新疆野生中國美味蘑菇的遺傳多樣性分析

羅 影，賈培松，努爾孜亞·亞力買買提，祁顥萱，趙振豪，賈文捷

(1.新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；2.新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830091；3.新疆農業大學科學技術學院，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】中國美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)隸屬于真菌門、擔子菌亞門(Basidiomycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，傘菌目(Agaricales)，蘑菇科(Agaricaceae)，蘑菇屬(Agaricus)[1]。王卓仁等[2]從形態學和系統發育學，命名為中國美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)。其屬于中亞地區特有種，主要生長在內陸湖泊沿岸，蘆葦腐殖質豐富的沙灘上，子實體碩大。分析中國美味蘑菇野生資源開展種質資源評價和遺傳多樣性，對于中國美味蘑菇新品種選育、種質資源保護與開發利用等具有重要意義。【前人研究進展】ISSR可以直接從DNA水平上檢測DNA多態性，擴增條帶清晰、多態性強、重復性好，是目前在分析和評估生物種群的遺傳多樣性中使用最廣泛的分子標記之一[3]，木耳[4-6]、草菇[7]、灰樹花[8]、白靈菇[9]、香菇[10-12]等均有多校性評價文獻。【本研究切入點】對中國美味蘑菇的研究，主要從其形態描述、生境調查[13,14]、營養成分分析[15-18]及馴化栽培[19-22]進行了研究。目前尚未有應用ISSR分子標記對中國美味蘑菇進行遺傳多樣性分析的報道。亟需分析新疆野生中國美味蘑菇的遺傳多樣性。【擬解決的關鍵問題】采用生物學培養特征與ISSR分子標記相結合的方法，對從新疆博斯騰湖周邊采集的20個野生中國美味蘑菇菌株進行遺傳多樣性分析，為保護開發中國美味蘑菇種質資源及新品種選育等提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

20個野生中國美味蘑菇子實體均采集于新疆博湖縣，菌株保藏于新疆農業農業科學院植物保護研究所。

1.2 方 法

1.2.1 菌絲活化與菌絲體收集

將菌種接種到PDA平板上，25℃下避光培養20 d左右活化。活化后，取菌絲尖端再接于PDA平板，培養基表面鋪一層玻璃紙。固體培養的菌絲體，用滅菌的接種刮沿著玻璃紙的表面將菌絲體輕輕刮下，置稱量紙上，天平稱量備用。

1.2.2 菌株生物學培養特征測定

將活化的20個中國美味蘑菇供試菌株，打孔器分別打取活化后適齡菌種菌落邊緣作接種塊，接種至PDA培養基中央，每個菌株5個重復，25℃避光培養。定期觀察菌株生長情況，觀察指標有：菌絲顏色、菌落邊緣形態、菌絲濃密度等4項菌絲培養特征指標，菌絲生長速度采用“十”字交叉法測量計算菌落直徑。

1.2.3 DNA提取

對采集的菌絲體進行干燥處理，取一部分干燥子實體，采用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取總DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量和濃度。

1.2.4 ITS序列測定

采用通用引物 ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和 ITS4：TCCTCCGCTTATTGGATATGC，(由生工生物工程股份有限公司合成)進行PCR擴增。PCR反應體系25 μL：引物(10 μmol/L各1.0 μL、模板1.0 μL，2×TaqPCR MasterMix12.5 μL無菌雙蒸水補足至25 μL。PCR擴增程序：94℃預變性4 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環，72℃修復延伸10 min。PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將PCR產物交于生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結果提交至NCBI核酸數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，進行BLAST比對分析。選取同源性較高的序列進行系統進化分析，利用MEGA 6.0軟件首先進行多重序列比對，再采用Neighbour-joining法構建系統發育樹，進行1 000次Bootstrap自舉法檢驗。

將測序結果在NCBI上進行BLAST，選取同源性較高的序列及現有文獻報道的序列，以口蘑科口蘑屬松茸 (TricholomamatsutakeEU294302.1) 的ITS為外群，與采集的20個野生中國美味蘑菇樣本一起，用MEGA 6.0中Neighbor-joining 法(Maximum likehood Bootstrap trials=1 000)，構建系統發育樹。

1.2.5 ISSR-PCR擴增與聚類分析

通過引物篩選實驗[23,24]從42個引物[25,26]中篩選出15個引物，擴增結果多態性較高，且擴增出豐富的多態性位點。篩選出引物進行ISSR-PCR擴增，所用引物及擴增程序參考李輝平[3]和朱堅[26]方法，由上海生工生物有限公司合成。

擴增反應體系25 μL，其中2×TaqPCR MasterMix12.5 μL，引物(0.2 mmol/L)1 μL，模板1 μL，用ddH2O補齊至25 μL。擴增體系：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環；72℃補平10 min。將擴增產物5 μL，點樣于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測ISSR擴增結果。表1

1.3 數據處理

將ISSR-PCR 的電泳結果人工比對校正，有條帶記為1，無條帶記為0，構建初始“0/1”矩陣表。統計條帶總數及多態性條帶數并計算多態位點百分率P，公式為：P=k/n(100%)，式中：P為多態位點百分率，k為多態性位點數，n為測定的位點總數。

