子宮頸脫落細胞塊聯合p16/Ki-67雙染在意義不明確的非典型鱗狀上皮細胞和低級別鱗狀上皮內病變的篩查意義

張波 楊志敏 康子婧 康凱夫，4 許萍榕 鄒倩 朱偉， 王效軍

1廣東醫科大學附屬第三醫院（佛山市順德區龍江醫院）病理科（廣東佛山 528000）；2佛山市南海區第四人民醫院病理科（廣東佛山 528000）；3南方醫科大學順德醫院（佛山市順德區第一人民醫院）（廣東佛山 528000）；4廣東醫科大學順德婦女兒童醫院（佛山市順德區婦幼保健院）（廣東佛山 528000）；5廣東醫科大學病理學系病理學技術教研室（廣東東莞 523808）；6廣東醫科大學公共衛生學院流行病與統計學系（廣東東莞 523808）

子宮頸癌（cervical cancer，CC）是女性癌癥死亡的第三大主要病因，是女性生殖系統第二大常見腫瘤［1］，多數為持續性高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）感染所致。根據國家癌癥中心《2020年全國癌癥中心年度工作報告》顯示，子宮頸癌發病率位于第6位，死亡率位于第8位［2］。子宮頸癌篩查不僅要提高敏感度，還要提高特異度，從而有效準確診斷HPV陽性或細胞學為意義不明確的非典型鱗狀上皮細胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US）和低級別鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）的病例。病理活檢診斷為有創檢查不能成為常規篩查手段，p16/Ki-67可有效區分子宮頸上皮內病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）并分級，薄層液基細胞學（thinprep cytologic test，TCT）聯合p16/Ki-67對診斷高級別鱗狀上皮內病變（highgrade squamous intraepithelial lesion，HSIL）特異度更高，但在進一步分流ASC-US病變中針對LSIL染色判讀以及子宮頸脫落細胞塊（cell block，CB）應用于子宮頸癌篩查相關文獻鮮有報道。因此本文針對LSIL精準判讀p16/Ki-67雙染染色、CB聯合p16/Ki-67雙染在ASC-US和LSIL分流的應用進行探討，根據研究數據判定其可行性，為子宮頸癌及癌前病變的早期篩查提供可靠的診斷依據。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2020年12月至2022年6月在廣東醫科大學附屬第三醫院（佛山市順德區龍江醫院）和佛山市南海區第四人民醫院婦科門診就診的符合本研究納入標準的患者500例進行CB制備，以子宮頸活檢診斷為最終標準篩選出210例進行常規切片HE染色和p16/Ki-67雙染。入組病例年齡19～63歲，平均37歲。其中ASC-US 100例，LSIL 110例。入選標準：（1）TCT篩查報告為ASCUS和LSIL并同時接受DH3（人乳頭瘤病毒核酸檢測試劑盒）雜交捕獲-化學發光法技術行HR-HPV DNA檢測；（2）TCT報告取樣后1個月內接受陰道鏡下活檢；（3）制備CB并行p16/Ki-67檢測；（4）非妊娠狀態；（5）既往宮頸篩查結果正常，無宮頸手術史，無任何其他惡性腫瘤史，無自身免疫性疾病或正在接受免疫抑制治療；（6）經廣東醫科大學附屬第三醫院（佛山市順德區龍江醫院）醫學倫理委員會審批（編號：［2020科］院倫審第1411號）。

1.2 方法

1.2.1 TCT制備 按TCT要求取樣，采用全自動液基細胞制片染色系統（沉降式）完成子宮頸脫落細胞學制片、巴氏染色。依據2014年新修訂的子宮頸細胞學Bethesda分類系統（the bethesda system，TBS）進行細胞學診斷，獲取ASC-US和LSIL有效樣本。

1.2.2 簡易標準化CB制備及HE染色 （1）將TCT制備后剩余子宮頸脫落細胞樣本倒入新的細胞保存液，用振蕩器震蕩2 min，將采樣器宮頸刷上的細胞充分震蕩入細胞保存液內；（2）將保存液內加入適量伊紅染液，2 000 r/min離心5 min，棄去上清；加入95%乙醇3～4 mL震蕩均勻，靜止2 h；2 000 r/min離心5 min，棄去上清；富集樣本后轉移至濾紙包埋盒行常規固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、制片和HE染色。制備好的CB細胞富集居中色澤鮮明清晰可見，部分病例可表現出類似組織學樣結構。

