人工養殖南美白對蝦中副溶血弧菌的分離鑒定及抗生素耐藥性分析

李小玥，姚槐應，葛超榮

武漢工程大學環境生態與生物工程學院，湖北 武漢 430205

南美白對蝦，又稱凡納濱對蝦，具有產量高、味道鮮美、營養價值豐富等特點，自從引入我國后迅速發展成我國第一大海水養殖蝦種。2019年我國海水養殖南美白對蝦產量為1 144 370 t，占海水養殖蝦類總產量的78.91%［1］。副溶血弧菌是南美白對蝦養殖中常見的致病菌，是導致蝦類早期死亡綜合征（又稱急性肝胰腺壞死病，acute hepatopancreatic necrosis syndrome，AHPNS）的病原菌，AHPNS爆發會對南美白對蝦養殖業造成巨大經濟損失。此外，副溶血弧菌也是一種人、漁共致病的病原菌，進入人體后會引起食源性中毒和急性腹瀉［2］。

作為殺死或抑制細菌生長的化學藥品，抗生素在水產養殖中被廣泛使用。2017全球水產養殖中使用的抗生素約為10 259 t，而中國的水產養殖抗生素消費量占比為57.9%［3］。長期大量甚至過度使用抗生素導致養殖水體中抗生素殘留。在一項有關中國海岸線的近海水樣的研究中，13種目標抗生素中有7種被檢測出，抗生素總濃度為389～3 302.3 ng/L［4］。抗生素的殘留會導致對蝦養殖環境中耐藥細菌甚至多重耐藥菌的富集。渤海、黃海及東海沿岸的山東省和浙江省是我國重要的海水養殖區域。2012年從青島海水養殖蝦中分離的副溶血弧菌對18種目標抗生素中的3種高度耐藥，少量菌株表現出多重耐藥性［5］。2017年至2019年從浙江省養殖的南美白對蝦中分離出的副溶血弧菌，對氨芐西林和鏈霉素的耐藥率較高，多重耐藥菌株也比較常見［6］。雖然這兩地有部分報道，但是并沒有細致到青島、寧波兩地養殖南美白對蝦中分離的副溶血弧菌耐藥性的報道。有關黃河入?？诘臇|營附近養殖南美白對蝦中副溶血弧菌耐藥情況暫未見報道。

本研究從寧波、青島和東營三個地區的養殖南美白對蝦中分離副溶血弧菌，測定分離菌株的耐藥情況，分析這些養殖區域的副溶血弧菌的耐藥情況形成的原因和如何減少其耐藥性。

1 實驗部分

1.1 材料與化學試劑

1.1.1 實驗材料本實驗室于2020年9月從浙江、山東的市場購買當地養殖南美白對蝦，蝦體成熟健康且大小均勻，每只約重16 g。-40℃速凍后隨即用干冰運送到實驗室，置于-80℃冰箱凍藏待用。各地蝦樣采集地點如表1所示。

表1 采樣地區及鄰近海域Tab.1 Sampling area and adjacent marine area

1.1.2 主要化學試劑質量分數3%氯化鈉堿性蛋白胨水、硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（thiosulfate cirate bile salts sucrose，TCBS）瓊脂、質量分數3%氯化鈉三糖鐵瓊脂、水解酪蛋白瓊脂（mueller-hinton agar，MHA）、副溶血性弧菌成套生化鑒定管、沃格斯-普洛斯（voges-proskauer，V-P）試劑（青島海博生物技術有限公司）；胰蛋白胨、酵母提取物、藥敏紙片（英國OXOID公司）；氯化鈉、瓊脂粉（德國BioFroxx公司）；細菌基因組DNA快速抽提試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）預混液（美國普洛麥格生物公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 副溶血弧菌的分離純化參照國家標準［7］，在無菌操作下取3～5只蝦，蝦肉、蝦腸道分別與質量分數3%氯化鈉的堿性蛋白胨水溶液混合，配制成質量（g）與體積（mL）比為1∶10的樣品勻液，36℃培養8～18 h。將培養后的增菌液劃線接種于TCBS平板上，36℃培養18～24 h。將疑似菌落在平板上純化培養，純化的菌株置于-80℃保存備用。

1.2.2 生理生化鑒定參照國家標準［7］，將純培養的菌株進行革蘭染色，并采用副溶血弧菌成套生化鑒定管進行氧化酶試驗、嗜鹽性試驗、動力試驗、甘露醇試驗、賴氨酸脫羧酶試驗、V-P試驗和β-半乳糖苷酶（ONPG）試驗。

