微小RNA與常染色體顯性遺傳性多囊腎病關系的研究進展*

許麗麗 綜述，陳 婷，黃文輝 審校

(1.甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院/甘肅省人民醫院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省人民醫院腎內科，甘肅 蘭州 730000)

常染色體顯性遺傳性多囊腎病(ADPKD)是成人中最常見的單基因遺傳性腎病。據2020年中國ADPKD臨床實踐指南報道，ADPKD患病率為1/2 500～1/1 000，中國有125萬例患者，大約一半的患者在60歲時進展為終末期腎病,被認為是終末期腎病的第四大原因[1-2]。主要表現為雙側腎囊腫進行性發展和擴大，并伴有腎小球濾過率降低、高血壓、肝囊腫、腦動脈瘤等[3]。迄今為止，ADPKD的治療主要包括拮抗血管加壓素受體(托伐普坦)、支持措施(控制血壓、增加液體攝入量、限鹽和戒煙)及必要時腎臟替代治療等[4]，尚缺乏特異性治療藥物。近年來，越來越多的微小RNA(miRNA)被發現在包括多囊腎(PKD)在內的腎臟發育中存在差異表達，可通過影響關鍵生長因子或相關信號通路參與腎臟發育過程[5]。因此，研究miRNA在ADPKD發病中的作用對ADPKD生物標志物的確定及治療靶點的選擇具有重要意義。現將目前已知的miRNA與ADPKD的關系綜述如下。

1 ADPKD發病機制

目前，ADPKD發病機制仍未完全明確，公認的發病機制有纖毛致病假說、螺旋區-螺旋區相互作用假說、“二次打擊”假說等，最近有研究表明，表觀遺傳學(組蛋白修飾、DNA甲基化及翻譯后修飾)改變同樣可促進ADPKD的發生、發展。ADPKD發病機制：(1)ADPKD主要由編碼多囊蛋白1(PC1)和PC2的PKD1(16p13.3)和PDK2(4q21)基因突變所致，PKD1是一種多結構域糖蛋白并在G蛋白偶聯受體蛋白水解位點被剪切，PKD2屬陽離子鈣調節通道的瞬時受體電位家族的一種蛋白，80%的患者通過突變的PKD1和15%的患者通過突變的PKD2基因發展為ADPKD，其余5%的發病機制可能涉及其他基因的突變[6]。(2)纖毛致病假說。有研究表明，腎纖毛由腎小管上皮細胞深入腎小管腔，與尿液直接接觸，主要功能是作為機械感受尿流刺激，PC1、PC2均位于初級纖毛(一種在機械轉導中具有重要作用的頂端觸角狀細胞器)上并形成多囊蛋白復合體，將機械刺激轉化為化學信號傳遞給細胞,二者中任意一種缺失均會使初級纖毛功能異常，造成細胞內鈣和環磷酸腺苷(cAMP)水平的變化，以及隨后的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和Wnt等信號通路改變，最終導致細胞增殖和液體分泌異常，囊腫形成和生長[7]。(3)螺旋區-螺旋區相互作用假說。PC1、PC2借助C端螺旋區相互作用,成為ADPKD發病的共同途徑，并且PC1的穩定表達可能依賴于PC2的存在[8]。(4)“二次打擊”假說。囊腫始于正常腎小管，PKD1或PKD2的生殖系突變導致一個等位基因的丟失，而體細胞的第2次打擊導致另一個正常等位基因的丟失，隨后腎毒性損傷和(或)缺血在內的一個或多個途徑導致囊腫發生作為“第3次打擊”，導致腎小管細胞增殖，引起擴張及形成大小不等的充滿液體的囊腫[9]。(5)表觀遺傳學。表觀遺傳調控有2種主要形式：①組蛋白乙酰化，組蛋白去乙酰化酶(HDACs)是PKD基因的調節因子和(或)參與囊腫發生的信號通路，在腎上皮細胞中HDAC5已被確定為PKD1依賴的液體壓力感應的靶點，PKD1蛋白產物多囊素促進鈣離子流入細胞，并促進HDAC5蛋白激酶C磷酸化[10]，HDAC6在PKD1突變小鼠腎細胞中上調，抑制HDAC6通過降低細胞內cAMP和Ca2+水平抑制囊腫細胞生成[11]；②DNA甲基化，2014年WOO等[12]報道了ADPKD患者樣本DNA甲基化水平，發現基因組中有13 000多個不同甲基化片段，91%為高甲基化的，基因組外顯子區是ADPKD DNA甲基化變化的主要靶點，高甲基化促進囊腫的發生。進一步研究表明，ADPKD患者整個組織中生成的差異甲基化片段主要反映在單個ADPKD囊腫的甲基化組中[13]；③翻譯后修飾，miRNA翻譯后修飾可改變基因表達的相關生物學機制，與ADPKD的關系將在后文介紹。除上述之外，還提出了鈣信號通路缺陷、終止信號假說、齊-雜合子學說等。另外，囊腫形成和擴張本身伴隨著炎癥、巨噬細胞活化、缺血、細胞因子產生和腎小管阻塞等，這些可能進一步促進了囊腫形成和生長的環境，即所謂的“滾雪球”效應[14]。迄今為止，ADPKD很多發病機制尚未明了，仍需通過進一步研究發掘。