1.2.3 p16/Ki-67雙染 CB切片制備后，采用粘附載玻片撈取連續2張切片，65℃烤片1 h，手動脫蠟后采用手工SOP法p16/Ki-67免疫細胞化學雙染染色，經過：（1）高壓抗原修復；（2）浸入PBS緩沖液；（3）阻斷內源性過氧化物酶，滴加過氧化物酶阻斷劑50 μL，室溫孵育；（4）滴加混合一抗 p16/Ki-67試劑50 μL；（5）滴加混合聚合物二抗試劑（安必平）50 μL，室溫孵育；（6）滴加新鮮配制 DAB顯色液100 μL，室溫孵育；（7）滴加新鮮配制Fast-Red顯色液100 μL，室溫避光孵育；（8）蘇木素染色液復染3～5 s，蒸餾水充分沖洗；（9）PBS緩沖液返藍；（10）梯度酒精脫水、透明、中性樹膠封固。

1.2.4 HR-HPV檢測 采用DH3雜交捕獲-化學發光法技術對子宮頸脫落細胞行HR-HPV DNA檢測（杭州德同生物技術有限公司），包括2種HRHPV型別（HPV16、18型）和12種HR-HPV型別（HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型），具體操作按說明書進行。所有檢測都以樣本測量值/參考值的比值表示，比值≥1.0，結果為“陽性”；比值＜1.0，結果為“陰性”。

1.2.5 陰道鏡檢查和活檢 使用電子陰道鏡數字成像系統依據陰道鏡操作規范，充分陰道鏡檢查后，立即在異常病變最嚴重的部位進行活檢，若無異常則常規3、6、9及12點行多點活檢，福爾馬林固定液固定活檢的組織標本送至病理科。

1.2.6 結果判定 （1）細胞學診斷：采用TBS分級系統完成TCT制片及CB的HE染色判讀，所有病例均采用雙盲并固定2名經驗豐富的主治醫師及副主任醫師分別閱片后共同完成結果判讀；（2）子宮頸活檢診斷：采用組織學診斷；（3）p16/Ki-67雙染判讀：筆者前期研究［3］中確定CB在整張載玻片（4張連續切片）發現一個陽性細胞（細胞同時p16和Ki-67特異性細胞質棕色和細胞核紅色）即判讀為陽性；將單個細胞染色或雙染陽性細胞數＜5%定義為陰性，最終實驗結果中顯示LSIL組中CB雙染的敏感度低于TCT。本次研究將CB中p16胞質淡黃或淺棕色，或同時具有Ki-67細胞核淺紅色顆粒，結合TCT細胞學形態，即可判讀為LSIL；p16/Ki-67雙染強陽性，結合TCT細胞學形態為HSIL；其余情況均為未見上皮內病變或惡性病變（negative for squamous intraepithelial lesions or malignancy，NILM），見圖1。

圖1 p16/Ki-67雙染判讀（×20）Fig.1 The interpretation of p16/Ki-67 dual-staining（× 20）

1.3 統計學方法 診斷以活檢組織病理診斷為“金標準”，采用SPSS 22.0及Meta-DiSc1.4軟件進行統計學分析，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。以敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值來評價HR-HPV、CB及p16/Ki-67雙染的篩查、分流應用效果。

2 結果

2.1 LSIL組病例進行p16/Ki-67雙染分析判讀染色特征 LSIL組細胞p16/Ki-67雙染會呈現以下兩種情況：p16胞質淡黃色或淺棕色，Ki-67核不染色；p16胞質淡黃色或淺棕色，Ki-67核顯示淺紅色顆粒狀。

2.2 CB、HR-HPV及p16/Ki-67雙染三種篩查方法在ASC-US和LSIL中的診斷價值比較 明確LSIL的p16/Ki-67雙染表達模式后，在LSIL組對比不同篩查方法的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值結果見表1、圖2。

表1 LSIL組中HR-HPV、CB和p16/Ki-67雙染結果比較Tab.1 Comparisonof HR-HPV，CB and p16/Ki-67 dual-staining in LSIL group

