251 g 65.4%，S7 0.0244 g 64.1%，S8 0.0258 g 60.8%，S9 0.0236 g 66.1%，S10 0.0253 g 60.1%，10批藍刺頭總黃酮的百分含量均在50%以上。

2.4 指紋圖譜建立

2.4.1 色譜條件與系統適用性實驗Apollo C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：1%甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0~3 min時100%A→95%A，3~5 min時95%A→92%A，5~7 min時92%A→88%A，7~9 min時88%A→80%A，9~10 min時80%A→75%A，10~12 min時75%A→65%A，12~30 min時65%A→52%A，30~38 min時52%A→48%A，38~45 min時48%A→44%A，45~60 min時44%A→75%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：331 nm；進樣量40 μL；理論板數按芹菜苷峰計算應不低于30000。

2.4.2 指紋圖譜建立及相似度評價 取10批藍刺頭藥材（S1~S10），按2.1項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012A版）軟件進行色譜數據分析，分析條件：域值200，最小峰寬30，最小峰面積0，最小峰高1000，以10批藍刺頭藥材中的總黃酮的共有模式為對照色譜圖，共標定10個共有峰（圖1），通過對照，指認出8號峰為芹菜苷峰，且不同批次樣品中穩定存在，故選其作為參比峰（圖2）。將10批藍刺頭藥材的總黃酮圖譜的峰面積平均值和中位數為共有模式，根據峰匹配的結果，對所得的HPLC指紋圖譜全譜進行相似度計算，以相關系數表征相似度，結果10批藍刺頭藥材中總黃酮的指紋圖譜的10個共有峰的相似度介于0.900~1.000，表明10批藍刺頭藥材中總黃酮的指紋圖譜相似度良好，不同批次藍刺頭藥材的總黃酮成分均較穩定。

圖1 藍刺頭藥材總黃酮的HPLC色譜共有峰模式圖

圖2 藍刺頭總黃酮與芹菜苷對照品的HPLC色譜對比圖

2.4.3 方法學考察

2.4.3.1 精密度實驗 取藍刺頭藥材（編號S4）適量，精密稱定，按照2.1項下方法制備供試品溶液，按照2.3.1項下的色譜條件連續進樣測定6次。結果以8號峰為參比峰，各共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.0%（n=6），表明檢測系統的精密度良好。

2.4.3.2 穩定性實驗 取藍刺頭藥材（編號S4）適量，精密稱定，按照2.1項下方法制備供試品溶液，按照2.3.1項下的色譜條件，分別于0、4、8、12、16、20 h時進樣測定。結果以8號峰為參比峰，各共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明供試品溶液在20 h內穩定。

2.4.3.3 重復性實驗 取藍刺頭藥材（編號S4）適量，精密稱定，按照2.1項下方法制備供試品溶液，平行6份，分別按2.3.1項下色譜條件進樣測定。結果以8號峰為參比峰，各共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重復性良好。

2.5 化學計量學分析

2.5.1 聚類分析 將10批藍刺頭藥材的總黃酮指紋圖譜10個共有峰的相對峰面積導入SPSS 22.0統計軟件，采用組間連接法，參照王鑫晶等（2021）的研究以歐式距離平方作為測量度，進行聚類分析，結果見圖3。10批藍刺頭藥材可分為3類：第1類為S1、S3、S4、S7、S10，第2類為S2、S6、S8，第3類為S5、S9，聚為一類的樣品之間有較好的相似性。

圖3 10批藍刺頭藥材聚類分析

2.5.2 主成分分析 以10批藍刺頭藥材的總黃酮指紋圖譜10個共有峰的峰面積為變量，分別采用SPSS 22.0軟件和SIMCA-P12.0軟件進行主成分分析（PCA）。SPSS軟件分析得特征值>1的主成分有4個，其累計方差貢獻率為93.713%（表1），從表2可知，第1主成分中1、2、10號峰有較高的載荷值，第2主成分中5號峰有較高的載荷值，第3主成分3、6、7號峰有較高的載荷值，第4主成分中8、9號峰有較高的載荷值，表明多個總黃酮成分協同影響藍刺頭的整體質量；以主成分的特征值和貢獻率為選擇主成分的依據，選擇4個主成分，利用SIMCA-P軟件自動擬合，模型預測結果如圖4所示，10批藍刺頭藥材被分為3類，與聚類分析結果一致。