1.2.3 16S rRNA基因鑒定利用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒進行DNA提取。取1 mL過夜培養菌液8 000 r/min離心1 min后收集菌體。加入400 μL裂解液后于65℃水浴1 h使細胞完全裂解。加入20 μL核糖核酸酶A溶液后放置5min。加入200 μL磷酸緩沖液，顛倒混勻后-20℃靜置5 min。10 000 r/min離心5 min，取上清液，加入等體積的異丙醇充分混勻，放置3 min。10 000 r/min離心5 min后棄上清。加入1 mL體積分數75%乙醇，漂洗充分后10 000 r/min離心2 min，棄上清。重復洗滌，將殘留的乙醇完全揮發。用100 μL氨基丁三醇-乙二胺四乙酸緩沖液溶解沉淀。得到DNA溶液。

選擇16S rRNA基因擴增的27F/1492R引物對進行PCR擴增。引物對序列為：27F：5′-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGTTA CCTTGTTACGACTT-3′。

整個反應的總體系為50 μL：PCR預混液25 μL，10 μmol/L 27F 2 μL，10 μmol/L 1429R 2 μL，細菌基因組DNA模板1 μL，無菌雙蒸水20 μL。PCR擴增程序為：98℃預變性2 min；98℃變性10 s，57℃退火10 s，72℃延伸30 s，總循環數為35；72℃延伸5 min。

擴增的PCR產物送至武漢擎科生物科技有限公司進行測序，將測序結果在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行比對。

1.2.4 副溶血弧菌抗生素藥物敏感性測定分離菌株對抗生素的敏感性測定采用紙片擴散法，將分離菌株菌液稀釋至108CFU/mL，均勻涂布于MHA平板，貼上不同的抗生素紙片，于36℃培養24 h，測量抑菌圈的直徑。評價標準參考美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）所給出副溶血弧菌相關抗生素敏感性標準［8］。藥敏紙片選用4大類11種抗生素，包括β-內酰胺類抗生素7種：氨芐西林（ampicillin，AMP）、哌拉西林（piperacillin，PRL）、頭 孢 噻 肟（cefotaxime，CTX）、頭 孢 西 丁（cefoxitin，FOX）、頭孢吡肟（cefepime，FEP）、亞胺培南（imipenem，IPM）、頭孢他啶（ceftazidime，CAZ）；四環素類抗生素2種：四環素（tetracycline，TE）、土霉素（oxytetracycline，OTC）；喹諾酮類抗生素：環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）；氨基糖苷類抗生素：慶大霉素（gentamicin，CN）。質控菌株為副溶血弧菌ATCC 17802，每次試驗均重復三次。

2 結果與討論

2.1 副溶血弧菌分離結果

從三個采樣區養殖的南美白對蝦分離出7株疑似菌株。寧波的分離菌株命名為NB-C1-1、NBC1-2；青島分離株為QD-C1、QD-C2、QD-C3；東營分離株為DY-C1-1、DY-R2-1。

疑似菌株在TCBS平板上是圓形、半透明且表面光滑的綠色菌落，用接種環輕觸，有黏性，直徑2-3 mm，部分分離菌株菌落形態如圖1。

圖1 分離菌株的典型菌落形態：（a）寧波分離株NB-C1-1，（b）青島分離株QD-C3，（c）東營分離株DY-C1-1Fig.1 Typical colony morphologies of isolated strains：（a）NB-C1-1 isolated from Ningbo，（b）QD-C3 isolated from Qingdao，（c）DY-C1-1 isolated fromDongying

2.2 菌株生理生化鑒定結果

7株疑似菌株均為革蘭陰性菌，呈卵圓狀，無芽孢。由副溶血弧菌成套生化鑒定管測定分離出的7株菌的生理生化特征列于表2中，可以發現這7株菌均為氧化酶、賴氨酸脫羧酶和甘露醇陽性，耐鹽，有動力，V-P和ONPG陰性。這些特征與國標［7］中副溶血弧菌主要特征完全符合。

表2 7株菌株生理生化鑒定結果Tab.2 Physiological and biochemical identification results of 7 strains

2.3 菌株16S rRNA基因鑒定結果

16S rRNA基因測序結果顯示：菌株NB-C1-1序列長度為1 395 bp，菌株NB-C1-2序列長度為1 386 bp，菌株QD-C1序列長度為1 397 bp，菌株QD-C2序列長度為1 396 bp，菌株QD-C3序列長度為1 381 bp，菌株DY-C1-1序列長度為1 370 bp，菌株DY-R2-1序列長度為1 378 bp。

將測序結果在NCBI網站上利用基于局部序列比對算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行比對分析，并應用分子進化遺傳分析（molecular evolutionary genetics analysis version 11，MEGA 11）軟件對7株副溶血弧菌的16S rRNA基因進行序列分析，將菌株序列與NCBI中已錄入的副溶血弧菌16S rRNA基因核苷酸序列進行多重比對，構建鄰接法（neighborjoining，N-J）系統發育樹（圖2）。結果顯示，7株細菌均為副溶血弧菌，除菌株NB-C1-1與Vibrios parahaemolyticus的相似性為99.86%，其余菌株的與Vibrios parahaemolyticus的相似性均為100%。同時可以看出同一地區分離出的不同株的副溶血弧菌之間差異性較小。