使用NTSYSpc分析軟件對所獲數據進行聚類分析，生成遺傳聚類圖，分析聚供試野生中國美味蘑菇菌株間的遺傳多樣性及遺傳分化特征。

表1 供試ISSR引物的序列

圖1 不同中國美味蘑菇菌株的菌絲形態

2 結果與分析

2.1 野生中國美味蘑菇菌株菌絲培養特征比較

研究表明，各菌株菌絲生長速度、菌絲長勢及是否形成原基上均有明顯差異，其中菌株BK039、BK042菌絲生長最快，平均生長速度分別為1.46、1.44 mm/d；菌株BK052菌絲生長最慢，平均生長速度為0.22 mm/d。易形成原基的菌株有BK36、BK40、BK52、BK72。表2

根據菌絲形態、菌絲濃密度及是否形成原基等，將20個中國美味蘑菇菌株劃分為4個組群。第1組群：氣生菌絲濃密，菌落邊緣菌絲濃白，不易形成原基，包括BK01、BK03、BK08、BK10、BK30、BK50、BK51、BK73、BK74、BK75；第2組群：氣生菌絲一般，不易形成原基，包括BK38、BK39、BK42、BK49；第3組群：氣生菌絲一般，易形成原基，包括BK36、BK40、BK52、BK72；第4組群：菌絲稀疏，且不易形成原基，包括BK11、BK33。圖1

表2 中國美味蘑菇菌株的菌絲培養特征描述

2.2 野生中國美味蘑菇ITS分子鑒定

研究表明，中國美味蘑菇的ITS序列大小介于720～750 bp，采集的20株野生樣本Blast結果均為中國美味蘑菇，構建發育樹也聚為一簇，從分子水平上鑒定采集的樣本均為中國美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)。圖2

圖2 基于ITS序列的中國美味蘑菇的系統發育樹

2.3 野生中國美味蘑菇菌株的ISSR多態性分析

研究表明，實驗共選擇42個ISSR引物，其中有16個引物對供試的20個中國美味蘑菇菌株有很好的擴增效果，條帶清晰，重復性好。16個引物共擴增出206條較為清晰的DNA條帶，平均每個引物擴增出12.88條多態性條帶。平均多態性條帶頻率為83.46%，其中P1、P5、P22等3個引物多態性比率為100%，引物 P25多態性比率為 92.31%。供試菌株間的遺傳多態性較高。表3

表3 ISSR 引物的擴增結果及多態性

2.4 供試菌株的聚類

研究表明，20個供試中國美味蘑菇菌株間遺傳相似系數范圍在 0.60～0.91，在遺傳相似系數0.60水平上15個供試菌株分為2個類群，BK033和BK036與其他菌株區分開來，說明BK033和BK036與其他供試中國美味蘑菇之間的遺傳差異較大。當遺傳相似系數為0.80時，可分為8個類群，最大的類群包括12個菌株，占總數的60%，另有2個菌株成一個類群，其他菌株單獨成一個類群，博湖縣的中國美味蘑菇已經發生較為明顯的遺傳分化現象。當遺傳相似系數為0.91時，可分為17個類群，其中BK03和BK08、BK40和BK49、BK050和BK052兩兩為一類，這三組菌株之間親緣性較近；其他菌株各自為一類群，20個供試中國美味蘑菇菌株均采自博斯騰湖附近，具有豐富的遺傳多樣性。圖3

圖3 供試中國美味蘑菇菌株ISSR多態性的聚類

3 討 論

3.1中國美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)是2015年王卓仁等[2]從形態學和系統發育學進行研究命名的新種。在此之前主要對其生境[13,14]、子實體營養成分[15-18]、馴化栽培[19-22]及其生境微生物群落[27]進行了分析研究。

3.2ISSR標記是由Zietkiewi CZ等[28]創建的一種簡單重復序列間擴增多態性分子標記，直接從DNA水平上檢測基因多態性。

3.3在ISSR分析中，在遺傳相似系數為0.75時，將20個供試中國美味蘑菇菌株劃分為4個種群，但是與表觀形態學的分組不一致。在遺傳相似系數為0.80時，可劃分為8個類群，最大的類群包括12個菌株，占總數的60%，與表觀形態學分組略有差異，其又進一步將表觀形態學分組的第1組群進一步細化分組，20個供試中國美味蘑菇菌株雖然均采自博斯騰湖附近，但是各菌株間也具有豐富的遺傳多樣性。ISSR分子標記在木耳[4-6]、草菇[7]、灰樹花[8]、白靈菇[9]、香菇[10-12]等均有應用，ISSR標記在食用菌種植資源遺傳多樣性、親緣關系分析中應用是可信的。

4 結 論

采集于新疆博湖縣的20個樣本均為中國美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)。將20個樣本劃分為4個組群；16條ISSR引物共擴增出206條清晰的DNA條帶，多態性條帶176條，多態比率為83.50%。各菌株間遺傳相似系數范圍在 0.60～0.91，遺傳相似系數為0.80時，20個樣本分為8個類群。新疆博湖縣的中國美味蘑菇已開始發生遺傳分化，具有豐富的遺傳多樣性，有較好的馴化育種潛力。

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