2 miRNA的發現、形成及功能

miRNA是一類內源性小非編碼 RNA (19～25個核苷酸)，具有保守性、組織特異性和時序性,調控包括發育時間、造血、臟器發育、細胞凋亡、細胞增殖，甚至可能是腫瘤發生等多種途徑[15]。1993年第1個miRNA在秀麗新小桿線蟲體內中被發現[16]，迄今為止，約2 300個人類成熟miRNA被報道，其中1 115個在miRNA數據庫被標注[17]，在健康或疾病狀態下幾乎所有生物途徑均受到miRNA的調控。miRNA的形成大致包括以下步驟：(1)大部分miRNA基因在細胞核中被RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成長鏈初級miRNA(pri-miRs)；(2)Pri-miRs被核糖核酸酶Ⅲ型核酸內切酶及雙鏈RNA結合蛋白處理形成莖環結構的Pri-miRs；(3) Pri-miRs被輸出蛋白5轉運至細胞質,被另一種核糖核酸酶Ⅲ型核酸酶處理成為成熟雙鏈RNA；(4)雙鏈miRs分子中的引導鏈被選擇性加載到AGO中形成miRNA誘導的沉默復合物，而另一條過客鏈從AGO中釋放并被降解；(5)miRNA誘導的沉默復合物根據miRNA引導鏈的種子序列，對靶miRNA進行翻譯抑制或降解，從而發揮生物學效應[18]。miRNA是體內平衡的關鍵調節因子，其失調是引起ADPKD在內的多種疾病的基礎,因此，miRNA可能是ADPKD有前途的診斷生物標志物和潛在的治療靶點。