表1 藍刺頭藥材中總黃酮的指紋圖譜主成分分析特征值及方差貢獻率

表2 藍刺頭藥材中總黃酮的指紋圖譜色譜峰主成分因子載荷矩陣

圖4 10批藍刺頭藥材的總黃酮的主成分分析得分圖

2.5.3 偏最小二回歸分析 將10批藍刺頭藥材的總黃酮指紋圖譜共有峰的相對峰面積導入SIMCA-P12.0軟件，進行偏最小二回歸分析（PLSDA），得分圖如圖5所示。10批樣品可聚類為3類，與聚類分析和PCA結果一致。提取PLS-DA模型中10個變量投影重要性（VIP）值并從大到小排序，結果如圖6所示，VIP值>1的色譜峰分別為2號峰（1.2230），4號峰（1.5854），5號峰（1.4534），10號峰（1.2624），是引起藍刺頭藥材批次間差異的主要黃酮類成分，對其聚類有顯著影響。

圖5 10批藍刺頭藥材的總黃酮的PLS-DA模型得分圖

圖6 10批藍刺頭藥材的總黃酮的PLS-DA結果

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法 本實驗前期分別對提取溶劑（水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇和80%乙醇），提取方式（超聲提取和加熱回流提取），大孔樹脂型號（D101、AB-8、X-5、HPD-400、NKA-9），以及乙醇洗脫濃度（70%、80%、95%乙醇）進行了考察，以色譜峰信息的最大化、提取效率高為指標，確定本實驗的藍刺頭總黃酮的制備方法為以60%乙醇為提取溶劑，加熱回流提取2次，AB-8大孔樹脂純化，80%乙醇洗脫。

3.2 總黃酮含量測定 本實驗前期在芹菜苷對照品溶液中加入亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉試劑，結果無紅色物質產生，在500 nm處也無吸收，說明亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法并不適用藍刺頭總黃酮的測定。李蓮芳（2019）報道，結構中具有5-羥基和4-羰基的黃酮類化合物，如芹菜苷，能與三氯化鋁反應形成絡合物，使帶I或帶II向紅位移；帶II紅移后對照品溶液與供試品溶液在（275±2）nm處有共同吸收峰，因而可以用三氯化鋁作為顯色劑測定藍刺頭總黃酮的含量。孟憲琦等（2021）、黃艷萍等（2021）、李婷等（2020）和張學英等（2020）報道，采用三氯化鋁比色法測定植物中的總黃酮含量，主要因為三氯化鋁顯色法測定總黃酮結果在誤差范圍內準確度較高，顯色反應時黃酮類物質反應較強，而對色素、酚酸等非黃酮類物質的反應極弱，因而對黃酮類化合物的專屬性較強。本實驗藍刺頭總黃酮的含量測定方法利用了三氯化鋁與5-羥基、4-羰基的黃酮或黃酮醇類化合物反應生成絡合物使帶II向紅位移的原理，該方法在本實驗前期經方法學驗證重復性、精密度、穩定性和準確度較好。

3.3 色譜條件 本實驗前期比較了乙腈-水、甲醇-水、甲醇與不同濃度甲酸溶液的流動相系統對色譜峰的影響，結果用甲醇-1%甲酸溶液作為流動相進行梯度洗脫時色譜分離效果較好，峰數目較多；利用二極管陣列檢測器對樣品進行分析，觀察全譜的分離與吸收情況，結果波長為331 nm時出峰數量多，基線較平穩，信號響應值大，因此選擇331 nm作為本實驗的檢測波長。

3.4 方法評價 本實驗建立了藍刺頭總黃酮的高效液相色譜指紋圖譜，確定了10個共有峰，并對10批藍刺藥材中總黃酮的指紋圖譜的相似度進行評價，結果顯示有良好的相似性。通過紅外光譜和核磁共振光譜及文獻檢索，確證8號峰對應的化學成分的結構為芹菜苷，根據色譜峰的分離情況，8號峰芹菜苷分離度較好，故選擇該峰作為參照峰。同時，本實驗通過化學計量學分析，建立了藍刺頭聚類分析、PCA和PLS-DA分類模型，3種方法分析結果基本一致，均將10批樣品歸為3類；PLS-DA以共有峰VIP>1篩選得到4個主要差異性物質，不同批次藍刺頭藥材的總黃酮間的差異性主要體現在2、4、5、10號峰。本實驗建立的高效液相色譜指紋圖譜及化學計量學分析結果可為藍刺頭的質量控制和評價提供一定的參考依據。