圖2 分離菌株的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of isolated strains

生理生化鑒定和16S rRNA基因測序結果，確定分離7株菌均為副溶血弧菌。（GenBank登錄號分 別 為：ON125507、ON125508、ON125509、ON125510、ON125511、ON125512和ON125513）

2.4 藥敏試驗

7株副溶血弧菌的抗生素藥敏試驗，結果如表3所示，顯示從這三個地區所分離的菌株耐藥性不完全一致，同一地區分離的菌株耐藥性相對一致。東營養殖的南美白對蝦分離的副溶血弧菌的耐藥譜較廣，對AMP、PRL、TE和OTC這兩大類4種抗生素表現出耐藥性；寧波和青島養殖的南美白對蝦分離的副溶血弧菌則僅對AMP和PRL這兩種抗生素耐藥。

表3 分離副溶血弧菌藥敏實驗結果Tab.3 Drug susceptibility test results of isolated Vibrio parahaemolyticus

將分離的7株菌株對抗生素的耐藥性進行統計，結果如表4所示。分離出的所有菌株都對AMP和PRL耐藥，對TE和OTC耐藥的占28.57%，對其他6種抗生素CTX、FOX、FEP、IPM、CAZ和CIP均為敏感。

表4 副溶血弧菌耐藥性統計Tab.4 Statistics on drug resistance of Vibrio parahaemolyticus

2.5 不同地區副溶血弧菌耐藥性分析

本研究結果表明不同地區分離的副溶血弧菌對抗生素的耐藥性不同。在三個采樣區域中，東營位于渤海沿岸，養殖的南美白對蝦分離的菌株的耐藥譜最廣，對四環素類（OTC和TE）和β-內酰胺類（AMP和PRL）的抗生素具有耐藥性。Zhang等［9］對渤海灣近岸海域水體中抗生素進行檢測，發現OTC的殘留量最高，平均達到69.8 ng/L，四環素類抗生素的耐藥風險和生態風險最高。對渤海沉積物中抗生素殘留量調查［10］發現，四環素類抗生素的平均濃度和最高濃度普遍高于其他抗生素。渤海是我國的內海，抗生素污染的情況相較其他海域嚴重一些［11］，其抗生素殘留與我們檢測的該區域養殖的南美白對蝦中副溶血弧菌的耐藥情況相一致，可推測該區域細菌耐藥性的產生與抗生素殘留有關。

青島和寧波養殖南美白對蝦中副溶血弧菌僅對2種β-內酰胺類（AMP和PRL）抗生素耐藥。青島位于黃海沿岸，Han等［12］對黃海海域的海水養殖場水體中抗生素殘留量進行檢測，發現CIP和恩諾沙星是濃度最高的抗生素，甲氧芐啶是最普遍存在的抗生素。寧波位于東海沿岸，Li等［13］對東海沿岸海水和沉積物進行抗生素的檢測，發現含量最高的分別是克林霉素和紅霉素，四環素類的抗生素殘留量是檢測出的五大類中最低的。以上報道中四環素類的抗生素殘留較低，與本研究結果中這兩地的副溶血弧菌沒有對四環素類的抗生素產生耐藥性相一致。

β-內酰胺類和四環素類是養殖常用的抗生素種類，β-內酰胺類抗生素主要通過抑制與細菌細胞壁合成有關的酶——青霉素結合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs），阻礙細胞生長，而四環素類抗生素的主要通過與核糖體30S亞基結合，阻礙細菌蛋白質合成［14-15］。細菌對β-內酰胺類抗生素產生耐藥性主要是通過三種機制：（1）靶標PBPs的改變；（2）修飾或者下調外膜孔蛋白減少對抗生素的攝取或者生產過量的外排泵；（3）產生β-內酰胺酶將抗生素分解為非活性化合物［14，16］。細菌對四環素類抗生素產生耐藥性主要是通過兩種機制：（1）核糖體保護機制，通過核糖體突變，改變靶標核糖體亞基；（2）由外排介導的耐藥機制，以質子交換作為能量來促進四環素外排［15，17］。

由上述分析可知南美白對蝦養殖區域抗生素含量和所分離株的耐藥性有一定的關聯，但是由于細菌耐藥性的成因比較復雜，更多原因還需進一步探究。

3 結論

本研究從東營、青島和寧波養殖的南美白對蝦中分離并鑒定了副溶血弧菌，抗生素敏感性檢測表明東營分離株對四大類11種抗生素中的兩類4種抗生素具有耐藥性，青島和寧波的分離菌株對一類2種抗生素具有耐藥性。分離的副溶血弧菌都對AMP和PRL耐藥。本研究結果發現食源性分離的副溶血弧菌耐藥情況比較嚴重，對人體健康安全存在一定的風險性，部分分離株的耐藥性可能與該地區抗生素濫用有關聯，所以今后的水產生產中要注意抗生素的規范化使用。