3 miRNA在ADPKD中的作用機制

3.1miR-17～92與ADPKD miR-17～92是一種進化上保守的多順反子miRNA簇，是最具特征的miRNA癌基因之一，主要位于人類基因組C13orf25的800堿基對區域，由非蛋白編碼基因MIR17HG編碼的7 kb轉錄本生成；根據種子序列同源性，miR-17～92可分為4個家族，即miR-17 (miR-17-5p和miR-20a)、miR-18、miR19(miR-19a和19b-1)和miR-92 (miR-92-1)，還包括2個旁系同源簇，即miR-106b～25和miR106a～363)[19]。miR-17～92具有促進增殖、逃避凋亡反應，以及抑制分化、增加血管生成和維持細胞存活等功能[20]，與ADPKD的發生密切相關。有研究表明，miR-17～92在Kif3a-KO小鼠、Pkhd1-/-小鼠、Pkhd1/cre；Pkd2F/F等多個PKD小鼠模型表達上調，并在miR-17～92過表達小鼠腎臟中觀察到腎小管擴張、腎小管囊腫和腎小球囊腫，這些效應可能與miR-17～92通過促進增殖、PKD基因(PKD1、PDK2)和肝細胞核因子-1β的轉錄后抑制來介導，因此，特異性失活miR-17～92可抑制囊腫的生長，改善腎功能，延長生存期[21]。通過抑制miR-17～92可能是ADPKD的一種有效的治療方法。 MiR-17是miR-17～92中的一種促增殖miRNA，目前已在真核生物中得到廣泛研究，被認為是ADPKD的一個有價值的藥物靶點。有研究表明，在PKD1、PKD2敲除的小鼠模型和ADPKD患者腎囊腫樣本中miR-17表達上調，且 PKD2的 3′非翻譯區(3′UTR)比PKD1更具保守性；在HEK293細胞中miR-17可直接靶向作用于PKD2的3′UTR，通過轉錄后抑制PKD2基因表達，促進囊腫細胞增殖[22]。HAJARNIS等[23]研究表明，miR-17基因缺失會抑制囊腫增殖和PKD進展，其原因可能是改善了線粒體功能，在ADPKD小鼠模型中miR-17可被原癌基因cMyc靶向激活，直接作用于過氧化物酶體增殖劑激活受體α(PPARα)抑制氧化磷酸化和脂肪酸氧化基因表達，最終調節線粒體代謝，促進ADPKD發展；抗miR-17及PPARγ激動劑可抑制PKD小鼠模型的囊腫生長，說明由cMyc-miR-17-PPARα信號軸誘導的促增殖代謝途徑是ADPKD發病機制之一。目前，RGLS4326是一種miR-17短寡核苷酸抑制劑，已被證實可通過抑制miR-17的PKD1、PKD2等多個靶點以減弱囊腫生長，并在體外ADPKD模型和多個PKD小鼠模型中顯示出良好的穩定性、安全性、藥代動力學和藥效學特點[24]。因此，miR-17及其靶點對ADPKD的治療至關重要。

3.2miR-21與ADPKD miR-21是最早被識別的miRNA之一，由位于染色體17q23.2上的液泡膜蛋白1基因編碼，進化保守的miR-21在高細胞增殖、抗凋亡、高侵襲和轉移潛能相關癌細胞中高度表達，因此，miR-21也被認為是一種致癌基因[25-26]。LAKHIA等[27]研究表明，miR-21表達上調是嚙齒動物和人類PKD的共同特征，囊腫上皮細胞是miR-21水平升高的主要來源；在ADPKD直系同源小鼠模型中cAMP可通過激活PKA促進cAMP反應元件結合蛋白(CREB)與miR-21啟動子靶向結合，進而促進PKD的發生、發展，miR-21基因缺失抑制囊腫發展。另外，程序性細胞死亡因子4(PDCD4)是miR-21的新靶點，miR-21可通過直接抑制PDCD4而抑制囊腫上皮細胞凋亡。其中CREB在腎囊腫發生過程中具有關鍵作用[28]。因此，cAMP/CREB-miR-21-PDCD4信號軸可能成為ADPKD的一個新的藥物干預途徑。一項循環miRNA作為ADPKD患者生物標志物的研究對ADPKD患者根據慢性腎臟病(CKD)分期進行分類發現，miR-21在內的8個miRNAs表達水平隨腎小球濾過率下降至少增加2倍[29]，為循環miRNA預測ADPKD疾病進展提供了理論依據，但尚需更多的研究進一步證實。