在ASC-US組進一步分析p16/Ki-67雙染結合CB的分流，對比不同篩查方法的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值結果見表2、圖2。

圖2 LSIL和ASC-US組中三種篩查方法ROC曲線下面積Fig.2 The area under the ROC curve of the threescreening methods in the LSIL and ASC-US group

表2 ASC-US組中HR-HPV、CB和p16/Ki-67雙染結果比較Tab.2 Comparisonof HR-HPV，CB and p16/Ki-67 dual-staining in ASC-US group

按照30歲進行年齡分層，LSIL組及ASC-US組中HR-HPV、CB和p16/Ki-67雙染結果比較見表3、4。

表3 LSIL組中HR-HPV、CB和p16/Ki-67雙染結果比較Tab.3 Comparisonof HR-HPV，CB and p16/Ki-67 dual-staining in LSIL group

表4 ASC-US組中HR-HPV、CB和p16/Ki-67雙染結果比較Tab.4 Comparison of HR-HPV，CB and p16/Ki-67 dual-staining in ASC-US group

3 討論

HR-HPV聯合TCT檢測被廣泛應用于宮頸癌初篩中，有效提高了敏感性［4］，由于假陽性、假陰性或一過性感染等原因，兩者的敏感度或特異度均不能滿足目前篩查子宮頸癌工作的需求，較早發現并成功阻斷HR-HPV持續性感染是預防CIN或子宮頸癌的關鍵。HPV是一種雙鏈閉環的DNA病毒，基因組包括E6和E7兩個主要致癌基因，分別結合機體抑癌基因p53和pRb蛋白并使其降解和失活，發生免疫逃逸，一旦E6和E7蛋白與p53和pRb親和力較大，病毒在機體持續感染，就會增加致癌風險。HPV病毒的免疫逃逸機制包括蛋白轉錄、抗原遞呈調節、細胞因子調節以及信號通路方面調節等［5-6］。針對以上免疫逃逸機制，目前除了HPV疫苗成為子宮頸癌預防和治療較有效的方法外，尚無較滿意的預測HPV感染的生物學標記［7］。因此，進一步選擇特異度和敏感度均較高的篩查方式是目前的工作重點。ASC-US在TCT篩查結果中僅次于NILM，是目前子宮頸癌篩查領域分層管理、減少不必要活檢及避免過度治療的重點關注領域。ASC-US并HPV陽性者推薦陰道鏡活檢，陰道鏡活檢是有創檢查，尤其對于年齡＜30歲或者孕期女性，易導致不必要的過度憂慮。單獨檢測HR-HPV易造成＞10%的宮頸癌漏診（尤其是腺癌）［8］。CB是一種評估子宮頸樣本的重要診斷工具，滿意的CB制備難度較大，成為影響病理醫師診斷準確性的主要因素［9］。前期研究［10］探討了一種數控標準化（numerical control standardized，NCS）技術用于子宮頸CB的制備，效果可靠、穩定，在獲取細胞量較少的標本類型尤其有優勢，但成本偏高，不易在基層病理推廣應用。本研究經反復實驗總結出一套CB制備流程，制備好的CB細胞集中均勻分布、成本低。FANNY等［11］研究指出，標準化制備的CB聯合p16/Ki-67雙染等其他生物學標記較TCT診斷準確性更好，可代替宮頸活檢對LSIL的進展進行分類。本研究采用CB聯合p16/Ki-67雙染作為篩查方法，在年齡＜30歲組中ASC-US具有較高的敏感度（97%）和特異度（100%），可作為較有效的生物學檢測指標替代活檢，降低有創檢查比例，結論與其相符。本研究在TCT診斷LSIL病例中CB和p16/Ki-67雙染比HR-HPV檢測具有更好的敏感度（90.8%）和特異度（100%），建議使用兩者進行分流。但本研究側重探討TCT診斷為LSIL的p16/Ki-67雙染判讀，降低ASC-US占比，而不是大多數關于診斷HSIL的雙染研究［12］。