3.3miR-132-3p 與ADPKD 氧化應激在ADPKD發病早期發揮了核心作用,促進囊腫的生長機制可能與一氧化氮合成不足、內皮功能障礙和粒體功能障礙有關[30]。miR-132在小鼠、人類、蒼蠅及其他具有類似結構和序列的物種中均具有保守性，人體內miR-132由17號染色體上的hsa-miR132-5p和hsa-miR-132-3p組成，miR-132-3p是miR-132/212的重要組成部分，對人體不同系統之間的生理平衡至關重要[31]。miR-132-3p作為miR-132的剪接變體，被證明直接靶向并負向調控叉頭框O3(Foxo3)，進而抑制炎性反應和凋亡[32-33]。Foxo3是叉頭框轉錄因子家族的一員，參與了細胞代謝、細胞氧化還原、細胞增殖等過程，是已知的氧化應激反應的關鍵調節因子[34]。CHOI等[35]通過 PKD1選擇性基因敲除小鼠miRNA測序和ADPKD患者基因芯片分析發現，miR-132-3p在小鼠和人類ADPKD中均顯著表達，是Foxo3a的關鍵調控因子，有趣的是，在ADPKD線粒體中甘氨酸脒基轉移酶(Gatm)基因表達被下調，miR-132-3p過表達可抑制Foxo3并降低Gatm的表達，從而導致氧化應激，促進ADPKD的囊腫生長，因此，miR-132-3p-Foxo3a-Gatm信號軸在ADPKD中的氧化應激發揮著關鍵作用，miR-132-3p的進一步研究對ADPKD早期診斷和防治具有重要意義。

3.4miR-182與ADPKD 肌動蛋白細胞骨架異常是ADPKD的一個顯著特征[35,37]。最近一項研究表明，ADPKD中肌動蛋白細胞骨架和囊腫的發生存在直接聯系，這是一種新的信號傳導機制,并受miR-182-5p的調控，miR-182-5p在野生型Pkd1f/f 模型小鼠髓質區和腎小球中表達，并在小鼠飼養的第7天觀察到miR-182-5p表達于囊腫上皮細胞中；另外，在PKD1缺陷小鼠模型腎囊腫上皮細胞中肌動蛋白細胞骨架減少和紊亂，其標記基因Wiskott-Aldrich綜合征蛋白家族成員2、胞質分裂作用因子1和 整合素α4表達水平均顯著降低，miR-182-5p過表達靶向抑制肌動蛋白細胞骨架標記物及肌動蛋白細胞骨架的組織，特別是板粒的形成，最終促進囊腫生長[38]。因此，miR-182-5p可能通過調節肌動蛋白細胞骨架，成為一種新的誘導因子在ADPKD中發揮關鍵作用。SUN等[39]也發現，miR-182在Pkd1-/-小鼠模型中較對照組顯著增加，同時，轉化生長因子β1(TGF-β1)誘導的ADPKD囊腫上皮細胞中Smad3 蛋白表達明顯增加；在囊腫上皮細胞中轉染miR-182模擬物后未受TGF-β1誘導的ADPKD囊狀上皮細胞miR-182表達上調，TGF-β1誘導的ADPKD囊腫上皮細胞中miR-182表達更高，提示miR-182通過TGF-β1/Smad3通路抑制PKD腎纖維化的分子機制。TGF-β1是纖維化過程中的一個關鍵的促纖維化生長因子，調節細胞增殖、分化和凋亡，而miR-182的表達與TGF-β1誘導的纖維化呈正相關[40]。由此可見，miR-182在ADPKD發生、發展中扮演著重要角色。

3.5miR-214與ADPKD miR-214由一種名為Dnm3os的反義非編碼RNA編碼，最初被發現可促進宮頸癌細胞凋亡，在人類腎臟疾病和動物腎臟疾病模型中高表達[41-42]。巨噬細胞可促進囊腫的形成和發展，清除PKD小鼠腎臟中的巨噬細胞可顯著降低囊性指數及囊壁細胞增殖，并改善腎功能[43]。LAKHIA等[44]研究表明，miR-214及其宿主長非編碼RNA Dnm3os在小鼠和人ADPKD中穩定且持續表達，囊腫微環境中的間質細胞是miR-214主要來源；另外，miR-214具有抑制囊腫相關炎癥和致病性MRC1+巨噬細胞積聚的作用，盡管miR-214的基因缺失并不影響腎臟發育或體內平衡，但在PKD2-和PKD1-突變小鼠中抑制miR-214會加重囊腫的生長，其機制是Toll樣受體4(TLR4)/干擾素-γ/重組人信號傳導與轉錄激活因子1促炎通路激活miR-214，反過來，miR-214作為一個負反饋環直接抑制TLR4，表明miR-214的缺失與TLR4表達增加和囊腫巨噬細胞積累增強相關。因此，miR-214表達水平的上調是囊腫微環境的代償性保護反應，其功能是抑制炎癥和囊腫生長，但miR214在ADPKD中的作用尚需進一步確定。