p16/Ki-67雙染是近年來備受關注的免疫細胞化學，p16蛋白是細胞周期依賴性激酶抑制劑，對細胞增殖和分裂起負調節作用，是受同細胞周期調控密切相關的轉錄活化因子E2F蛋白（E2F transcription factors）活化的下游靶基因，感染子宮頸上皮細胞的HR-HPV的E7蛋白能與pRb蛋白結合并誘導后者降解或失活，致使pRb-E2F復合物中的E2F解離為游離狀態，故使其下游的靶基因p16表達上調。以上機制反映出，p16表達上調表明HPV E6和E7癌基因整合到了宿主子宮頸上皮細胞，并促進子宮頸病變的進一步發展，最終導致子宮頸癌變，其陽性表達可早于子宮頸細胞學形態出現變化之前［13］。ZHANG等［14］提出p16在與HPV感染相關的惡性腫瘤中如食管癌、口腔癌、宮頸癌等呈高表達，p16表達與CIN級別具有顯著一致性。Ki-67是增殖性細胞核抗原，可作為細胞增殖標志物，在p16/Ki-67雙染中，隨著子宮頸CIN病變程度的進展其表達也相應增高。正常循環細胞內或者細胞周期仍在正常調控中時p16和Ki-67相互排斥不能同時表達，而雙染陽性提示HPV感染導致細胞周期調節失常［15］，并且成為區分潛在HSIL的客觀依據［12，16］。以上各項研究表明，NILM、LSIL 及HSIL均可出現p16/Ki-67雙染陽性表達，隨著病變級別升高，雙染陽性率占比增加，似乎與上述雙染陽性表達機制相悖，而且有研究［12］認為HSIL雙染檢測僅依據染色結果不依賴于細胞形態特征，可直接根據雙染表達情況來判讀。但上述NILM和LSIL也可出現雙染陽性表達情況，本研究認為p16/Ki-67雙染需要結合細胞形態學綜合判讀，尤其在ASC-US和LSIL中。

綜上所述，細胞學和HR-HPV檢測提高了子宮頸癌篩查的敏感性，但同時增加了陰道鏡轉診數量。p16/Ki-67雙染細胞學檢查，無論單獨還是與其他篩查方法相結合，都可以作為HPV陽性婦女陰道鏡檢查的一種敏感而有效的檢查方法［17-18］。CB技術在子宮頸癌篩查文獻中雖報道較少，但文獻顯示CB技術對比細胞學在陽性檢出率上具有獨特優勢，尤其CB在聯合p16/Ki-67雙染能夠彌補TCT中主觀因素導致的漏診及誤診，具有較高的敏感度和特異度，對于細胞量少的標本具有顯著的優勢，可進一步完善子宮頸癌篩查分流管理，降低陰道鏡轉診率，是一種可靠的子宮頸癌前病變聯合篩查方式，具有極其重要的應用及推廣價值［1，19］。除了以上各種篩查方法，2016 年針對HPV16和HPV18的二價疫苗被中國食品藥品監督管理局（CFDA）推出并批準用于9～ 45歲人群［20］。近年研究［21］顯示，人工智能細胞學輔助閱片系統使子宮頸TCT對ASC-US和LSIL具有更高的敏感性，提高工作效率和診斷準確率。趙涌等［22-23］認為，HPV E6/E7 mRNA篩查細胞學診斷為ASC-US、LSIL和不除外高度病變的不典型鱗狀上皮細胞（atypical squamous cells cannot exclude high grade intraepithelial lesion，ASC-H）的患者效能優于雜交捕獲法檢測13種HR-HPV，為宮頸癌篩查的分流提供了思路。研究［24］顯示，EB病毒（epstein-barrvirus，EBV）和HPV通過表觀遺傳調控與各種惡性腫瘤密切相關。研究統計，約有60%的宮頸癌患者癌組織存在EBV感染［25］。據此推斷子宮頸癌可能是HPV和EBV協同感染作用的結果。

本研究旨在探究創傷性小的、可取代活檢的檢測方法來完成宮頸癌篩查，限于樣本數量，后續仍需更多的數據來支持和驗證本研究結果。通過本研究采用的聯合篩查方法，隨訪部分患者術后3～6個月TCT結果為NILM。綜上，下一步結合人工智能細胞學輔助閱片系統進一步探討更加精準的篩查方法，同時提高HPV疫苗接種率，盡早實現人類消除子宮頸癌的戰略目標。