3.6miR501-5p與ADPKD mTOR信號通路或機制靶點參與了ADPKD囊腫的形成和擴大過程,在許多PKD患者的16號染色體上PKD1基因和鄰近的 結節性硬化癥基因2(TSC2)基因缺失,且PKD1基因和TSC1或TSC2基因雜合突變小鼠比單基因突變小鼠出現更多的腎囊腫[45]。DE STEPHANIS等[46]在ADPKD細胞和組織中觀察到磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)和TSC1基因表達水平降低，mTOR磷酸化水平及miR501-5p表達水平顯著升高。PTEN和TSC1是mTOR的上游效應分子，二者同時敲除小鼠比TSC1單基因突變體小鼠發生更嚴重的PKD[47]。DE STEPHANIS等[46]研究進一步表明，PTEN和TSC1的3′UTR包含miR501-5p的多個識別位點,miR501-5p的上調可導致PTEN和TSC1表達水平降低,進而激活mTOR激酶；另一方面，mTOR激酶的激活誘導癌基因MDM2的上調，導致腫瘤抑制蛋白——p53的泛素化和降解，從而促進細胞增殖并抑制凋亡，最終影響ADPKD的發展。同樣在腎癌細胞中也觀察到miR501-5p通過增強mTOR活性導致p53失活，促進細胞增殖和存活[48]。因此，miR501-5p及其信號途徑可為ADPKD的治療藥物靶點提供新選擇。

3.7其他miRNA與ADPKD 在ADPKD組織和細胞系中miR-199a-5p顯著上調，并隨疾病進展而增加，抑制miR-199a-5p表達可抑制囊腫細胞增殖及誘導細胞凋亡，經確認周期蛋白依賴激酶抑制因子1C是miR-199a-5p的直接靶點，miR-199a-5p可能通過靶向周期蛋白依賴激酶抑制因子1C/p57發揮作用[49]。KOCYIGIT等[29]根據CKD分期對80例ADPKD患者進行分組發現，循環中miR1260a、miR-1587、miR-21-5p、miR-3907、miR-3911、miR-92a-3p 均出現劑量反應現象，并隨著腎小球濾過率下降至少增加2倍；隨訪1年后比較了所有患者所選變量與進展結果的關系發現，腎小球濾過率估計值下降大于10%與年齡、CKD分期和miR-3907獨立相關。另外，在ADPKD患者中提取尿液外泌體miRNA發現了7個腎臟富集的miRNA，即miR-194-2簇(miR-1925p和miR-194-2-5p)、miR-194-1-5p和miR-30家族的4個成員(miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30d-5p和miR-30e-5p)的表達低于健康對照組，這些miRNA在晚期ADPKD患者中的表達均有顯著變化，而在早期ADPKD患者中只有miR-194-1-5p、miR-194-2-5p的表達顯著低于對照組[50]。近年來，miRNA與自噬的關系也得到研究，有研究證實，miR-25-3p在PKD小鼠中上調，抑制miR-25-3p可通過調控自噬相關蛋白14促進PKD小鼠細胞自噬，抑制細胞增殖[51]。

4 小 結

ADPKD是腎衰竭常見且難以治愈的病因之一，近年來，越來越多的miRNA被發現在ADPKD中異常表達，并與其發生、發展密切相關，因此，本文就相關miRNA與ADPKD發病機制的關系進行了綜述，旨在為治療ADPKD的靶點選擇提供一些線索。但目前大多數miRNA只在動物及細胞實驗中進行了研究，尚未在臨床中得到驗證；此外，仍有許多miRNA的功能及機制在ADPKD中尚未明確,因此，未來尚需要大量的研究探索miRNA在ADPKD發生、發展中的作用，以發掘ADPKD的潛在生物標記物及治療靶點。